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Artículo de método

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

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DOI:

10.3791/52484

⸱

17 de marzo de 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

En este artículo

Resumen

Existen muchos métodos diferentes para la medición de las vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometría de flujo (FCM). Varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Se presentan dos protocolos para vehículos eléctricos de medición, usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas.

Resumen

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

Introducción

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

Vehículos eléctricos, también conocidas como micropartículas, son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que están involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos 1. A través de la expresión de diversos marcadores de superficie y / o transferencia directa de material biológico, los vehículos eléctricos son capaces de alterar la función de las células receptoras para jugar ya sea activar o suprimir funciones en la comunicación intercelular 2-4. EVs Clínicamente, los derivados de las plaquetas se sabe que tienen una fuerte actividad anticoagulante 5, mientras que otros han demostrado que contribuyen a una amplia gama de condiciones, desde la promoción metasta tumorsis 6 a proteger contra la enfermedad 7. EVs se pueden clasificar en categorías más pequeñas de las vesículas derivadas de células tales como los exosomas y microvesículas (MVs), dependiendo de su tamaño y el mecanismo de la generación de 8. La nomenclatura de las subpoblaciones de vesículas derivadas de células sigue siendo un tema de debate en curso 8,9, sin embargo, los exosomas se describen generalmente como pequeñas, de 40 a 100 nm partículas derivadas de la fusión endosomal con la membrana plasmática, mientras que MVs son más grandes de 100 a 1000 partículas nm formadas por el desprendimiento de la membrana plasmática 10. Aquí, el término general "vehículos eléctricos" se utiliza para referirse a todos los tipos de vesículas biológicos extracelulares liberados por las células.

Aislamiento de los vehículos eléctricos de la sangre entera es un procedimiento multi-etapa y se han mostrado muchos diferentes variables de proceso para afectar el contenido EV, incluyendo la temperatura de almacenamiento y la duración 11,12, anticoagulante / conservante utilizado 13 ymétodo de centrifugación utilizado 14. Una necesidad de estandarización de estas variables ha llevado a las recomendaciones de la Sociedad Internacional de Trombosis y procesamiento de la sangre y de aislamiento EV procedimientos Hemostasia Comité Científico y Normalización (ISTH SSC) para su correcto 15,16, todavía no existe un consenso entre los investigadores sobre el protocolo óptimo para utilizar 12. La mayoría coincide, sin embargo, que las variables pre-analíticos muy controladas son cruciales para los datos exactos y reproducibles.

Para el análisis de los vehículos eléctricos, los investigadores han utilizado diversos métodos, incluyendo la microscopía electrónica de transmisión 17, microscopía electrónica de barrido 18,19, microscopía de fuerza atómica, luz dinámica de dispersión 20,21 y occidental blot 22,23. Mientras FCM es el método de elección para muchos investigadores 9,24 - 26 debido a sus capacidades de alto rendimiento, el análisis de los vehículos eléctricos utilizando FCM ha sidonotoriamente difícil debido a su tamaño y falta de poblaciones positivas discretos 27-32. En comparación con el análisis de las células, el pequeño tamaño de los EVs resultados en 1) menos fluorescencia emitida debido al menor número de antígenos por partícula y 2) la viabilidad limitada de lavado post-mancha, que es necesaria para reducir la fluorescencia de fondo. Los desafíos comunes entre los investigadores incluyen señales que surgen de agregados de inmunoglobulinas 27,28 y auto-agregación de anticuerpos 29. Además, los tiempos de procesamiento largos y largos procedimientos de lavado / aislamiento utilizados por muchos de los protocolos actuales 33,34 requieren compromisos de tiempo de varios días para analizar un pequeño número de muestras, haciendo que sea menos que ideal para aplicaciones de alto rendimiento. Algunos investigadores renuncian a un paso de lavado completo, haciendo controles negativos FCM utilizados tradicionalmente como menos fluorescencia uno (FMO) y isotipos de anticuerpos inútil para evaluar con precisión bacfluorescencia kground 30.

Nuestros protocolos abordan tres problemas comunes que pueden impedir el análisis FCM adecuado de los vehículos eléctricos: Las señales derivadas de los agregados de anticuerpos y otros no-vesículas, dificultad para eliminar el anticuerpo no unido, y la falta de poblaciones positivos perceptibles. Las técnicas descritas aquí serán ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, relación señal a ruido creciente, y el establecimiento de puertas de una manera racional que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. Dos métodos de detección diferentes se presentan aquí: el primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

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Protocolo

NOTA: Los siguientes protocolos se han realizado en cumplimiento de todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todas las muestras de sujetos humanos se pusieron a prueba en virtud de una junta de revisión institucional (IRB) protocolo -aprobado y con el consentimiento informado de los sujetos.

1. MÉTODO A: Individual Método de detección

1.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos

  1. Extraer la sangre del donante / paciente en dos tubos de 10 ml de vidrio que contenían 1,5 ml de ACD-Solución A u otro anticoagulante adecuado y proceso inmediatamente (dentro de 30 min max) utilizando el siguiente protocolo de centrifugación diferencial 2-paso.
    NOTA: Este protocolo producirá aproximadamente 10 ml de plasma pobre en plaquetas (PPP) de los combinados ~ 17 ml de sangre extraídas. Si se necesita más o menos PPP, el número de tubos de sangre recogida se puede ajustar en consecuencia.
  2. Centrifugar las muestras a 1500 xg durante 10 min a RTpara separar el plasma de la capa leucocitaria y glóbulos rojos. Transferir 1,2 ml alícuotas del sobrenadante de plasma a 1,5 ml tubos de centrífuga, teniendo cuidado de no molestar a las capas inferiores que contienen la capa leucocitaria y glóbulos rojos.
  3. Giran a 13.000 xg durante 10 min a TA para eliminar las plaquetas y fragmentos de células grandes. Transferir cuidadosamente el PPP, dejando atrás 200 l para evitar alterar el sedimento y añadir el PPP a un nuevo tubo.
  4. En este punto, utilice PPP inmediatamente para su análisis o transferencia en alícuotas de 1,0 ml a los nuevos tubos de centrífuga de 1,5 ml y se almacena a -80 ° C durante un máximo de dos años para su posterior análisis (consulte la Figura 1A para visión general).
  5. Si se necesitan EVs purificados para los experimentos funcionales, la transferencia de 6 ml de la PPP a un tubo de ultracentrífuga y añadir 28 ml de 0,2 micras filtrada-solución salina tamponada con fosfato (PBS). Centrifugado durante 60 minutos a 100.000 xg a temperatura ambiente utilizando una ultracentrífuga equipado con un rotor de cubeta oscilante. Aspirar el sobrenadante y resuspender EV peldejar en 1,5 ml de medio.
    NOTA: Para mayor reproducibilidad, las muestras de sangre deben ser procesadas manera más coherente posible de un donante a. Cualquier variación en el método de aislamiento EV podría afectar significativamente el número y tipo de vehículos eléctricos detectados.

1.2) La preparación de muestras para el análisis

NOTA: A partir de ahora, los pasos a hablarlo con un protocolo de alto rendimiento para el análisis de 12 muestras de 14 marcadores en 3 paneles. Sin embargo, otras combinaciones de anticuerpos pueden utilizarse aquí; el protocolo puede ser adaptado para estudiar otras poblaciones EV mediante la sustitución de los marcadores sugeridas para aquellos de interés.

  1. Retire 12 muestras del congelador (si se almacena a -80 ° C) y descongelar a 37 ° C.
  2. Contenido de la pipeta arriba y abajo varias veces para mezclar. Quite 320 l de cada muestra y añadir a la fila superior de una placa de 96 pocillos.
    NOTA: A multi-así pipeta de ancho ajustable es muy útil para esto y muchas otras medidas en todo el culoay, particularmente cuando el análisis de múltiples muestras a la vez.

1.3) Las muestras de tinción EV

  1. Antes de la tinción, filtrar todos los anticuerpos (Abs) para eliminar los agregados, lo que puede causar señales positivas.
    1. Combinar anticuerpos para ser utilizados en cada uno de los 3 paneles en 0,22 micras tubos de filtro centrífugas separadas y centrifugar utilizando una centrífuga de ángulo fijo de una sola velocidad (~ 750 xg) a TA durante 2 min o hasta que toda la mezcla de Ab ha pasado a través del filtro y no hay líquido anticuerpo permanece en la superficie del filtro. Tienda cócteles Ab en el refrigerador hasta por dos semanas, pero re-filtro cada vez antes de usar.
  2. Añadir la cantidad apropiada de mezcla Ab filtrada a cada pocillo en la fila 2 (por ejemplo, muestras en Panel I se tiñen con 2 l de cada Ab, por lo que se añadieron un total de 12 l de cóctel Ab filtrada por pozo a remar 2). Consulte la Figura 1B para un esquema del mapa placa sugerido. Repita estos adicións de las filas por debajo si se ejecutan más paneles (en este caso, añadir 8 l / pocillo de cóctel Grupo II a la fila 3 y 11 l / pocillo de cóctel Panel III a la fila 4, consulte Lista de Materiales para la información del panel específico).
  3. Usando la pipeta multicanal, mezclar las muestras de PPP en la fila 1 de arriba abajo y transferir 100 l de los pozos de la fila 1 a los pocillos de la fila 2. Mezcle arriba y hacia abajo. Cambie las puntas y la repetición, la transferencia de 100 l de la fila 1 a las filas 3 y 4. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos.

1.4) MT Lavado Muestras

  1. Retire la placa de 96 pocillos de 4 ° C y traslado al gabinete de seguridad biológica. Usando una pipeta multicanal, añadir 220 l de PBS / pocillo a las filas 6-8 (para ser utilizado para el enjuague / lavado de los pocillos que contienen manchado PPP).
  2. Transferir el contenido de cada pocillo para tubos de filtro centrífugas pre-etiquetados utilizando la pipeta multicanal ajustables en anchura (Para 12 muestras, con 3 paneles de anticuerpos, 12 x 3 = 36 tubos de filtroser necesario). Utilizando los mismos consejos, eliminar 200 l de PBS de las filas de lavado y añadir a los pocillos correspondientes de la que PPP se acaba de quitar.
  3. Mezclar arriba y hacia abajo para enjuagar los pozos y pasar la solución de enjuague para los mismos filtros a los que se añadió previamente el PPP. Cerrar las tapas de filtros de centrífuga. Cambie las puntas.
  4. Repita este proceso con las muestras teñidas restantes hasta que todas las muestras teñidas PPP se han transferido junto con sus soluciones de enjuague para filtros centrífugos.
  5. Transferir los filtros centrífugos a una centrífuga de rotor fijo y centrifugado a 850 xg durante 3 min a TA.
    NOTA: Asegúrese de que el líquido no se mantiene en la parte superior del filtro. Después de la centrifugación, el filtro debe aparecer ser "seca", sin capa de fluido visible que queda en la parte superior. Aunque es poco probable, ciertas muestras de PPP pueden requerir un tiempo de centrifugación más tiempo para moverse con eficacia a través del filtro.
  6. Retire los tubos de filtro centrífugas y volver a la cabina de seguridad biológica.Usando la pipeta multicanal, resuspender las partes superiores de los filtros en 300 l de PBS. Transferir el contenido resuspendidas a tubos pre-etiquetados para su análisis inmediato FCM.
    NOTA: Es muy importante para mantener la fuerza y ​​el número de depresiones émbolo pipeta consistentes entre muestras para evitar los cambios de muestra a muestra. Esta idealmente debería hacerse utilizando un pipeta electrónica que ha sido programado para pipetear arriba y abajo de un volumen específico (por ejemplo, 280 l) un número exacto de veces (por ejemplo, 8 veces) para cada muestra.

1.5) Configuración citómetro

  1. Abra el software FCM. Antes del experimento de configuración, realice la calibración del instrumento diariamente y configuración utilizando cuentas de configuración del instrumento (siguiendo las instrucciones del fabricante).
  2. Si las muestras EV se han teñido con más de un anticuerpo y múltiples fluorocromos se van a medir a la vez, calcular los valores de compensación como sigue:
    1. Añadir 2 gotas de cuentas de compensación de comprobar la valideztubos marcada con (1 tubo para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo) y añadir la cantidad recomendada de anticuerpo. Añadir 2 gotas de bolas de compensación negativos a otro tubo que se utiliza como control de compensación sin teñir.
    2. Incubar a 4 ° C durante 30 min, se lava con PBS y resuspender en 400 l de PBS.
    3. Utilizando el citómetro de flujo software incluido con el instrumento, ejecute cada tubo de compensación y ajustar los voltajes fluorescentes para colocar cada pico en aproximadamente 10 4 en una escala log-5 década. Asegúrese de que el pico de fluorescencia es más alta (más brillante) en su propio canal fluorescente en comparación con todos los demás canales, y ajustar los voltajes de los parámetros fluorescentes de nuevo si es necesario. Ejecutar cada tubo borrador manchado individualmente y capturar al menos 5000 eventos por tubo.
    4. Seleccione el "experimento", a continuación, seleccione la pestaña "Compensación", a continuación, seleccione "Calcular Compensación" para aplicar los valores de compensación para todas las muestras.
  3. Ajuste la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) parámetros de tensión a escala logarítmica y seleccione los umbrales más bajos permitidos por el citómetro (FSC = 200 y SSC = 200) para cada uno.
  4. Mientras se ejecuta un tubo de PBS 0,22 micras filtrada, ajustar los voltajes del FSC y SSC a los valores más altos que excluyen a la mayoría de ruido de fondo (es decir, justo por debajo del umbral de la tensión a la que la tasa de eventos supera 5 eventos / seg).
  5. A continuación, ejecute un tubo que contiene 0,2 m - 1,0 m perlas, diluidos en PBS si es necesario. En una FCS frente a SSC parcela, dibuja una puerta alrededor de la población de perlas para capturar eventos entre 0,2 micras y 1,0 micras. Por otra parte, en un histograma SSC-H, dibuja una puerta para incluir todos los eventos más pequeños que los 1,0 micras cuentas.
  6. Ajuste del caudal del citómetro de "Lo" (aproximadamente 8-12 l / min). Usando el tubo de perlas (u otro tubo que contiene una concentración conocida de perlas) ajustar el dial de velocidad de flujo en el citómetro hasta la vísperatasa nt alcanza aproximadamente 200 eventos / seg. Leer todos los tubos de la muestra a la misma velocidad de flujo y el uso de la misma concentración del grano en experimentos futuros para garantizar que los caudales se mantienen consistentes entre las corridas.
  7. Ejecutar un tubo de partículas fluorescentes arco iris diluidos en PBS. Adquirir 5000 eventos. Registre los valores medios de intensidad para FSC, SSC, y cada canal de color. Utilice estos valores para ajustar los voltajes en los experimentos futuros para asegurar que la intensidad de fluorescencia se mantienen consistentes entre los experimentos.

1.6) Ejemplo de Lectura

  1. Establecer velocidad de flujo del citómetro a "Lo" (aproximadamente 8-12 l / min) y ejecutar cada muestra durante exactamente 1 o 2 min.
  2. Después de la primera lectura, añadir 20 l de 10% de NP-40 a cada muestra, la pipeta arriba y abajo, y volver a leer por la misma cantidad de tiempo (ya sea 1 o 2 min) para permitir la sustracción de eventos positivos detectados en la muestra lisada sobre un marco de tiempo igual.
    NOTA: Es muy importante que las muestras se mezclaron usando una pipeta en lugar de un vórtice. En nuestra experiencia, vórtice puede causar auto-agregación de algunos anticuerpos, lo que lleva a los acontecimientos positivos EV-imitando.
  3. Una vez que todas las muestras han sido leídos, exportar todos los archivos .fcs en un archivo independiente que se utilizará para su posterior análisis utilizando el software de análisis FCM.

1.7) Análisis de Datos

  1. Abra el software de análisis de FCM. Importar todos los archivos .fcs en un archivo nuevo experimento.
  2. Abra la cuentas de sólo tubo. En la FSC-A vs SSC-Una parcela, dibuja una puerta alrededor de todas las cuentas de tamaño entre 0,2 micras y 1,0 micras. Esta es la puerta EV. Arrastre para añadir a todas las muestras.
  3. Utilizando las muestras lisadas como controles negativos, dibujar puertas en el borde de la fluorescencia de fondo en cada canal de fluorescencia utilizado. Arrastre puertas fluorescentes en la puerta EV de cada correspondiente muestra no lisadas.
    NOTA: En este punto también es útil examinar parcelas de parámetros bi fluorescentes duales. Formas Rocket enel cuadrante de doble positivo (véase la Figura 8), en particular si se conocen los marcadores para residir en tipos de células no relacionadas, puede ser indicativo de artefacto de agregación o otros eventos de vesículas imitando.
  4. Para cada marcador fluorescente, restar el número de eventos de la muestra zadas por el número de eventos de la muestra no lisadas. Opcionalmente, se divide este número por el número total de vehículos eléctricos dentro de la puerta no lisadas EV para obtener valores positivos%.

2. FORMA B: Método de Cuentas

2.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos

  1. Consulte el método de procesamiento de sangre descrita en el Método A (Sección 1.1).

2.2) Preparación de muestras para el análisis

  1. Si lo desea, fraccionar PPP o EVs ultracentrifugó en exosomas y microvesículas. Añadir 250 l de PPP o EVs ultracentrifugó a 0,22 micras filtros centrífugos y transferir a una centrífuga rotor fijo y giran a 750 xg durante 2 min a TA.
    NOTA: Asegúrese de que el líquido no se mantiene en la parte superior del filtro. Después de la centrifugación, el filtro debe aparecer ser "seca", sin capa de fluido visible que queda en la parte superior. Aunque es poco probable, ciertas muestras pueden requerir un tiempo de centrifugación ligeramente más largo para que el fluido se mueva de manera efectiva a través del filtro.
  2. Lavar sin recubrimiento 6 micras perlas de poliestireno (por ejemplo, cuentas negativas ABC) 2 veces con medio RPMI y volver a suspender en 2 ml. Añadir 6,000 perlas a cada tubo de FACS. Para el tubo de control negativo, añadir 400 l de medio RPMI solo a las perlas. Para el resto de los tubos, añadir 200 l de PPP o EVs ultracentrifugó (o sus fracciones) y 200 l de medio RPMI.
  3. Ajustar el volumen final de todos los tubos de 400 l con los medios de comunicación y se incuba durante la noche a 4 ° C en un agitador.
  4. A la mañana siguiente, lavar los granos con 2 ml de medios de comunicación. Aspirar el sobrenadante.
  5. Bloque con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en los medios (400 l) durante 3 horas a 4 y# 176; C en un agitador.
  6. Lavar perlas con 2 ml de medios de comunicación. Aspirar y volver a suspender el sedimento en 100 l de medio.

2.3) Las muestras de tinción EV

  1. Filtra todos los anticuerpos. Usa los mismos paneles de anticuerpos utilizados en el Método A, o si se desea, crear una combinación diferente de anticuerpos siempre y cuando sus fluorocromos son compatibles uno con el otro.
  2. Combinar todos los anticuerpos que se utilizarán en un único panel en un tubo de filtro de centrífuga 0,22 micras. Centrifugar el uso de un ángulo fijo de centrífuga de una sola velocidad durante 2 min o hasta que toda la mezcla de Ab ha pasado a través del filtro y el líquido no anticuerpo permanece en la superficie del filtro.
  3. Añadir volumen apropiado de cóctel de anticuerpos se filtró a todos los tubos y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
  4. Lavar perlas con 2 ml de medio, resuspender en 400 l de los medios de comunicación y ejecutar inmediatamente (o dentro del mismo día) en citómetro de flujo.

2.4) citómetro de configuración y la Muestra de Lectura

  1. Abra el software FCM. Antes del experimento de configuración, realice la calibración del instrumento diariamente y configuración utilizando cuentas de configuración del instrumento (siguiendo las instrucciones del fabricante).
  2. Si las muestras EV se han teñido con más de un anticuerpo y múltiples fluorocromos se van a medir a la vez, calcular los valores de compensación como sigue:
    1. Añadir 2 gotas de cuentas de compensación para tubos pre-etiquetados (1 tubo para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo) y agregue la cantidad recomendada de anticuerpo. Añadir 2 gotas de bolas de compensación negativos a otro tubo que se utiliza como control de compensación sin teñir. Incubar a 4 ° C durante 30 min, se lava con PBS y resuspender en 400 l de PBS.
    2. Usando el software FCM, ejecute cada tubo de compensación y ajustar los voltajes fluorescentes para colocar cada pico en aproximadamente 10 4 en una escala log-5 década. Asegúrese de que el pico de fluorescencia es más alto (el más brillante) en su propio canal fluorescente en comparación con todos los demás canales, yajustar las tensiones de los parámetros fluorescentes de nuevo si es necesario. Ejecutar cada tubo borrador manchado individualmente y capturar al menos 5000 eventos por tubo.
    3. Seleccione la pestaña "Experimento", luego "Compensación", luego "Calcular Compensación" para aplicar los valores de compensación para todas las muestras.
  3. Cambie el FSC y parámetros de tensión SSC a escala logarítmica y seleccione los umbrales más bajos permitidos por el citómetro (FSC = 200 y SSC = 200) para cada uno.
  4. Muestras Ejecutar, puerta sobre la población cuentas singlete y adquieren 2.000 eventos en esta puerta. Exportar archivos .fcs.
  5. Utilice el software de análisis FCM para analizar .fcs archivos. Puerta en cuentas singlete. Calcular la intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) para cada fluorocromo y comparar con el MFI del control negativo.

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Resultados

La Figura 1 describe el esquema general de procesamiento para el aislamiento y la detección de los vehículos eléctricos utilizando el método basado en perlas o método de detección individual. Detección individual de los vehículos eléctricos utilizando FCM trabaja bien para el análisis de los vehículos eléctricos más grandes, pero la mayoría de citómetros no son capaces de detectar individualmente partículas tan pequeñas como exosomas. Un enfoque basado en perlas permite pequeños vehículos eléctric...

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Discusión

Se presentaron dos protocolos diferentes para el aislamiento, tratamiento y análisis de EVs, utilizando ya sea un individuo o de detección de enfoque basado en perlas. Al seleccionar el método más apropiado utilizar no siempre es sencillo y requiere una comprensión de la muestra a analizar, así como las subpoblaciones individuales de interés. Además, la sensibilidad de la citómetro utilizado para la adquisición se debe considerar al elegir el método más apropiado. A menudo no existe una única mejor protocolo de usar, má...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses a revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Dale Hirschkorn de Sistemas de Sangre del Instituto de Investigación por su ayuda con citómetro de flujo ajustes del instrumento. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones HL095470 y HL072268 U01 y contratos del Departamento de Defensa W81XWH-10-1-0023 y W81XWH-2-0028.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Citómetro de flujo de sobremesa LSR IIBD Biosciences3 láseres (20 mW Coherent Sapphire 488 nm azul, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violeta y 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rojo)
FACS Diva software BD BiosciencesPC versión 6.0
Software FlowJo Treestar USMac versión 9.6.1 o PC versión 7.6.5
Sphero Rainbow partículas fluorescentesBD Biosciences556298utiliza para ajustar todos los voltajes de los canales para mantener la consistencia de la intensidad de la fluorescencia 
Partículas fluorescentes Ultra Rainbow SpherotechURFP-10-5se utiliza además de las perlas de SSC Megamix-Plus para garantizar la consistencia de la compuerta EV de un lote a otro
Las perlas de SSC Megmix-PlusBiocytex7803se utilizan para ajustar los voltajes de FSC y SSC para mantener la consistencia entre ejecuciones. También se puede utilizar para controlar el caudal y el dial de caudal ajustado con el fin de garantizar que se utilice el mismo caudal en todas las corridas
AbC Anti-Mouse Bead KitTechnologiesA-10344utilizado para controles de compensación y perlas de AbC negativas utilizadas para el método basado en perlas
Alternativa Nonidet P-40 (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz  SC-281108Se utiliza en el método de detección individual solo para lisar muestras después de la lectura inicial para su uso como controles negativos. El caldo puede diluirse a 1:10 en PBS y almacenarse en el refrigerador hasta por 1 mes.
Tubos BD TruCOUNT BDBiosciences340334utilizan siempre que se necesiten concentraciones absolutas de EV
Ultrafree-MC, GV 0.22 y micro; m Unidades de filtro centrífugoMillipore UFC30GVNButiliza para lavar los EV después de las manchas y/o fraccionar los EV en función del tamaño
Tubos de sangre entera de vidrio Vacutainer ACD-ABD Biosciences364606
Tubos Facs 12x75 poliestirenoBD Biosciences352058
50 ml Depósitos envueltos individualmente PhenixRR-50-1s
Green-Pak - 10 µ lRaininGP-L10S
Green-Pak puntas de pipeta -200 y micro; l RaininGP-L250S
Verde -Pak puntas de pipeta - 1.000 y micro; l RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 puntas preesterilizadasRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Canales LTS  Ajustable  Espaciador RaininLA8-300XLS Placas de cultivo de
E& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Media (sin Hepes)Instalación de cultivo celular de UCSFCCFAE001medios utilizados para el método de detección basado en perlas
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 y micro; mPlanta de cultivo celular UCSFCCFAL003
Tubo de ultracentrífuga, de pared delgada, ultratransparenteBECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 µ l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 y micro; l
CD16 V450BD Biociencias5604742 y micro; l
CD28 FITCbiolegend3029062 y micro; l
CD152 APCBD Biociencias5558552 y micro; l
CD19 A700Biolegend3022262 y micro; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 y micro; l
CD62L APCBiolegend3048102 y micro; l
CD108 PE BD Biociencias5528302 y micro; l
CD235a FITCbiolegend3491042 y micro; l
PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 y micro; l
CD62p APCBiolegend3049102 y micro; l
CD66b PE Biolegend3051062 y micro; l
CD15 FITCexalphaX1496M5 y micro; l
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κBiolegend400230
Life Puntas de pipeta tejidos de 96 pocillos filtrada 344058

Referencias

  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
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