En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.
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Artículo de método
Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides
En este artículo
Resumen
Resumen
Las estructuras de las criptas-vellosidades intestinales, denominadas organoides, pueden mantenerse en cultivo sostenido tridimensionalmente cuando se complementan con los factores de crecimiento adecuados. Dado que los organoides son muy similares al tejido original en términos de diferenciación homeostática de células madre, polaridad celular y presencia de todos los tipos de células terminalmente diferenciadas conocidas en el epitelio intestinal adulto, sirven como un recurso esencial en la investigación experimental sobre el epitelio. La posibilidad de expresar transgenes o ARN interferente utilizando vectores lentivirales o retrovirales en organoides ha aumentado las oportunidades para el análisis funcional del epitelio intestinal y las células madre intestinales, superando a los transgénicos tradicionales de ratón en velocidad y costo. En el protocolo de video actual mostramos cómo utilizar la transducción de organoides del intestino delgado con vectores lentivirales ilustrados por el uso de transgenes inducibles por doxicilina, o ARN de horquilla corta inducible por IPTG para la sobreexpresión o la eliminación de genes. Además, teniendo en cuenta que el cultivo de organoides produce recuentos celulares diminutos que incluso pueden reducirse mediante un tratamiento experimental, explicamos cómo procesar organoides para análisis posteriores dirigidos a RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica. Las técnicas que permiten la expresión de transgenes y la eliminación de genes en organoides intestinales contribuyen al potencial de investigación que tienen estas estructuras epiteliales intestinales, estableciendo el cultivo de organoides como un nuevo estándar en el cultivo celular.
Introducción
El epitelio intestinal es uno de los tejidos corporales que proliferan más rápidamente, lo que ha causado a atraer amplio interés de la investigación sobre células cancerosas y madre. En 2009 se publicó una técnica para generar culturas de larga duración de las pequeñas criptas intestinales en matrigel, conservando una estructura dimensional 3 1. Estas estructuras, denominadas organoides intestinales, pueden ser cultivadas utilizando técnicas estándar, y la zona medio suplementado con un número de factores de crecimiento definidos, incluyendo la BMP-noggin inhibidor de la vía de señalización (Nog), el potenciador de la vía Wnt de señalización rspondin 1 (R....
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Protocolo
1. Preparación de polietilenimina (PEI) como reactivo de transfección
- Disolver aproximadamente 150 mg de PEI en 100 ml de H 2 O.
- Ajuste solución a pH 7,4 mediante la adición de HCl hasta que la solución se vuelva clara y revuelva hasta que se disuelva por completo. Esto puede tomar entre 10 y 60 min y añadir agua a una concentración final de 1 mg / ml.
- Cuando clara, filtrar la solución PEI a través del filtro de 0,22 micras estéril y guárdelo en un congelador a -80ºC en alícuotas de 5 ml.
2. Producción de partículas de Lentiviral
Día 1:
- Células HEK293T....
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Resultados
Transducción lentiviral organoid
La técnica de la transducción organoid utilizando lentiviral partículas depende de la correcta manipulación de los organoides antes y durante la transducción. Organoides (Figura 3A) se cultivaron y se fueron interrumpidas en criptas individuales (Figura 3B). Como se informó anteriormente, estas criptas individuales, cuando se cultivan en presencia del inhibidor de GSK3 Chir99021 se convirtieron en criptas quísticas <.......
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Discusión
El protocolo de vídeo actual describe la transducción lentiviral de organoides de epitelio intestinal primaria y análisis de aguas abajo de estos organoides utilizando técnicas de ARN cuantitativos e inmunohistoquímica.
Transducción lentiviral se realiza a menudo en las células adherentes o flotantes en placas de cultivo. Dado que la estructura tridimensional de organoides los hace difíciles de penetrar por las partículas virales, se utiliza un número de métodos para aumentar la eficacia. Pr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
J. Heijmans cuenta con el apoyo de un estipendio de la Fundación Holandesa contra el Cáncer (KFW). G.R. van den Brink cuenta con el apoyo financiero del Consejo Europeo de Investigación en el marco del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013)/Acuerdo de subvención del Consejo Europeo de Investigación número 241344 y por una beca VIDI de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (GvdB).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Polietileno Imina | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM medio | Lonza | BE12-614F | |
| Suero fetal para ternera | Lonza | DE14-801F | |
| Penicilina-estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamina | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Avanzado DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-acetilcisteína | Sigma | A9165-1G | |
| ratón Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
| Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Axon | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polibreno | Sigma | 107689 | |
| nicotinamida | Sigma | N0636 | |
| Tripsina | Lonza | BE02-007E | |
| puromicina | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| β-mercaptoetanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldehído Sigma | 252549-1L | ||
| vial de vidrio cónico 12 mm x 75 milímetros 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosina Amarillento | VWR | 1.159.350.025 |
Referencias
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A.
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Reimpresiones y permisos
