Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Summary

Existen muchos métodos diferentes para la medición de las vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometría de flujo (FCM). Varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Se presentan dos protocolos para vehículos eléctricos de medición, usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas.

Abstract

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.

Introduction

Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser consid....

Protocol

NOTA: Los siguientes protocolos se han realizado en cumplimiento de todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todas las muestras de sujetos humanos se pusieron a prueba en virtud de una junta de revisión institucional (IRB) protocolo -aprobado y con el consentimiento informado de los sujetos.

1. MÉTODO A: Individual Método de detección

1.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos

1. Extraer la sangre del donante / paciente en dos tubos de 10 ml de vidrio que contenían 1,5 ml de ACD-Solución A u otro anticoagulante adecuado ....

Results

La Figura 1 describe el esquema general de procesamiento para el aislamiento y la detección de los vehículos eléctricos utilizando el método basado en perlas o método de detección individual. Detección individual de los vehículos eléctricos utilizando FCM trabaja bien para el análisis de los vehículos eléctricos más grandes, pero la mayoría de citómetros no son capaces de detectar individualmente partículas tan pequeñas como exosomas. Un enfoque basado en perlas permite pequeños vehículos eléctricos a d.......

Discussion

Se presentaron dos protocolos diferentes para el aislamiento, tratamiento y análisis de EVs, utilizando ya sea un individuo o de detección de enfoque basado en perlas. Al seleccionar el método más apropiado utilizar no siempre es sencillo y requiere una comprensión de la muestra a analizar, así como las subpoblaciones individuales de interés. Además, la sensibilidad de la citómetro utilizado para la adquisición se debe considerar al elegir el método más apropiado. A menudo no existe una única mejor protocolo de usar, má.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citómetro de flujo de sobremesa LSR II	BD Biosciences		3 láseres (20 mW Coherent Sapphire 488 nm azul, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violeta y 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rojo)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC versión 6.0
Software FlowJo	Treestar US		Mac versión 9.6.1 o PC versión 7.6.5
Sphero Rainbow partículas fluorescentes	BD Biosciences	556298	utiliza para ajustar todos los voltajes de los canales para mantener la consistencia de la intensidad de la fluorescencia
Partículas fluorescentes Ultra Rainbow	Spherotech	URFP-10-5	se utiliza además de las perlas de SSC Megamix-Plus para garantizar la consistencia de la compuerta EV de un lote a otro
Las perlas de SSC Megmix-Plus	Biocytex	7803	se utilizan para ajustar los voltajes de FSC y SSC para mantener la consistencia entre ejecuciones. También se puede utilizar para controlar el caudal y el dial de caudal ajustado con el fin de garantizar que se utilice el mismo caudal en todas las corridas
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Technologies	A-10344	utilizado para controles de compensación y perlas de AbC negativas utilizadas para el método basado en perlas
Alternativa Nonidet P-40 (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	SC-281108	Se utiliza en el método de detección individual solo para lisar muestras después de la lectura inicial para su uso como controles negativos. El caldo puede diluirse a 1:10 en PBS y almacenarse en el refrigerador hasta por 1 mes.
Tubos BD TruCOUNT BD	Biosciences	340334	utilizan siempre que se necesiten concentraciones absolutas de EV
Ultrafree-MC, GV 0.22 y micro; m Unidades de filtro centrífugo	Millipore	UFC30GVNB	utiliza para lavar los EV después de las manchas y/o fraccionar los EV en función del tamaño
Tubos de sangre entera de vidrio Vacutainer ACD-A	BD Biosciences	364606
Tubos Facs 12x75 poliestireno	BD Biosciences	352058
50 ml Depósitos envueltos individualmente	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak - 10 µ l	Rainin	GP-L10S
Green-Pak puntas de pipeta -200 y micro; l	Rainin	GP-L250S
Verde -Pak puntas de pipeta - 1.000 y micro; l	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 puntas preesterilizadas	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Canales LTS  Ajustable  Espaciador	Rainin	LA8-300XLS Placas de cultivo de
	E& K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (sin Hepes)	Instalación de cultivo celular de UCSF	CCFAE001	medios utilizados para el método de detección basado en perlas
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 y micro; m	Planta de cultivo celular UCSF	CCFAL003
Tubo de ultracentrífuga, de pared delgada, ultratransparente	BECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µ l
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 y micro; l
CD16 V450	BD Biociencias	560474	2 y micro; l
CD28 FITC	biolegend	302906	2 y micro; l
CD152 APC	BD Biociencias	555855	2 y micro; l
CD19 A700	Biolegend	302226	2 y micro; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 y micro; l
CD62L APC	Biolegend	304810	2 y micro; l
CD108 PE	BD Biociencias	552830	2 y micro; l
CD235a FITC	biolegend	349104	2 y micro; l
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 y micro; l
CD62p APC	Biolegend	304910	2 y micro; l
CD66b PE	Biolegend	305106	2 y micro; l
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 y micro; l
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230