A continuación, presentamos un protocolo para inyectar medios de contraste de microburbujas de ultrasonidos en la vida, aislados finales de la gestación de embriones murinos etapa. Este método permite el estudio de los parámetros de perfusión y de marcadores moleculares vasculares dentro del embrión utilizando imágenes de ultrasonido de alta frecuencia con contraste.
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Artículo de método
Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido
En este artículo
Resumen
Resumen
Las imágenes con contraste por ultrasonido pueden transmitir información cuantitativa esencial sobre la vascularización y la perfusión de los tejidos y, en aplicaciones específicas, facilitar la detección y medición de biomarcadores vasculares a nivel molecular. Dentro del embrión de ratón, esta técnica no invasiva se puede utilizar para descubrir los mecanismos básicos que subyacen al desarrollo vascular en el sistema circulatorio temprano del ratón y en modelos genéticos de enfermedad cardiovascular. El embrión de ratón también se presenta como un modelo excelente para estudiar la adhesión de las microburbujas a las dianas angiogénicas (incluido el receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) o αvβ 3) y para evaluar la naturaleza cuantitativa de la ecografía molecular. Por lo tanto, desarrollamos un método para introducir agentes de contraste ultrasónicos en la vasculatura de embriones vivos aislados. Esto permite libertad en términos de control y posicionamiento de la inyección, reproducibilidad del plano de imagen sin obstrucciones ni movimiento, y análisis y cuantificación de imágenes simplificados. En la etapa gestacional tardía (día embrionario (E)16.6 y E17.5) se aislaron embriones murinos del útero, se exteriorizaron suavemente del saco vitelino y se inyectaron agentes de contraste de microburbujas en las venas accesibles en la superficie coriónica del disco placentario. A continuación, se emplearon imágenes de ultrasonido con contraste no lineal para recopilar una serie de parámetros básicos de perfusión (realce del pico, tasa de lavado y tiempo hasta el pico) y cuantificar la unión de microburbujas dirigidas en un modelo de ratón endoglina. Mostramos la circulación exitosa de microburbujas dentro de embriones vivos y la utilidad de este enfoque en la caracterización de la vasculatura embrionaria y el comportamiento de las microburbujas.
Introducción
La ecografía con contraste hace uso de agentes de contraste de microburbujas de visualizar y caracterizar el ambiente vascular. Estos agentes permiten la evaluación no invasiva de la microcirculación, la vascularización y la función cardiovascular. Además, la modificación de la superficie de la burbuja puede resultar en microburbujas específica de unión a los biomarcadores endoteliales, como se ha demostrado en aplicaciones preclínicos de la angiogénesis, la aterosclerosis y la inflamación 1,2 toma de imágenes por ultrasonido molecular de eventos vasculares posibles. Por lo tanto, un mayor contraste de ultrasonido puede ser usado para identificar los entor....
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Protocolo
NOTA: Los procedimientos experimentales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Investigación Sunnybrook (Toronto, Ontario, Canadá). Los procedimientos para el tratamiento humanitario de los animales deben ser observados en todo momento. Se supone que el investigador está entrenado en la operación básica de un sistema de imágenes de ultrasonido. Este protocolo funciona mejor con dos personas.
1. Modelos Animales
- Casamata del CD-1 macho y hembra Mus musculus para obtener embriones de tipo salvaje para los estudios de perfusión.
- Para los estudios de imag....
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Resultados
La inyección de agentes de contraste de ultrasonido en el útero los embriones de ratón ex depende del éxito en el aislamiento de la vida, embriones en fase tardía de la gestación del útero y el mantenimiento de la viabilidad en el transcurso de la inyección y de formación de imágenes de ultrasonido relacionada. Una vez que el embrión se ha exteriorizado y posicionado, como se muestra en la Figura 1, la inyección cuidadosa de agente de contraste en la vasculatura embrionaria es posible........
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Discusión
Los agentes de contraste de ultrasonido fueron inyectadas en la última etapa de la gestación de embriones de ratón y las imágenes de contraste no lineales fueron adquiridos para medir parámetros de perfusión y microburbujas dirigidos vinculante. El éxito de formación de imágenes de microburbujas dentro de la vasculatura embrionaria era dependiente de una serie de factores, siendo el primero la viabilidad del embrión. Todo el equipo y el aparato se prepararon de antemano con el fin de minimizar el tiempo requerido para e.......
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Divulgaciones
F.S. Foster reconoce su papel como consultor de VisualSonics Inc.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa Terry Fox del Instituto Nacional del Cáncer de Canadá.
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Materiales
Antibodies
td colspan="4"> (biotinilado, eBioscience) — La elección del anticuerpo depende del experimento interno destiladaSistema 3120000062022491351 Sylgard 184 Kit de Bomba de infusión de jeringa &
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reagents< | |||
| eBioscience | 13-4321-85 | Esta combinación de anticuerpos/microburbujas se requiere a menudo como control experimental |
| eBioscience | 13-5821-85 | |
| Rata biotinilada MJ 7/18 anticuerpo contra endoglina de ratón | Hibridoma | Los anticuerpos externos también pueden ser apropiados: hemos utilizado eBioscience (13-1051-85) en el pasado | |
| Agua | |||
| Embryo media | |||
| Sigma | D5796 | |
| ATCC | 30-2020 | lote # 7592456 |
| Gibco | 15630 | 5 ml, 1 M |
| Gibco | 15140-122 | 5 ml, 10,000 unidades Pen., 10,000 μ g Etanol estreptocócico |
| , 70% | |||
| Hielo | |||
| Paraformaldehído | Sigma | 76240 | 4% |
| Solución salina tamponada con fosfato [1x] | Sigma | D8537 | 1x, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio |
| Ratón embarazada, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| Cloruro de sodio (solución salina) al 0,9% | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Agente de contraste ultrasónico, micromarcador listo para objetivos y no dirigido | ; VisualSonics Inc. | ||
| Gel de ultrasonido (Aquasonic 100, incoloro) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Placas de cultivo celular (4) : 100 x 20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Placas de cultivo celular (12) : 60 x 15 mm | Centrífuga Sigma | D8054 | |
| Centrífuga | Sorvall Legend RT | ||
| Tubos cónicos, 50 ml BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluyente | Beckman Coulter | Isoton II Diluyente, 8448011 | |
| tijeras de disección (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Pinzas (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinzas de astilla | VWR | 25601-134 | |
| Vaso de precipitados de vidrio, 2 L (Vaso Griffin) | VWR | 89000-216 | |
| Capilares de vidrio, 1 x 90 mm GD-1 con filamento | Narishige | GD-1 | |
| Extractor de agujas de vidrio | Narishige | PN-30 | |
| Guantes | Ansell | 4002 | |
| Sonda de anatomía macroscópica | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Placa calefactora | VWR | 89090-994 | |
| Cubitera | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imagen Plataforma | : VisualSonics Inc. | de rieles integrado | |
| Fuente de luz, fibra óptica | Fisher Scientific | 12-562-36 | Idealmente tiene brazos ajustables |
| Luers (12), polipropileno con púas hembra ¼-28 UNF rosca | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Sistema de microultrasonido, alta frecuencia | VisualSonics Inc. | Agujas Vevo2100 | |
| , calibre 21 (1") | VWR | 305165 | |
| Analizador de tamaño de partícula | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Cuchara perforada (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pines (6), negro anodizado minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 μ l, 20-200 μ l, 100-1.000 μ l] | Eppendorf | Research Plus 3120000038 ajustable; 3120000054; | |
| Puntas de pipeta [2-200 μ l, 50-1.000 μ l] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; | |
| Tijeras | |||
| Elastómero de Silicona | Dow Corning | ||
| Tubing, laboratorio Tygon 1/32" x 3/32" | VWR | 63010-007 | |
| Barra aplicadora de madera (hisopo, cabeza de algodón) | VWR | CA89031-270 | |
| Microscopio quirúrgico con aumento de 5-8X | Jeringas Fisher Scientific | Steromaster | |
| , 1 ml Jeringas Normject | Fisher 14-817-25 | ||
| (10), 30 ml | VWR | CA64000-041 | |
| nbsp; | Bio-lince | Termómetro NE-1000 | |
| , -20-110 ° C | VWR | 89095-598 | |
| Temporizador | VWR | 33501-418 | |
| Tubos, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Bastidores de tubos (3) | VWR | 82024-462 | |
| Transductor de ultrasonidos, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, Fine | Science Tools | 15005-08 | |
Referencias
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
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Reimpresiones y permisos
