Se describe un protocolo para extraer células humanas primarias de un tumor de colon quirúrgico y tejidos normales. A continuación, las células aisladas se cultivan en sustratos elásticos blandos (hidrogeles de poliacrilamida) funcionalizados por una proteína de la matriz extracelular e incrustados con microesferas fluorescentes. La citometría de tracción se realiza para evaluar las tensiones contráctiles celulares.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células cancerosas responden a matriz de rigidez mecánica de una manera compleja usando un sistema coordinado, jerárquica mecano-químico compuesto de receptores de adhesión y proteínas de la membrana de transducción de señales asociadas, la arquitectura citoesquelética, y motores moleculares 1, 2. Mecanosensibilidad de las diferentes células cancerosas in vitro son investigado principalmente con las líneas celulares inmortalizadas o células primarias de murino derivado, no con células cancerosas humanas primarias. Por lo tanto, se sabe poco acerca de la mecanosensibilidad de células de cáncer de colon humanas primarias in vitro. Aquí, un protocolo optimizado se desarrolla que describe el aislamiento de las células del colon humanos primarios a partir de muestras de tejidos humanos quirúrgicos sanos y cancerosos. Las células del colon aislados son entonces cultivadas con éxito en sustratos funcionalizados por una matriz extracelular blando (2 kPa rigidez) y rígido (10 kPa rigidez) hidrogeles de poliacrilamida y poliestireno rígido (~ 3,6 GPa rigidez) (fibronectinaen este caso). Microperlas fluorescentes están incrustados en geles suaves cerca de la superficie de cultivo de células, y el ensayo de tracción se lleva a cabo para evaluar las tensiones contráctiles celulares utilizando software de acceso libre y gratuito. Además, la microscopía de inmunofluorescencia en diferentes sustratos de rigidez proporciona información útil sobre la morfología celular primaria, la organización del citoesqueleto y vinculina que contiene adhesiones focales como una función de la rigidez del sustrato.
Introducción
En los últimos años se ha convertido en cada vez más evidente que mecánica micro-entorno, además de los factores bio-químicas, juega un papel importante en la regulación de las funciones celulares. Las células pueden detectar y responder a la rigidez sustrato sobre el que se adhieren a (como en la cultura 2D) o rodeados por (como en cultivo 3D) 3-7. Al hacerlo, las células pueden modular su diferenciación 3, 4 morfología, migración / motilidad 5, las propiedades biofísicas 6, 7 crecimiento, y otros procesos.
Las células cancerosas también responden a la rigidez de la matriz 2D y 3D utilizando un....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El protocolo se describe a continuación sigue las directrices de UIUC comité de ética de la investigación humana.
1. Recogida y digestión de Tejidos quirúrgico Muestra
- Recoger la muestra de tejido del tumor después de la resección de colon derecho (Figura 1A y 1B). Recoger el tejido de un sitio sano adyacente también.
- Transferir el tejido inmediatamente a un vial de 15 ml que contiene 12 ml de solución de HBSS. Conservar el vial en el hielo dentro de una caja de la espuma aislante.
- Transporte el tejido que contiene vial a una campana de cultivo de tejidos para su posterior procesamiento en 45 mi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El protocolo descrito anteriormente se emplea con éxito para múltiples muestras de tejido (n = 12) de cuatro pacientes diferentes según las directrices de la junta de revisión institucional. La figura 1A ilustra un tumor colorrectal representante de la derecha después de la cirugía de la que se obtienen los cortes de tejido para cultivos celulares. Una sección de tejido típico en solución HBSS después de la transferencia a la campana laminar para su posterior procesamiento se muestra en la Figur.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La tensión de tracción celular ha surgido recientemente como un potencial indicador biofísico del estado metastásico 13. Sin embargo, no existen datos tracción experimental con células tumorales primarias en la literatura hasta la fecha. Además, el cultivo de las células del colon directamente aislados primaria en diferentes geles de poliacrilamida rigidez no se informa todavía. Por lo tanto, establecemos un colon primaria optimizadas las condiciones de cultivo de células en geles y poliestireno (Figu.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por la subvención 10-02165 de la Fundación Nacional de Ciencias ECCS, y la subvención 12035 del Programa de Iniciativa de Innovación Interdisciplinaria, Universidad de Illinois. M.Y. A. fue financiado en UIUC por la Alianza del Instituto Nacional del Cáncer para la Nanotecnología en el Cáncer del NIH 'Centro de Capacitación en Nanotecnología del Cáncer del Medio Oeste' Subvención R25 CA154015A. La tinción con inmununona y la microscopía confocal se llevaron a cabo en el Instituto de Biología Genómica (IGB) de la UIUC. M.Y.A. reconoce las discusiones con B. J. Williams de UIUC con respecto a los experimentos de aislamiento. M.Y.A. agradece ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tripsina | Worthington | LS003736 | |
| Colágeno | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropiltrymetoxisilano (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Glutaraldehído | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Acrilamida | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-metilenebisacrilamida (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| Solución tampón HEPES | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Persulfato de amonio | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Fibronectina humana | BD biociencias | 354008 | |
| Hidrato de hidracina | Sigma-Aldrich | 18412 | |
| Peligroso Ácido acético | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehído | Ciencias de la microscopía electrónica | RT15710 | |
| Potenciador de señales | Life technologies | I36933 | |
| Anticuerpo monoclonal anti vinculina | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC conjugados de faloidina | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 y micro; m perlas fluroscentes | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% Tripsina-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| Materiales | |||
| 12 mm2 2 cubreobjetos de vidrio | Corning | 2865-12 |
Referencias
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
C lulas primarias de colon humanodisociaci n enzim tica de tejidosensayo de citometr a de tracci nmicroscop a de inmunofluorescenciahidrogeles de poliacrilamidaan lisis de la rigidez del sustratomedici n de la contractilidad celularvisualizaci n de adhesiones focalesestudio de la organizaci n del citoesqueletoaislamiento de tejido quir rgico
