Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Resumen

Se presenta una estrategia para analizar cuantitativamente los datos histológicos en la médula ósea. La microscopía confocal de células marcadas con fluorescencia en secciones de tejido da como resultado imágenes bidimensionales, que se analizan automáticamente. Los análisis de colocalización de diferentes tipos de células se comparan con los datos de imágenes simuladas, lo que proporciona información cuantitativa sobre las interacciones celulares.

Resumen

La microscopía confocal es el método de elección para el análisis de la localización de múltiples tipos de células dentro de los tejidos complejos, tales como la médula ósea. Sin embargo, el análisis y la cuantificación de la localización celular es difícil, ya que en muchos casos se basa en el recuento manual, teniendo así el riesgo de introducir un sesgo rater-dependiente y la reducción de la fiabilidad entre. Por otra parte, a menudo es difícil juzgar si la co-localización entre dos células resultados de posicionamiento aleatorio, especialmente cuando los tipos de células se diferencian fuertemente en la frecuencia de su ocurrencia. Aquí, se introduce un método para la cuantificación insesgada de co-localización celular en la médula ósea. El protocolo describe la preparación de la muestra utilizado para obtener secciones histológicas de los huesos largos murinos enteros incluyendo la médula ósea, así como el protocolo de tinción y la adquisición de imágenes de alta resolución. Un flujo de trabajo de análisis que abarca desde el reconocimiento de hematopoyéticas y no hemattipos de células opoietic en imágenes de la médula ósea de 2 dimensiones (2D) a la cuantificación de los contactos directos entre esas células se presenta. Esto también incluye un análisis de vecindad, para obtener información sobre el microambiente celular que rodea a un determinado tipo de célula. Con el fin de evaluar si co-localización de dos tipos de células es el mero resultado de posicionamiento celular aleatoria o refleja asociaciones preferenciales entre las células, una herramienta de simulación que es adecuado para probar esta hipótesis en el caso de hematopoyéticas, así como las células del estroma, es se utiliza. Este enfoque no se limita a la médula ósea, y se puede ampliar a otros tejidos para permitir reproducible análisis, cuantitativa de los datos histológicos.

Introducción

Debido a los rápidos avances tecnológicos recientes en microscopía, incluyendo imágenes ópticas, el análisis de las células dentro del contexto de todo el tejido se ha convertido cada vez más accesible para los inmunólogos. La caracterización de las células individuales en suspensión representa un método valioso e indispensable para entender la función celular y molecular. Sin embargo, el análisis de las células dentro de su (micro) -anatomical medio ambiente es esencial para la comprensión de las interacciones entre los diversos tipos de células que colaboran en procesos complejos, tales como el desarrollo de respuestas inmunes.

Si bien ....

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobadas por los comités estatales apropiadas para el bienestar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín) y se realizaron de acuerdo con las directrices y la normativa vigente (licencia experimento con animales G0194 / 11).

1. Generación de ratones quiméricos fluorescente de Médula Ósea

NOTA: La generación de la médula ósea fluorescente ratones quiméricos para visualizar las células estromales de médula ósea se realizó como se describió antes ^9.

1. Comience el tratamiento Del-Cre x ratones ROSA-tdRFP (ratones que expresaban la proteína tánde....

Resultados

Cortar cryosections de hueso sin descalcificar con el método de la cinta Kawamoto permite todo el hueso a cortar como una sección intacta, con la médula ósea de la región endóstica todavía unido al hueso mineralizado, tanto en la diáfisis, así como en las áreas epifisarias con su alta densidad del hueso trabecular (Figura 1). Tinción nuclear de las secciones revela que aunque pequeñas grietas en la preparación no se pueden evitar totalmente, la estructura de los sinusoides y arterias, así como la red re.......

Discusión

A pesar de los avances en los métodos modernos de imagen óptica, el análisis de los datos histológicos se sigue a menudo obstaculizada por la falta de herramientas de cuantificación y métodos adecuados, o por los análisis parciales que se centran en una pequeña área de interés. El enfoque sinérgico se presenta aquí combina análisis de imagen que cubre la región entera de la médula ósea, la segmentación automática y reconocimiento de objetos de diversos tipos de células hematopoyéticas y del estroma, análisis de co-local.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Neomicina	Sigma	N6386 SIGMA	Sal hidratada de sulfato de neomicina, códigos de peligro UE: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contiene: 50.000 U.I. de palmitato de retinilo, 5.000 U.I. de coleciferol, 30 mg de acetato de tocoferilo, 100 mg de ácido ascórbico, 1 mg de ácido sórbico, 200 mg de aceite de ricino polioxil 35, 0,5 mg de galato de propilo
Tampón de transferencia (100 ml PBS, 1 ml HEPES 1 M, 50 U/ml penicilina/estreptomicina)	Sigma	P4333, H3375
Hapteno 4-hidroxi-3-nitrofenilacetil conjugado con gammaglobulina de pollo
Gammaglobulina de pollo (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
Solución de paraformaldehído al 20% (grado EM)	Science Services	15713	Códigos de peligro UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
Sacarosa D(+)	Carl Roth	4621.1
Hielo seco
Acetona	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	Códigos de peligro UE: GHS02, GHS07
Hexano	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	Códigos de peligro UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Moldes criogénicos Tissue-Tek (estándar)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Medio de inclusión SCEM de Kawamoto	Section-Lab, JP
Kit de preparación de criosecciones de Kawamoto	Section-Lab, JP
Criofilm tipo 2C(9) de Kawamoto	Section-Lab, JP
Cuchilla para microtomo MX35 premier plus, perfil bajo	Thermo Scientific	3052835	L x A: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), espesor: 0,25 mm (0,01")
Anticuerpo policlonal de conejo anti-RFP, biotinilado	Rockland	600-406-379
Estreptavidina Alexa Fluor 555	Life Technologies	S-32355
Rat anti-MBP	J. y N. Lee		disponible en: J. y N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, EE. UU., clon MT-14.7
Cabra anti-rata-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			producido y conjugado in situ (DRFZ), clon RA3.6B2, Alexa Fluor 594 de Life Technologies
Ratón anti-cadena ligera l1 -FITC			producido y conjugado in situ (DRFZ), clon LS136
Rat anti-cadena ligera k - FITC			producido y conjugado in situ (DRFZ), clon 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro)	Sigma	D9542 SIGMA
Medio de montaje fluorescente	DAKO	S3023
Cubreobjetos (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)	Carl Roth	H875.2
Láminas Superfrost (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Microscopio confocal de barrido láser			equipado con líneas láser de 405, 488, 561, 594, 633 nm y un objetivo de aire de 20X/0,8 NA. Utilizamos un Zeiss LSM710 y el software Zen 2010 versión 6.0.
Herramientas automatizadas de análisis de imágenes para médula ósea	Wimasis, Munich		La herramienta de contacto celular y la herramienta de proximidad celular estarán disponibles a través de Wimasis previa solicitud.
VC2012 runtime	Microsoft		descarga gratuita
Herramienta de simulación para posicionamiento celular aleatorio			disponible de nosotros, previa solicitud
Software de análisis de imágenes con funciones de segmentación de imágenes			Utilizamos Volocity (Perkin Elmer) para medir las distribuciones del tamaño celular de los tipos de células hematopoyéticas en la médula ósea (Figura 5). Alternativas son Definiens Image Analysis (Definiens) o Cell Profiler (descarga gratuita)
Software de análisis de imágenes Fiji			descarga gratuita. Fiji fue utilizado por evaluadores entrenados para el recuento manual de células (Figura 3).