Las herramientas de edición del genoma, como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated), han mejorado en gran medida la eficiencia de la selección de genes en células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Este manuscrito describe un protocolo para generar un indicador de hiPSC específico del linaje utilizando la recombinación homóloga asistida por el sistema CRISPR/Cas.
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Artículo de método
Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase
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Resumen
Resumen
La selección de genes es un enfoque crítico para caracterizar las funciones de los genes en la investigación biomédica moderna. Sin embargo, la eficiencia de la selección de genes en las células humanas ha sido baja, lo que impide la generación de líneas celulares humanas a la velocidad deseada. Los últimos dos años han sido testigos de una rápida progresión en la mejora de la eficiencia de la manipulación genética mediante herramientas de edición del genoma como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (asociado a CRISPR). Este manuscrito describe un protocolo para generar reporteros de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) específicas del linaje utilizando la recombinación homóloga asistida por el sistema CRISPR/Cas. Se describen los procedimientos para la obtención de los componentes necesarios para la creación de líneas reporteras de linaje neuronal utilizando el sistema CRISPR/Cas, centrándose en la construcción de vectores de orientación y ARN guía única. Este protocolo puede extenderse al establecimiento de la plataforma y a la corrección de mutaciones en las hiPSCs.
Introducción
El
sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated), junto con otras herramientas de edición del genoma, ha revolucionado la manipulación del genoma humano en los últimos años1-7. Los componentes principales del sistema CRISPR/Cas9 son el ARN guía simple (sgRNA) y Cas9. Cas9 es una endonucleasa de ADN tipo II guiada por ARN. Tiene dos dominios nucleasas, HNH y RuvC, que son responsables de hacer roturas de doble cadena (DSB) de ADN en una región genómica específica junto a un motivo adyacente al protoespaciador (PAM)7-10. Un sgRNA tiene una función combinada de la del crRNA y el tracrRNA, dos moléculas de ARN de inmunidad adaptativa identificadas en bacterias (como Streptococcus pyogenes) y arqueas para luchar contra la invasión del ADN de fuentes exógenas9-11. Cuando se diseña adecuadamente y se cointroduce en las células de mamíferos, el sgRNA reconoce la secuencia de PAM, los pares de bases con la hebra complementaria del ADN objetivo, y guía y transactiva Cas9 para que se adhiera a ambas hebras de ADN inmediatamente aguas arriba de PAM7. Posteriormente, se producirá una recombinación dirigida homóloga (HDR, en presencia de un vector objetivo) o una unión de extremos no homólogos (NHEJ) para reparar los DSB. Se pueden integrar transgenes como ADNc, casetes reporteros o fragmentos resistentes a antibióticos, y crear líneas transgénicas o knockin
.Aunque el sistema CRISPR/Cas9 es altamente eficiente y relativamente específico, se han reportado actividades no deseadas fueradel objetivo 12-15. Para minimizar los eventos fuera del objetivo, también se han diseñado nickases Cas9 (Cas9n)9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A o Cas9 H840A) es una enzima Cas9 con mutaciones en uno de los dos dominios de la nucleasa, que solo provoca una muesca en una hebra de ADN. Para lograr la escisión en ambas hebras, se diseñan dos sgRNAs para guiar un par de nickasas, que cortan por separado en los loci cercanos de las dos hebras de ADN diferentes. La estrategia de "doble muesca" requiere un diseño más estricto que la plataforma Cas9 convencional, y ofrece tanto una alta eficiencia como una alta especificidad para los experimentos de edición de genes.
Este manuscrito describe un protocolo para generar un indicador de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) específicas del linaje utilizando la recombinación homóloga asistida por el sistema CRISPR/Cas. Se describen los pasos para obtener los componentes necesarios para la creación de líneas reporteras de linaje neuronal utilizando la edición del genoma mediada por el sistema CRISPR/Cas, con un enfoque en la construcción de vectores objetivo y sgRNA. Este protocolo se ha repetido con éxito en múltiples líneas de hiPSC, incluidas las derivadas de individuos sanos y de pacientes con enfermedades del SNC. Los genes objetivo en nuestro laboratorio incluyen OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 y SOD1. La eficiencia de la focalización de la recombinación homóloga mediada por el sistema CRISPR/Cas en hiPSCs oscila entre el 20 y el 40%, lo que es consistente con informes anteriores1,18,19. En comparación con una eficiencia típica del 1-2% en los experimentos convencionales de orientación genética, la eficiencia de la orientación ha mejorado significativamente.
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Protocolo
1. Diseño y construcción vectorial para vectores de orientación
- Una vez determinado el marcador específico del linaje, localice la secuencia genómica del gen y diseñe los brazos de homología en consecuencia. La longitud del brazo de homología de 5' es de ~1 kb y la del brazo de homología de 3' es de ~1,5 kb (Figura 1).
- Etiquete el casete reportero secuencialmente aguas abajo de la secuencia genómica justo antes del codón de parada, mediante subclonación, para que la expresión endógena no se altere ni se interrumpa. Conecte el reportero, o casete (s) reportero (s) dual(es), con secuencias de péptidos 2A autoescindidos (F2A, E2A o T2A) 20,21, o sitio de entrada de ribosoma interno (IRES).
Nota: Los reporteros pueden incluir proteínas fluorescentes como GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, luciferasa o casete de resistencia a antibióticos, una combinación de proteína fluorescente y casete de resistencia a antibióticos. En la Figura 1 se muestra un ejemplo de construcción de un vector de diana para el gen de ALDH1L1 humano, marcado por EGFP y casete de resistencia a neomicina. - Agregue un casete de selección positiva aguas abajo del reportero. La selección positiva es un casete resistente a los antibióticos que se extirpará de las iPSC objetivo después de seleccionar y aislar los clones positivos.
- Incluya un casete de selección negativa fuera del brazo de homología de 3'. Los casetes de selección negativa más comunes son la timidina quinasa, el TK y la toxina diftérica A (DTA) 22.
- Obtener un clon humano de BAC que contenga la secuencia del marcador de linaje y verificar el clon mediante amplificación por PCR. Construya el vector de orientación en pKD46 que contiene-DH5α utilizando la recombinación para derribar el sitio de orientación 23. Aplicar pasarela multisitio, estrategias Golden gate23,24 cuando sea necesario.
2. Diseño y construcción vectorial de sgRNAs para el sistema CRISPR/Cas9.
- Determine el marcador específico de linaje al que se dirigirá el reportero. Copie la secuencia de ADNc de la base de datos del NCBI. Vaya a la búsqueda BLAT humana para obtener la alineación del ADN genómico.
- Haga clic en la pestaña "navegador" para ver el ensamblaje del gen. En la pestaña "Ver", haga clic en "ADN" para obtener la secuencia completa de ADN genómico en formato FASTA.
- Localice el codón de parada dentro de la secuencia de ADN, donde se marcarán la secuencia 2A y el casete reportero.
- Busque el motivo adyacente del protoespaciador (PAM, es decir, NGG) dentro de la vinicidad (~100 pb de área de flanqueo) del codón de parada. Escanee ambas hebras para localizar la secuencia NGG adecuada. Tenga en cuenta la especificidad de las secuencias ascendentes para evitar posibles eventos fuera del objetivo. Utilice herramientas de código abierto como BLAST y CasOT (consulte el paso 5 para obtener más información).
- Copie la secuencia de 20 bases inmediatamente antes de NGG y péguela en la herramienta de diseño web ZiFit para diseñar oligonucleótidos con voladizos compatibles con el vector de expresión de ARNg humano (con promotor U6) MLM3636.
- Sintetizar oligonucleótidos directos e inversos 7.
- Para producir ARNg bicatenario, desnaturalice ambos oligonucleótidos a 70 °C durante 15 minutos y enfríe gradualmente hasta RT. Para una reacción de 50 μl, agregue 22,5 μl de oligonucleótidos directos e inversos (la concentración de stock es de 0,1 mM) respectivamente, y 5 μl de tampón de recocido (100 mM de Tris-HCl, 10 mM de EDTA, 1,5 M de NaCl, pH 8,0).
- Mezclar y ligar los oligonucleótidos obtenidos en el paso 2.7 con el vector de expresión de ARNg humano digerido por BsmBI (con promotor U6) MLM3636. Para una reacción de 20 μl, agregue 1 μl de oligonucleótidos del paso 2.7, 100 ng de MLM3636 y 1 μl (400 U) de ligasa T4. Incubar en RT O/N.
- Transforme las células competentes DH5α con el producto de ligadura por choque térmico a 42 °C durante 30 seg. Cultive las bacterias en una placa de agar LB ampicilina (100 μg/ml) a 37 °C o/n. Elija 3 ~ 5 colonias para la minipreparación de plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Secuenciar el ADN plasmídico para confirmarlo utilizando proveedores comerciales. Prepare el plásmido correcto de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Evalúe el sgRNA mediante el ensayo de endonucleasa T7 1 (T7E1) (consulte el paso 4 para obtener más detalles). La hiPSC transfectada con el plásmido y el sgRNA se expresará bajo el promotor U6 incorporado en la columna vertebral del MLM3636 (consulte el paso 6 para obtener más detalles).
3. Diseño y construcción de Cas9n Double Nickase sgRNA
- Obtención de la doble níquela Cas9n D10A vector pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
- Diseñe un par de oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás para cada locus objetivo. Copie la secuencia de 20 bases inmediatamente aguas arriba de NGG como se describe en el Paso 2 y péguela en la herramienta de diseño web ZiFit
- Para obtener oligonucleótidos con voladizos compatibles con pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), retire la primera y la última base de los oligonucleótidos delanteros e inversos que muestra la herramienta de diseño ZiFit.
- Sintetizar oligonucleótidos directos e inversos7. Nombra estos oligonucleótidos como f(n)-F, f(n)-R para las PAM en un lado del sitio objetivo, r(n)-F, r(n)-R para las PAM en el otro lado del sitio objetivo. De estos, n es el número para designar diferentes PAMs, la f y r minúsculas representan la ubicación de los PAMs ya sea en la hebra de sentido (f) o antisentido (r), F y R representan oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás.
- Pruebe varios pares (p. ej., r5 y f2) utilizando el ensayo T7E1 (detallado en el paso 4) para identificar el par optimizado de sgRNAs que se utilizará para Cas9n.
- Para producir ARNg bicatenario, desnaturalice ambos oligonucleótidos a 70 °C durante 15 minutos y enfríe gradualmente hasta RT. Para una reacción de 50 μl, añadir 22,5 μl de oligonucleótidos directos e inversos (la concentración de stock es de 0,1 mM) respectivamente, y 5 μl de tampón de recocido (100 mM de Tris-HCl, 10 mM de EDTA, 1,5 M de NaCl, pH 8,0).
- Mezclar y ligar los oligonucleótidos obtenidos en el paso 3.5 con pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) digerido por BbsI. Para una reacción de 20 μl, agregue 1 μl de sgRNA del paso 3.5, 100 ng de Cas9n (D10A), 1 μl (400 U) de ligasa T4. Incubar en RT O/N.
- Transforme las células competentes DH5α con el producto de ligadura mediante choque térmico a 42 °C durante 30 segundos. Cultive las bacterias en una placa de ampicilina de agar LB (100 μg / ml) a 37 °C o / n. Elija 3 ~ 5 colonias para la minipreparación de plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Secuenciar el ADN plasmídico para confirmarlo utilizando proveedores comerciales. Prepare el plásmido correcto de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Evalúe el sgRNA mediante el ensayo T7E1 (consulte el paso 4 para obtener más detalles). La hiPSC transfecta con el plásmido y el sgRNA se expresará bajo el promotor U6 incorporado en la columna vertebral de Cas9n (D10A) (consulte el paso 6 para obtener más detalles).
4. Evaluación de sgRNAs mediante el ensayo T7 Endonucleasa1 (T7E1)
- Para una placa de 24 pocillos, placa de 2 x 105 celdas de 293 pies por pocillo un día antes (día -1).
- El día de la transfección (día 0), cotransfecte las células 293FT con el plásmido sgRNA y el vector de expresión Cas9. Añadir 0,5 μg de vector sgRNA, 0,5 μg de vector de expresión de Cas9 JDS246 (Cas9-003) y 1,5 μl de Lipofectamine 2000.
- Para el control negativo, agregue 0,5 μg de vector de expresión de GFP (por ejemplo, GFP impulsado por el promotor de CMV en una columna vertebral de pcDNA3) en lugar de vectores de sgRNA.
- Después de 72 horas (día 3), recoja las células añadiendo 100 μl de tampón de extracción rápida de ADN y triture vigorosamente.
- Incubar la mezcla a 68 °C durante 15 min, luego a 95 °C durante 8 min. Esta es la plantilla para los experimentos posteriores de PCR.
- Diseñe cebadores de PCR directos e inversos para amplificar la secuencia de PAM que flanquea. Por lo general, el producto de PCR dirigido tiene una longitud de alrededor de 400-500 pb. Sintetizar los oligonucleótidos7.
- Para una reacción de PCR de 50 μl, agregue 1 μl de molde del paso 4.5, 0,5 μl de Herculasa II, 0,5 μl de DMSO, 10 μl de tampón 5x, 0,5 μl de mezcla de dNTP y 1 μl de mezcla de cebadores directo e inverso.
- Utilice los siguientes parámetros de PCR: 98 °C durante 2 minutos, 35 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, 59 °C durante 20 segundos, 72 °C durante 1 minuto, con una extensión final a 72 °C durante 5 minutos
Nota: Los parámetros de PCR descritos aquí producen productos específicos para varios genes analizados. Sin embargo, estas condiciones dependen de los genes de interés elegidos por el usuario. Las PCR que utilizan ADN genómico como plantilla a menudo requieren optimización para garantizar que no aparezcan bandas adicionales. Estas bandas adicionales pueden confundirse con productos de escisión después del ensayo T7E1. - Mida la concentración de ADN de los productos de PCR utilizando un espectrómetro en A260.
- Añadir 400 ng de productos PCR a 2 μl de tampón de digestión 2. Añadir ddH2O a un volumen de reacción final de 19 μl. Incubar en agua hirviendo durante 5 min. Deje que la reacción se siente en el banco y se enfríe naturalmente a RT (45-60 min).
- Añadir 1 μl (10 unidades/μl) de T7E1, incubar a 37 °C durante 15 min. Detenga la reacción añadiendo 2 μl de EDTA 0,25 M mezclado con 6x DNA Loading Dye.
- Disolver 2,5 g de agarosa en polvo en 100 ml de 1xTAE. Calienta la mezcla en el microondas y vierte el gel en una caja de gel. Cuando se forme el gel, cargue toda la reacción de 20 μl en el gel de agarosa al 2,5%. Ponga el gel a 100-150 V durante 30 min.
- Inspeccione el gel bajo luz ultravioleta (Figura 3). T7E1 corta en los sitios no coincidentes. En el caso de los sgRNAs que han causado la unión de extremos no homólogos, los productos de PCR mostrarán bandas adicionales de migración rápida (de menor tamaño) en comparación con el control negativo (descrito en el paso 4.3).
- Estime y clasifique la eficiencia de corte del sgRNA y el porcentaje de inserción y deleción (indel%) comparando la densidad de la banda utilizando el software Image J.
- Para cada muestra que se ejecute en el gel, designe las bandas de gel como banda sin cortar, banda cortada 1 y banda cortada 2.
- Mida la densidad de cada banda usando ImageJ de acuerdo con el manual del software.
- Calcule elcorte f utilizando la siguiente fórmula: corte f = (banda de corte 1 + banda de corte 2) / (banda sin cortar + banda de corte 1 + banda de corte 2)
- Calcule el % de Indel utilizando la siguiente fórmula: Indel=1- √(corte de 1-f).
5. Predicción in silico de posibles sitios fuera del objetivo
Nota: Los posibles sitios fuera del objetivo se pueden predecir utilizando una herramienta de código abierto en línea llamada CasOT17, que es un programa basado en Perl.
- Para un sistema Windows, descargue el programa CasOT y los archivos de la base de datos del genoma humano en el disco duro local.
- Prepare el archivo objetivo del sgRNA diseñado en el formato FASTA.
- Abra el archivo llamado "casot". Aparecerá una ventana de comandos. Déjalo como está por ahora.
- Abra el archivo llamado "opt-generator" para generar la cadena de opciones. Pegue la ruta y el nombre del archivo de destino en el cuadro de diálogo de la opción "-t" o "-target".
- Pegue la ruta del archivo de secuencia del genoma en el cuadro de diálogo de la opción "-g" o "-genoma".
- Valores de entrada de –s o –seed (el valor predeterminado es 2) y –n o -nonseed (el valor predeterminado es 255). Se genera la cadena de opción y aparecerá en el cuadro de la parte superior de la página.
- Copie la cadena de opción y péguela en la ventana de comandos de CasOT descrita en el paso 5.3.
Nota: La ejecución del programa CasOT puede tardar entre 30 y 90 minutos, dependiendo de las opciones y del ordenador utilizado. Una vez completado, se generará una carpeta llamada '--'. Se incluirán dos archivos en la carpeta, un archivo ".stat" que describe las estadísticas y un archivo de .csv (valores separados por comas) que contiene los resultados detallados de la búsqueda. - Abra el archivo .csv con un programa de hoja de cálculo. En el archivo se proporciona la siguiente información para cada sitio fuera del sitio objetivo: ubicación cromosómica y genómica, secuencia del sitio, tipo de discordancia (Mm), número total de bases no coincidentes e información del exón relacionada con el sitio fuera del sitio objetivo.
- Diseñe cebadores de PCR para los sitios que tienen <2 mm en la secuencia de semillas o sin semillas.
- Realice la PCR para el clon positivo de hiPSC seleccionado utilizando las siguientes condiciones: 98 °C durante 2 min, 35 ciclos de 98 °C durante 20 seg, 59 °C durante 20 seg, 72 °C durante 1 min, con una extensión final a 72 °C durante 5 min.
Nota: Los parámetros de PCR descritos aquí producen productos específicos para varios genes analizados en nuestro laboratorio. Sin embargo, estas condiciones dependen de los genes de interés elegidos por el usuario. Las PCR que utilizan ADN genómico como plantilla a menudo requieren optimización para garantizar que no aparezcan bandas adicionales. - Secuenciar los productos de PCR, alinear los resultados de la secuenciación con las secuencias predichas y buscar mutaciones. Si existen mutaciones, se identifican los eventos fuera del objetivo.
6. Electroporación de hiPSCs para hacer reporteros de linaje neuronal
- Cultivo de hiPSCs en medio TeSR-E8 en platos recubiertos de Geltrex. Cambie el medio a MEF-CM (medio condicionado de fibroblastos embrionarios de ratón) dos días antes de la electroporación. Incubar en 2 ml de Accutase durante 5 min y recoger las células.
- Electroporato de hiPSCs con vector de focalización lineal, vector de expresión Cas9-003 y vector de sgRNA utilizando las siguientes condiciones: 1 x 107 hiPSCs, co-transprefecto 2,5 μg de sgRNA, 2,5 μg de Cas9 y 50 μg de vector de direccionamiento. Para la estrategia de doble níquesa, agregue 50 μg de vector objetivo, 2,5 μg de cada sgRNA (con Cas9n coexpresado por el vector).
- Selección de clones por selecciones positivas y negativas como se describe24,25.
- Identificar clones positivos mediante análisis de Southern blot o PCR genómica de largo alcance24,25.
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Resultados
Se construyen vectores de direccionamiento con todos los componentes necesarios, incluyendo brazos de homología, casete del gen reportero y casetes de selección positiva y negativa (Figura 1). Basándose en el locus genómico endógeno, se diseñan múltiples (2 a 3) ARN-g (si se utiliza el sistema Cas9) o pares de ARN-g (si se utiliza la estrategia de doble nucleasa Cas9n) y se clonan en los andamios de vectores de expresión de ARN-g humano MLM3636 o pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) (Figura 2...
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Discusión
La orientación genética es una herramienta esencial para caracterizar las funciones de los genes. Sin embargo, la eficiencia relativamente baja exige un trabajo intensivo en mano de obra y que requiere mucho tiempo. Recientemente, el desarrollo de herramientas de edición del genoma como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) ha mejorado enormemente la eficiencia de la orientación. Este manuscrito describe un protocolo para generar un reportero de células madre pluripotentes induc...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Neurocirugía, el Fondo Staman Ogilvie de la Fundación Memorial Hermann, el Centro de Accidentes Cerebrovasculares Bentsen en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston y la Fundación Mission Connect TIRR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 | |
| pKD3 | Addgene | 45604 | |
| pKD46 | El Centro de Stock Genético de Coli, CGSC | 7634 | |
| Secuencia PGK-neo-bpA | Addgene | 13442 | |
| Clones de BAC humano de genes diana | |||
| JDS246 (Cas9-003), Streptococcus pyogenes Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 | |
| , vector de expresión de ARNg humano con promotor U6 | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Diseño | 42335 | |
| , herramienta de predicción de objetivos ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | ||
| Off CasOT http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | |||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| sgRNA Síntesis de cebadores | Sigma | ||
| One shot Top10 Electrocomp E. Coli Células competentes | Life Technologies | C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 | |
| Enzimas de restricción | NEB y Life Technologies | ||
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo | Researech | D4007 | |
| Tampón de extracción rápida de ADN | Epicentro | QE0905T | |
| Herculasa II ADN polimerasas de fusión | Agilent Technologies | 600675 | |
| Tampón de digestión 2 | New England Biolab | ||
| 6X Tinte de carga de ADN | Thermo Scientific | R0611 | |
| TeSR-E8 Kit para mantenimiento de hESC/hiPSC Tecnologías de | células madre | 05940 | |
| Agarosa ultrapura | Life Technologies | 16500-100 | |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 | |
| Essential 8 medio | Life Technologies | A1517001 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio | Life Technologies | A12856-01 | |
| D-MEM/F12 con Glutamax | Life Technologies | 10565018 | |
| D-MEM con Glutamax | Life Technologies | 10566040 | |
| Fetal Bovine Serum-ES calificado para células | Life Technologies | 10439 | |
| Reemplazo de suero knockout | Life Technologies | 10828010 | |
| 2-mercaptoetanol 1000X | Life Technologies | 21985023 | |
| aminoácidos no esenciales | Life Technologies | 11140050 | |
| Stempro Accutase | Tecnologías de la Vida | A1110501 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Solución de tripsina-EDTA al 0,25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| Geltrex | Tecnologías de la Vida | 12760-013 | |
| Inhibidor de ROCK Y-27632 | Millipore | SCM075 | |
| Reactivo SMC4 | BD | 354357 | |
| Neomicina resistente MEF | Millipore | PMEF-NL | |
| Higromicina resistente a MEF | Millipore | PMEF-HL | |
| G418 (Genética) | LifeTechnologies | 11811 | |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687010 | |
| FIAU (Fialuridina, 1-2-desoxi-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosil-5-yodouracil | Moravek Bioquímicos y Radioquímicos | Electroporador M251 | |
| : Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | ||
| 0,4 cm cubeta de electroporación | Bio-Rad | 165-2088 | |
| DIG-Kit de inicio de detección y etiquetado de ADN de alta calidad II | Roche | 11585614910 | |
| Solución de desnaturalización de hibridación | VWR | 82021-478 | |
| Kit de síntesis de sonda PCR DIG | Juego | de | |
| DIG | Roche | 11585762001 | |
| Anti-Digoxigenina (DIG-AP) | Sistema | ||
| CSPD | Roche | 11755633001 | |
| DIG juego de tampones de lavado y bloque | Roche | 11585762001 | |
| tampón TAE 50X | Life Technologies | 24710030 | |
| Tampón de transferencia (25 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20) | |||
| Reticulante ultravioleta Hoefer | Fisher Scientific | 03-500-308 | |
| Espermidina | Fisher | AC13274-0010 | |
| Tris HCl 2M (pH 7.5) | VWR | 200064-506 | |
| Denville Scientific película bio azul 8x10 | Fisher | nc9550782 | |
| Marcador de peso molecular de ADN II (marcado con DIG) | Roche | 11218590910 | |
| Amersham Membrana de transferencia Hybond-N+ | Roche | 95038-400 | |
| Bandeja de secado de vidrio Pyrex | Fisher | 15-242A | |
| Kimberly-Clark Toallas de papel plegables en C | Fisher | 06-666-32B | |
| Papel Whatman 3MM (26X41) | Fisher | 05-713-336 | |
| Bolsa de hibridación | Roche | 11666649001 | |
| Tubos de hibridación | Fisher | 13-247-300 | |
| Asador de horno de hibridación Shake 'n' Stack | Fisher | HBMSOV14110 |
Referencias
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