Artículo de método

La manipulación y

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DOI:

10.3791/52496

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9 de febrero de 2015

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

En este artículo

Resumen

Describimos métodos de manipulación de ovocitos inmaduros de Xenopus laevis, maduración in vitro de ovocitos a óvulos e inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite la degradación de algunas proteínas maternas y la sobreexpresión de genes de interés en la fertilización, por lo que es valioso para estudiar el papel de factores específicos en el desarrollo embrionario temprano.

Resumen

Los huevos de anfibios han sido ampliamente utilizados para estudiar el desarrollo embrionario. El desarrollo embrionario temprano es impulsado por factores almacenados por la madre acumulados durante la ovogénesis. Con el fin de estudiar el papel de estos factores maternos en el desarrollo embrionario temprano, es deseable manipular sus funciones desde el comienzo mismo del desarrollo embrionario. Las formas convencionales de interferencia génica se logran mediante la inyección de oligonucleótidos antisentido (oligos) o ARNm en óvulos fertilizados, lo que permite la subexpresión o sobreexpresión de proteínas específicas, respectivamente. Sin embargo, estos métodos normalmente requieren más de varias horas antes de que la expresión de la proteína se vea afectada y, por lo tanto, la interferencia de las funciones de los genes no es efectiva durante las primeras etapas embrionarias. Aquí, presentamos un sistema experimental en el que los niveles de expresión de proteínas maternas pueden ser alterados antes de la fertilización. Los ovocitos de Xenopus laevis obtenidos de los ovarios se defoliculan mediante incubación con enzimas. Los oligonucleótidos antisentido o ARNm se inyectan en ovocitos desfoliculados en la etapa de vesícula germinal (GV). Estos ovocitos maduran in vitro hasta convertirse en óvulos en la etapa de metafase II (MII), seguida de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). De esta manera, hasta el 10% de los embriones de ICSI pueden alcanzar la etapa de renacuajo nadador, lo que permite realizar pruebas funcionales de knockdown o sobreexpresión de genes específicos. Este enfoque puede ser una forma útil de estudiar el papel de los factores almacenados por la madre en el desarrollo embrionario temprano.

Introducción

Xenopus laevis es un ampliamente utilizado, poderoso organismo modelo para estudiar el desarrollo 1. Esto es porque los huevos de Xenopus son inusualmente grande (aproximadamente 1.2 a 1.4 mm, en comparación con sus homólogos de mamíferos ser aproximadamente 0,1 mm) y abundante. Los huevos contienen maternalmente sintetizadas y almacenadas componentes, que son suficientes para impulsar el desarrollo embrionario hasta la transición a mediados de blástula (MBT, que se producen en la etapa de 8-8,5 con 4.000-8.000 células). MBT es acompañada por la activación del genoma cigóticos, que entonces produce productos de genes embrionarios que dirigen el desarrollo adicional.

Numerosos estudios dirigidos a identificar los factores maternos importantes para el desarrollo. Muchos estudios se basan en la inyección de oligonucleótidos antisentido (oligos) incluyendo oligonucleótidos morfolino en embriones fertilizados, en los que la degradación caso de las proteínas maternas se puede observar en la etapa de gástrula 2-4. Alternativamente, los ARNm se inyectan a em fertilizadobryos que perturban las funciones de genes o para rastrear destinos de proteínas sobreexpresados. Sin embargo, la inyección en los embriones en estadio de una célula que normalmente no afecta a los niveles de expresión de proteínas materna en las primeras etapas embrionarias antes de MBT.

Heasman y Wylie establecieron el método de transferencia de acogida para superar este problema 5. En su método, los ovocitos desfolicularon manualmente son inyectados con oligonucleótidos antisentido y se transfirieron a hembras de acogida 6. Las proteínas están regulados a la baja antes de la fertilización para que funciones de las proteínas downregulated en el desarrollo embrionario temprano pueden ser examinados. Este método agotamiento de la madre llevó a la identificación de varias funciones de desarrollo únicas de proteínas maternas, tal como fue revisado en 7.

En este informe, detallamos nuestro método recientemente desarrollado, en el que se alcanza el agotamiento materno o sobreexpresión de ARNm antes de la fertilización sin defolliculation manual y transferencia de acogida8. Defolliculation manual requiere una gran cantidad de tiempo y de transferencia de acogida a menudo necesita técnicas de expertos y la licencia específica para la cirugía animal, lo que dificulta el uso frecuente de método de agotamiento de la madre. Defolliculation y transferencia de acogida son sustituidos por defolliculation enzimática 9,10 y la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) 11-13, respectivamente. ICSI a los huevos se utilizó originalmente para producir ranas transgénicos 12. Esperma y embriones de núcleos también fueron trasplantadas en in vitro de ovocitos de anfibios madurado 11,14,15. Aquí, mostramos nuestro método paso a paso para inyectar espermatozoides ovocitos madurados in vitro que fueron pre-inyectados con oligonucleótidos antisentido o ARNm.

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos con ranas se realizó siguiendo los requerimientos del Ministerio del Interior británico.

1. Preparación de oocitos de Xenopus laevis

  1. Aproximadamente una semana antes de la recolección de los ovocitos, inyectar ranas femeninas con 150 U de yegua preñada de gonadotropina sérica (PMSG) para pre-cebado utilizando 1 ml jeringa estéril con una aguja de 27 G. La inyección se realiza por vía subcutánea en saco linfático dorsal.
    NOTA: Es óptimo utilizar ranas que no ponen huevos durante mucho tiempo (por lo menos más de la mitad de año) o que nunca han puesto huevos antes.
  2. Tienda ranas pre-ceba en un tanque de agua regulado a 18 ° C en la sala de control de luz (07 a.m.-7 p.m.: on, 7 p.m.-07 a.m.: off).
  3. En el día de la recogida de ovocitos, preparar 1 l de 1x modificados Solución de Barth (MBS) de 10x MBS de stock de diluir con agua destilada dos veces (ddH 2 O), y añadir penicilina y estreptomicina a la concentración final de 10 mg / mlcada uno (MBS + PS). 10x MBS Stock consta de NaCl 880 mM, KCl 10 mM, 24 mM de NaHCO3, 8,2 mM MgSO 4 .7H 2 O, 3,3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, 4,1 mM CaCl 2 .6H 2 O, 100 mM HEPES, pH 7,5.
  4. Anestesiar una rana pre-cebado por inyección subcutánea de 120 mg (en 400 l) de metanosulfonato de tricaína (MS222). Mantenga la rana inyectado en un pequeño tanque con agua.
  5. Después de 10 minutos, comprobar la rana anestesiado por haberle dado la vuelta ya con éxito ranas anestesiados no responden a este. Si la anestesia es incompleta, añadir hielo en el tanque y esperar a que otro 10 min.
  6. Recoge la rana desde el pequeño tanque y colocar en decúbito dorsal en un húmedo del paño.
  7. Con unas pinzas y unas pequeñas tijeras quirúrgicas, pellizcar la piel y hacer una pequeña incisión (2 cm) en la parte inferior del abdomen, lateral a la línea media. Haz otra incisión en el otro lado.
  8. Después de cortar la piel, levantar el wi capa muscularfórceps º y hacer la incisión en la capa muscular.
  9. Observe el ovario después se corta la capa muscular y tire el ovario hacia fuera de las incisiones utilizando fórceps.
  10. Transferencia extrajo ovario a un tubo de 50 ml con solución de MBS.
    NOTA: Trata de recoger la mayor cantidad posible de ovario dos incisiones.
  11. Masacre la rana hembra por desangrado, seguido de congelación para su posterior eliminación.
  12. Enjuague el ovario se extrae varias veces con MBS + PS hasta que la sangre se elimina por lavado. A continuación, transferir el ovario a una placa de Petri de 9 cm que contiene MBS + PS
    NOTA: Compruebe la calidad de los ovocitos en un microscopio de disección en este punto. Si ovocitos son aparentemente mala calidad, tales como ovocitos con pigmentación desigual en el medio de los animales (Figura 1A), no procesar aún más y en lugar de obtener una nueva ovario. Idealmente, los oocitos deben tener hemisferios animales igualmente pigmentadas y ser aproximadamente de igual tamaño.
  13. Se burlan de ovario en trozos pequeños(1-2 cm 2) y recoger 5 ml de ovocitos en un nuevo tubo de 50 ml.
  14. Enjuague 5 ml de ovario desgarrado un par de veces con MBS + PS y añadir MBS + PS a 15 ml.
  15. Añadir 7 unidades de la enzima para defolliculation a la suspensión de ovario (ver Lista de Materiales).
    NOTA: Reconstituir enzima liofilizado con 10 ml de ddH 2 O (28 unidades / ml). Colocar el vial durante 30 min en hielo con agitación suave ocasional. Alícuota de 250 l y almacenar a -80 ° C hasta su uso.
  16. Incubar la pieza de ovario con la enzima durante 1 hora con agitación suave en el agitador (velocidad a la 15 REV / min, equivalente a aproximadamente 0.014 xg).
    NOTA: Para la eliminación casi completa de las células del folículo, 2 horas a 2 horas 15 minutos de incubación con normalmente se necesita la enzima. Se necesita más tiempo de incubación para la transferencia nuclear de ovocitos experimento 16.
  17. Después de 1 h de incubación, recoger un pequeño número de ovocitos tratados (10-20 ovocitos) y la transferencia a un plato de 6 cm de Petri que contiene MBS + PS Compruebe el extent de defolliculation bajo un microscopio de disección. Si ovocitos se separan uno de otro y al menos parcialmente desfolicularon (Figura 1B), proceder inmediatamente a la siguiente reacción de parada (paso 18). Si ovocitos son todavía muy rodeados de células del folículo, se incuba durante 15 min extra al máximo.
  18. Añadir un montón de MBS + PS para detener la reacción y descartar el sobrenadante. Repita el lavado durante 10 veces.
    NOTA: Añadir MBS + PS vertiendo a la pared de un tubo de 50 ml, pero no directamente a los ovocitos. Después de la suspensión en MBS + PS, pequeñas ovocitos inmaduros tienden a flotar en la parte superior de tampón de lavado y desechar dichos ovocitos flotantes pequeños.
  19. Después de los lavados, la transferencia a una placa de Petri de 9 cm que contiene MBS + PS
    NOTA: A partir de este paso adelante, mantener ovocitos en 16-18 ° C tanto como sea posible. Esto puede hacerse manteniendo el plato que contiene ovocitos en un escenario de temperatura controlada.
  20. Seleccione la etapa VI ovocitos según la clasificación de Dumontpara usos posteriores y la transferencia a un nuevo 9 cm placa de Petri que contiene MBS + transferencia de ovocitos PS se puede hacer mediante el uso de una pipeta de vidrio con un tamaño de la punta adecuada (más grande que el tamaño de los ovocitos).
    NOTA: los ovocitos de buena calidad debe tener un hemisferio animales uniformemente pigmentada con un claro contraste entre el hemisferio animal y el hemisferio vegetal, y ser aproximadamente del mismo tamaño (Figura 1C). Escenario VI ovocitos representan ovocitos que puedan responder a la progesterona totalmente desarrollados (diámetro de los ovocitos es aproximadamente 1.2 hasta 1.4 mm).

2. La inyección de oligonucleótidos antisentido o ARNm en oocitos

NOTA: Todos los pasos de esta sección se deben hacer en 16 a 18 ° C en una platina del microscopio equipado con circulación de agua de temperatura controlada o en una caja de plástico llena de hielo.

  1. Transferencia 200-300 ovocitos seleccionados en una nueva placa de Petri de 9 cm lleno de MBS + PS, en el que se realizará la microinyección.
    NOTA: En each condición, se utilizan normalmente 200-300 oocitos. En total, aproximadamente 1.000 ovocitos se utilizan en un experimento.
  2. Para la preparación de la inyección de oligonucleótidos antisentido o ARNm, expulse el émbolo de metal de un microinyector.
  3. Llene un capilar de vidrio con aceite mineral utilizando jeringa e inserte el capilar de vidrio lleno de aceite al pistón de metal de microinyector.
    NOTA: Un capilar de vidrio se tira por el extractor micropipeta. Estas agujas se mantienen en una caja sin dañar consejos.
  4. Cortar la punta de la aguja utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas en el microscopio y el objetivo como Punta de diámetro pequeño para la inyección posible.
    NOTA: La aguja de punta puede afilarse mediante el uso de un micro forja o micropipeta biselador. Para inclinar la aguja en un ángulo de 25 ° mejora la capacidad de penetrar la pared de ovocitos.
  5. Coloque una pequeña tira de Parafilm en el escenario de un microscopio de disección y dispensar una caída de 3 l de la oligo antisentido o solución ARNm.
  6. Mueva el tip de la aguja de inyección en la pequeña gota de la solución y llenar la aguja con la solución a inyectar.
    NOTA: Si la punta de la aguja de inyección es demasiado pequeño, burbujas de aire deben aparecer en la punta del émbolo de metal. Luego, haga una propina más grande en la aguja de la inyección hasta que esto no suceda.
  7. Marque la aguja de inyección de aproximadamente 0,5 mm de distancia de la punta. Esta marca se utiliza como un indicador de la profundidad de inyección.
  8. Inserte la punta de la aguja en un ovocito lo largo del límite ecuatorial apuntando al punto central del ovocito (debajo de la vesícula germinal) mientras sostiene suavemente el lado opuesto del ovocito hasta el punto de la inyección con una pinza para impedir el movimiento de los ovocitos no deseable durante la inyección .
    NOTA: Encuentra el área libre de células del folículo (Figura 1 B) e inserte la aguja de ese lugar ya que incluso una aguja fina no puede penetrar a menudo una capa de células foliculares.
  9. Expulsar 4,6 ng / nl 4.6 o 9.2 ng / 9,2 nl de antisoligos entido, o un volumen apropiado de ARNm (250 pg a 13,8 ng) utilizando el conmutador de pedal. Los detalles de la preparación de oligo antisentido se describen en 7.
  10. La transferencia de los ovocitos inyectados en un plato de 6 cm Petri llena de MBS + PS suplementado con 0,1% de BSA (medio de incubación de ovocitos y esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,45 micras de poro).
  11. Incubar los ovocitos en 16 ° C o 18 ° C durante 1-2 días.
    NOTA: inyectado ovocitos pueden ser sometidos a maduración in vitro varias horas después de la inyección, en cuyo caso la inyección de 4,6 ng oligos antisentido es preferible. Una regla general es que cuanto más corto es el período de incubación, mejor será el posterior desarrollo embrionario.

3. Maduración In Vitro (IVM) de ovocitos

  1. En la noche de la maduración de ovocitos experimento, ir a buscar solución progesterona madre (30 mM en etanol) de -80 ° C congelador y disolver precipitados en tem habitacióntura con vórtice ocasional.
    NOTA: La progesterona valores normalmente se deja a temperatura ambiente durante 30 min a 1 hr.
  2. Añadir 5 l de la acción de la progesterona en 50 ml de MBS + PS (medio de maduración, la concentración final de la progesterona en 3 M) y agitar en el agitador durante 30 min a distribuir la progesterona en la solución de la misma manera.
  3. Preparar placas de 6 cm de agarosa recubiertos para vitro tratamiento de maduración en.
    1. Añadir 1 g de agarosa a 50 ml de 1x MBS sin magnesio y calcio.
    2. Disolver agarosa por calentamiento en un horno de microondas.
    3. Verter un pequeño volumen de la solución de agarosa para placas de 6 cm para cubrir el fondo de platos.
    4. Espere por lo menos durante 30 minutos hasta que la solidificación.
    NOTA: recubrimiento de agarosa evita la fusión de los ovocitos a los platos. Una vez en ovocitos madurados in vitro están estrechamente unidos a los platos, lo más probable es que los oocitos se activarán por los estímulos que reciben durante el desprendimiento de dishes.
  4. Vierta 5-8 ml de medio de maduración a los platos de agarosa-coated y transferir 200-300 ovocitos en cada placas de 6 cm.
    NOTA: Trate de transferir ovocitos con una cantidad mínima de medio de incubación de los ovocitos.
  5. Incubar durante 16 horas a 16 ° C.
    NOTA: Por ejemplo, iniciar el tratamiento a las 5 pm y terminar a las 9 de la mañana del día siguiente.

4. inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)

  1. Esperma congelado Stock preparación
    NOTA: La siguiente preparación de los espermatozoides se debe hacer antes de empezar la maduración de ovocitos experimento, y las existencias de esperma congelado se mantiene a -80 ° C para la ICSI.
    1. Recoge los testículos de una rana macho siguiendo los pasos 1.4 a 1.11, excepto para tirar la grasa y los testículos hacia fuera de las incisiones utilizando fórceps y extracción de los testículos de la grasa.
    2. Lavar los testículos en 1x Ringers de Marc Modificado (MMR, NaCl 100 mM, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,4).
    3. Retire una grasad vasos sanguíneos por rodar los testículos lavados en un pañuelo de papel limpio y luego eliminando los vasos sanguíneos restantes utilizando fórceps.
    4. Coloque cada testículo en un plato de 3,5 cm de Petri que contiene 1 ml de 1x MMR.
    5. Cortar longitudinalmente con tijeras finas, y romper en pequeños trozos con pinzas hasta que no haya piezas grandes se mantienen.
    6. Pipeta hacia arriba y abajo usando la punta 1 ml de plástico cuyo extremo está cortado, y la carga 1 ml de la solución de los testículos aplastados en un homogeneizador de vidrio.
    7. Homogeneizar ellos por 2-3 golpes y luego se vierte la solución sobre un filtro de poros de 50 micras unido a la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 ml. Deje que la solución pase por el filtro.
    8. Repita el paso 4.1.7 resuspendiendo el testículo restante cortado en 1 ml de 1x MMR. Finalmente, lavar el homogeneizador un par de veces con 1x MMR y pasarlo por el filtro.
    9. Repita los pasos 4.1.5 al 4.1.8 para el otro testículo y piscina dos testículos en un 15 ml tubo de centrífuga.
    10. Haga girar las células a 800 xga 46; C durante 20 min.
    11. Desechar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 2 ml de 1x MMR. A continuación, transferir a un tubo nuevo.
      NOTA: Asegúrese de que no hay glóbulos visibles están presentes.
    12. Preparar un gradiente de paso en un tubo de centrífuga ultra-claro 14 ml. Capa inferior: 4 ml de 30% iodixanol. Segunda capa inferior: 1 ml de 20% iodixanol. Tercera capa inferior: 5 ml de 12% iodixanol. Capa superior: testículo células en 2 ml de 1x MMR. Superposición de los gradientes muy suavemente con una punta de pipeta de 1 ml (superponer lentamente de no perturbar la fase inferior).
      NOTA: Sólo una capa de 30% iodixanol debería funcionar también para aislar los espermatozoides solamente.
    13. Giro en el rotor SW40 usando ultracentrifugación a 10.000 xga 4 ° C durante 15 minutos (desaceleración sin interrupción).
    14. Retire con cuidado el tubo de la ultracentrifugación. Confirmar una interfaz entre cada capa del gradiente y el sedimento en la parte inferior.
    15. Recoge la fracción de espermatozoides a partir del sedimento.
    16. Resuspender el pel espermadejar en 1x MMR para lavado de iodixanol. Centrifugado a 800 xg a 4 ° C durante 20 min.
      NOTA: Si una gran cantidad de esperma aún permanecen en la suspensión después de la vuelta, volver a girar el sobrenadante a 3.220 xg a 4 ° C durante 20 minutos y poner en común los espermatozoides peletizado.
    17. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de esperma en 1 ml de 1x Nuclear Preparación Buffer (NPB; 250 mM de sacarosa, 0,5 mM espermidina trihidrocloruro, 0,2 mM espermina tetrahidrocloruro, EDTA 1 mM, 15 mM HEPES, pH 7,7) 13. A continuación, traslado a un tubo Eppendorf.
    18. Añadir 50 l de 10 mg / ml de solución de digitonina en 1x NPB (polvo Resuspender digitonina en DMSO a 50 mg / ml y congelar alícuotas a -80 ° C. Antes de su uso, diluir la 50 mg / ml de alícuota de 10 mg / ml con 1x NPB. No utilizado 10 mg / ml digitonina puede ser congelado y almacenado a -20 ° C y re-utilizado) a 1 ml de la solución de esperma.
    19. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    20. Disponibilidad de una tasa de permeabilización mediante tinción con DAPI (0,3 g / ml DAPI como una final de concentración). Si menos del 95% de las células se permeabilized, incubar un poco más.
      NOTA: A veces, si demasiadas células de esperma se incuban al mismo tiempo (especialmente cuando el esperma se recogen a partir de múltiples testículos), es difícil para permeabilizar, en cuyo caso puede ser necesario añadir una pequeña cantidad adicional de digitonina; por ejemplo, si el 20% de los espermatozoides no se permeabilizan, se añade un 20 l adicional de digitonina.
    21. Detener la permeabilización mediante la adición de 10% de BSA a una concentración final del 3%.
    22. Haga girar las células a 4 ° C.
      NOTA: Pruebe la menor velocidad de centrifugación como sea posible, comenzando con 100 g durante 5 min. Si no es suficiente, aumentar la velocidad y / o tiempo.
    23. Lavar las células con 0,3% de BSA en 1x NPB y centrifugar a la misma velocidad que en el paso 4.1.22. Mientras tanto, preparar el esperma Almacenamiento Buffer (SSB; 2 ml de 2x NPB, 120 l de BSA al 10%, 1,2 ml en autoclave glicerol, 680 l de H 2 O).
    24. Añadir 500 l de SSB a los espermatozoidessedimentar. Pipeta varias veces arriba y abajo para volver a suspender con una punta de corte con el fin de no dañar las células.
    25. Permitir que se equilibre la noche a 4 ° C.
    26. Pipetear las células arriba y abajo varias veces con una punta de corte.
    27. Diluir un par de veces en 10 microlitros 1x MMR o en 1x PBS para contar las células utilizando un hemocitómetro.
    28. Congele como alícuotas a 30.000 espermatozoides / l (o superior) directamente a -80 ° C y se almacena a -80 ° C en una sola alícuotas de uso.
  2. ICSI de ovocitos madurados in vitro
    NOTA: Todos los procesos que implican ovocitos se deben hacer a 16-18 ° C.
    1. Preparar una pipeta de vidrio para la transferencia de ovocitos madurados.
      NOTA: La pipeta de vidrio tiene que ser lo suficientemente amplia como para dar cabida a los ovocitos sin apretar.
    2. Dieciséis horas después de ovocitos en movimiento al medio que contiene progesterona, la transferencia de ovocitos madurados en una placa de agarosa recubiertas de 6 cm lleno de MBS + PS para el lavado.
      NOTA: Es importante destacar que, movocitos atured tienen que ser tratados con sumo cuidado. Rough tratamiento de ovocitos puede inducir la activación espontánea antes de la inyección de esperma.
    3. Cuente ovocitos madurados al confirmar la aparición de manchas blancas, lo que implica la ruptura de la vesícula germinal (Figura 2). Si la tasa de maduración es inferior al 80%, es poco probable para obtener el número suficiente de sobrevivir embriones para otros análisis.
      NOTA: El resto de las células del folículo se pelan después de la maduración de ovocitos (Figura 2).
    4. Ovocitos de transferencia de MBS de lavado a una nueva placa de 6 cm de agarosa recubiertas de llenado con medio de inyección (Preparar 500 ml: 30 g de Ficoll (6%), 20 ml de 10x MMR y 500 l de 1,000x PS Stock).
    5. Incubar al menos durante 30 min antes de iniciar ICSI.
    6. Configure el microinyector como se describe en los pasos 2.2 a 2.4.
      NOTA: El tamaño de la punta de la aguja de inyección se mantiene tan pequeño como sea posible siguiendo el procedimiento descrito en el paso 2.6. El diámetrode la aguja es de 20-40 micras. Para inclinar la punta de la aguja como se describe en el paso 2.4 podría permitir la inyección eficiente.
    7. Obtener la alícuota de esperma y diluir la suspensión de esperma de esperma en tampón de dilución (SDB; 250 mM de sacarosa, 75 mM KCl, 0,5 mM espermidina, espermina 0,2 mM, 200 mM HEPES pH 7,5).
      NOTA: La dilución se puede variar dependiendo de un tamaño de la aguja y así sucesivamente. Diluir 120 veces de los 30.000 espermatozoides / Stock l como un intento inicial y ajustar aún más si es necesario.
    8. Coloque una pequeña tira de Parafilm en el escenario de un microscopio de disección. Mezclar la solución inyección de esperma mediante pipeteo y dispensar unos pocos gota l de la solución de esperma.
    9. Suck la suspensión de esperma diluido en la aguja, inyectar 4,6 nl en 10 gotas sucesivas que contienen 0,3 mg / ml DAPI en un portaobjetos de microscopio, y contar rápidamente el número de espermatozoides entregado por inyección en un microscopio fluorescente.
      NOTA: Apunte 1-2 espermatozoides por inyección. Si es necesario, se diluye la solución de la inyección de esperma másy compruebe el número de espermatozoides por inyección de nuevo hasta lograr una concentración deseada.
    10. Expulsar la solución inyectable de prueba y llenar una nueva solución de inyección de esperma con una concentración adecuada.
    11. Inyectar 4,6 nl de solución de esperma para 100 ovocitos madurados.
      NOTA: Es importante para inyectar continuamente la solución. En primer lugar determinar el tiempo requerido para la expulsión de 4,6 nl (normalmente 1-2 segundos). Repetir el siguiente proceso; inyectar en un ovocito, espere unos segundos, retire la aguja y se burlan de la inyección en solución inyectable, espere unos segundos, inyectar en un ovocito. Esta inyección continua también evita el bloqueo de la punta de la aguja. Alternativamente, el método que utiliza una bomba 13 podría ser utilizado.
    12. Después de aproximadamente 100 inyecciones, expulsan la solución esperma restante y volver a llenar la solución de espermatozoides (usar la misma solución de espermatozoides, pero pipeta arriba y hacia abajo antes de la dispensación).
      NOTA: Si la aguja no succiona bien solución esperma, cortó la punta de la necesidadle. Si esto no mejora la situación, preparar una nueva aguja.
    13. Repetir el proceso de inyección hasta que se inyectan todos los oocitos.
      NOTA: Si la calidad de los ovocitos es bueno y la inyección se realiza correctamente, la contracción de los ovocitos inyectados se ve dentro de 20 minutos de tiempo de inyección.
    14. Mueva los platos inyectados a 16 ° C o 18   ° C incubadora.
    15. 4-5 horas después de la inyección, compruebe la tasa de división de embriones ICSI.
      NOTA: surcos de escisión de los embriones pueden no ser tan claras como las de los embriones fecundados normales. Algunos embriones también muestran divisiones anormales, que pueden ser causados ​​por la inyección de esperma múltiple.
    16. Embriones Transferencia de embriones escindidos incluyendo anormalmente escindidos a medio de incubación (Preparar 500 ml: 20 g de Ficoll (4%), 5 ml de 10x MMR y 500 l de 1.000 x PS de valores).
    17. Incubar los embriones ya sea en 16   ° C o 18 ° C incubadora durante la noche.
    18. A la mañana siguiente, embry transferenciaos a MMR 0,1x y contar sobrevivir embriones.
    19. En promedio, aproximadamente el 10% de los ovocitos inyectados con espermatozoides puede desarrollarse a la etapa de natación renacuajo (Figura 3A).

Resultados

El desarrollo embrionario de embriones ICSI utilizando en ovocitos madurados in vitro fue examinado (Figura 3A). Tasas de maduración de ovocitos GV a la etapa MII son variables y dependen en gran medida de la calidad de los ovocitos. En los buenos experimentos, casi el 100% de los ovocitos GV responder a la progesterona y muestran signos de maduración de ovocitos, finalmente convertirse huevos en la etapa MII. Todos los ovocitos madurados fueron sometidos a ICSI y aproximadamente 25% de los huevos inyectados escindidos (Figura 3A, n = 13 para el control revueltos ovocitos oligo-inyectado y n = 7 para no ovocitos oligo-inyectada). Aproximadamente el 60% o 80% de los embriones escindidos, producidos a partir de ovocitos inyectados con oligo de control o de ovocitos no inyectada, respectivamente, alcanzaron la etapa de blástula / gástrula. Entre los embriones blástula / gástrula, aproximadamente la mitad de los embriones en las muestras de oligo-inyectado eran de buena calidad (casi no hay signos de división anormal y apoptosis), mientras que el 82% de los embriones blástula / gástrula eran de buena calidad nmuestras inyectadas en (Figura 3A). Finalmente, 41% y 11% de los embriones escindidos en muestras de oligo-inyectada llegaron a la respuesta muscular y las etapas de natación renacuajo, respectivamente, mientras que el 60% y el 29% de los embriones escindidos en muestras no inyectados hicieron (Figura 3A). Estos embriones ICSI son la mezcla de los embriones normales y anormales (Figura 3B). Algunos de ellos sufren metamorfosis y desarrollar a madurar ranas 8. Estos resultados sugieren que la inyección de oligonucleótidos antisentido en oocitos GV, seguido de IVM y ICSI, permite el desarrollo embrionario temprano eficiente. Aunque la inyección de sí mismo oligos antisentido disminuye el desarrollo embrionario, todavía somos capaces de obtener suficientes embriones para muchos propósitos experimentales como la comprobación de las tasas de desarrollo, RT-PCR, western blot y así sucesivamente.

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Higo Ure 1: Ejemplos típicos de Xenopus laevis ovocitos de buena calidad o mala calidad de los experimentos in vitro de maduración. (A) Un ejemplo de ovocitos de mala calidad. Por ejemplo, los ovocitos que muestran la pigmentación irregular no se utilizan para experimentos posteriores. Cada oocito de Xenopus laevis es de aproximadamente 1/2 a 1/4 mm de diámetro. (B) un ovocito parcialmente desfolicularon. La mitad derecha del ovocito está cubierto por las células del folículo, que se pueden discernir por la presencia de vasos sanguíneos. Una flecha muestra un área libre de células del folículo y en la que se inyecta la aguja de inyección. (C) Un ejemplo de ovocitos de buena calidad, que son de igual tamaño y muestran hemisferios animales uniformemente pigmentados con un claro contraste entre el hemisferio animal y el hemisferio vegetal.

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Figura 2:. Oocitos de Xenopus laevis antes y después de la maduración Después de la maduración de ovocitos, manchas blancas claros aparecen en la parte superior de los hemisferios animales y las células del folículo se pelan. Cada oocito de Xenopus laevis es de aproximadamente 1 mm de diámetro.

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Figura 3: Desarrollo de embriones ICSI, producidos a partir de ovocitos madurados in vitro. (A) Desarrollo de embriones ICSI a cada etapa se resume. Los oocitos fueron inyectados con control mezclado oligonucleótidos antisentido (oligo de inyección de control) o sin inyección (no inyección), seguido de IVM y ICSI. El número correspondiente de embriones en cada etapa se muestra por encima de las barras. Media ± SEM se muestra. N = 4-13 experimentos independientes / diferente females. (B) Ejemplos de sobrevivir embriones ICSI. Estos embriones tailbud etapa fueron producidos en un experimento, en el que se utilizaron aproximadamente 200 ovocitos como material de partida.

Discusión

Nos detalle aquí un nuevo método para agotar factores maternos o para sobreexpresar factores exógenos antes de la fertilización. Este sistema requiere dos microinyecciones, pero en su lugar se salta de la cirugía de las ranas, utilizado en el método de transferencia de 7,17 host. Es óptimo para eliminar el paso de la cirugía rana en términos de cuidado de los animales. Por otra parte, no tenemos que tener en cuenta para la calidad de las ranas hembra de acogida para los experimentos de transferencia, lo que significa que podemos deshacernos de un factor biológico que afecta el éxito de los experimentos. Por lo tanto en este sistema la calidad de los ovocitos obtenidos de ranas cebados con PMSG es un factor biológico importante que es la clave para experimentos exitosos. La calidad de los ovocitos puede ser juzgado después de la recogida de ovario o después defolliculation. Si se observa alguna anomalía en estas etapas, es óptimo para recoger otro ovario de una nueva rana. Otro punto en el que se puede comprobar la calidad de los ovocitos es después de la maduración de ovocitos. Si es menos de 80% de progesteronaovocitos e tratados muestran signos de maduración, es posible que no pueda obtener el número suficiente de embriones para otros análisis. El uso de defolliculation enzimática en lugar de defolliculation manual es también otra ventaja de utilizar este sistema para reducir la mano de obra requerida para defolliculation. Sin embargo, todavía es posible que defolliculation manual puede dar un mejor desarrollo que el tratamiento enzimático.

Como se muestra en la Figura 3, casi 10% de los ovocitos madurados in vitro se puede llegar a la etapa de natación renacuajo. Estos datos se recogen de 13 experimentos independientes, incluyendo los reportados en 8 y nuevos experimentos de inyección. Método de transferencia Host necesita 75-150 ovocitos en cada tratamiento para obtener datos significativos desde 30 a 60% de los ovocitos transferidos puede llegar a la etapa neurula 17. Nuestro método normalmente se inicia con 200 a 300 ovocitos en cada grupo experimental ya que aproximadamente el 40-60% de los embriones escindidos puede llegar a laetapa respuesta muscular. Estos datos sugieren que ambos métodos apoyan una tasa de desarrollo razonable. Hasta ahora hemos obtenido 10 ranas vivas de control de mRNA inyectado y control antisentido ovocitos oligo-inyectado utilizando esta técnica, lo que indica que este enfoque apoya el desarrollo a través de la metamorfosis.

Nuestro método de manipulación-ICSI de ovocitos ofrece la oportunidad de probar el papel de los factores maternos durante el desarrollo embrionario temprano, poco después de la fertilización. Además, la sobreexpresión de factores de modificación de la cromatina antes de la fertilización puede hacer posible para remodelar la cromatina materna antes de la fertilización para la comprensión de los estados de la cromatina materna necesario para el desarrollo. Esta estrategia también puede trabajar bien con los sistemas de edición gen de actualidad como la transcripción del tipo activador de efector nucleasa (TALEN) 18,19 y CRISPR / CAS9 20,21 ya que éstos pueden expresarse incluso antes de la fertilización. Por lo tanto, nuestro nuevo enfoque tiene un potential que debe utilizarse para muchas aplicaciones en el futuro.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estamos agradecidos a los miembros del laboratorio Gurdon por su útil discusión. K.M. es investigador en Wolfson College y cuenta con el apoyo de la beca postdoctoral Herchel Smith y la Fundación Sasakawa de Gran Bretaña. El laboratorio de Gurdon cuenta con el apoyo de subvenciones del Wellcome Trust (RG69899) y el MRC a J.B.G.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) MSD Animal HealthVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu polvo y disolvente para solución inyectable
Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (MS222)SigmaA5040Para anestesia
Liberase TM Grado de investigaciónRoche05 401 127 001Para la defoliculación de ovocitos. Almacene a -20  °C.
Drummond NanojectDrummond Scientific Company3-000-205/206por microinyección
 Laboratorios Alpha7" Drummond #3-000-203-G/XLmicroinyección
 Instrumento SUTTER ModeloD-97Para microinyección
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500Para maduración <>em in vitro
de centrífuga ultra claro ICSI 14 ml Beckman Coulter Reino Unido Ltd344060Para la purificación de esperma
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)SigmaD1556Para la purificación de esperma
DigitoninSigmaD141Reactivo de permeabilización celular
ShakerHybaid HB-SHK-1Para la desfoliculación de ovocitos
Microscopio de disección (Microscopio estereoscópico con zoom)ZEISSSemi SV6Para la recogida y microinyección de ovocitos
50 μ filtro de poros mCellTrics04-0042-2317Para la purificación de esperma
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima L-100XPPara la purificación de esperma
Tubo de centrífuga de 50 mlCellstar Greiner Bio-One227261 o 210261Recolección de ovocitos y reacción de desfoliculación
centrífuga de 15 mlFALCON352097Para la purificación de esperma
Petri de 90 mm plato Thermo Scientific101VR20/C
Plato de cultivo celular de fácil agarre, 60  x  Plato353004
, 35  x  FALCON de 15 mm351008
Para capilar de vidrio para extractor de micropipetas de y tubo tubo de de cultivo celular FALCON de fácil agarre de 15 mm

Referencias

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