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Artículo de método

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

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DOI:

10.3791/52565

⸱

18 de marzo de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Division, King's College London BHF Centre

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Resumen

La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de vasos dañados y lesionados como resultado de enfermedades cardiovasculares. El protocolo actual presenta una estrategia eficiente y reproducible en la que se pueden generar injertos de vasos de ingeniería tisular funcional utilizando células madre pluripotentes parcialmente inducidas (PiPSC) a partir de fibroblastos humanos. Diseñamos un biorreactor de andamio de vaso descelularizado, que imita de cerca la estructura de la proteína de la matriz y el flujo sanguíneo que existe dentro de un vaso nativo, para la siembra de células endoteliales de PiPSC o células de músculo liso antes del injerto en ratones. Este enfoque demostró ser ventajoso porque los ratones inmunodeficientes injertados con los injertos derivados de PiPSC presentaron una tasa de supervivencia marcadamente mayor 3 semanas después de la cirugía. Este protocolo representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y la terapia celular potencialmente específica del paciente en un futuro próximo.

Introducción

La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de los vasos dañados y heridos resultantes de enfermedades cardiovasculares. Hasta la fecha, los materiales utilizados en la cirugía de injerto biocompatible incluyen polímeros sintéticos (politetrafluoroetileno [teflón], politetrafluoroetileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] o tereftalato de polietileno [Dacron]), aloinjertos, tejido autólogo (pericardio o vena safena) y xenoinjertos 1. Mientras que los injertos artificiales (por ejemplo, Gore-Tex y Dacron) son los más utilizados, estos materiales probablemente causan numerosas complicaciones a corto y largo plazo que incluyen la estenosis, la deposición de calcio, trombo-embolia y las infecciones. Aunque los pacientes con injertos biológicos presentes con una disminución de eventos tromboembólicos, todavía se encuentran con limitaciones, como el fracaso del injerto secundaria y durabilidad acortada debido a la degradación de la calcificación 2. Por lo tanto, a pesar de las mejoras significativas en t quirúrgicaechniques largo de los años, los investigadores y los médicos todavía están cargados con la necesidad de identificar el conducto ideal para enfermedades vasculares. Más recientemente, el campo de la investigación de la ingeniería de tejido vascular ha generado un concepto en el que las células se incorporan en estructuras biodegradables, con el objetivo de crear un entorno biomimético que personifica un recipiente funcional para injerto realizado con éxito 1. Fundamentalmente, el éxito de las construcciones vasculares depende de tres componentes esenciales; las células que componen el andamio, es decir, una capa interna de células endoteliales y una capa de células del músculo liso, un andamio que contiene la matriz extracelular apropiado para proporcionar propiedades mecánicas comparables a la vasculatura nativa, y la señalización molecular / celular que se requiere para iniciar / regulador reparación.

La permeabilidad del injerto a largo plazo y el desarrollo sostenido de los neo-tejidos son altamente dependientes de la siembra de células eficaz de andamios, THereby haciendo que la decisión del tipo de célula de importancia crítica. Varios informes demuestran el uso de endoteliales maduras y las células musculares lisas de diferentes fuentes para desarrollar conductos de pequeño diámetro de 3-6. Aunque prometedores, la falta de vasos autólogos suficiente para obtener endoteliales maduras y las células musculares lisas siguen siendo una carga considerable. Más recientemente, las células madre a partir de diversas fuentes han sido explotados para aplicaciones de ingeniería de tejidos vasculares. Células mononucleares de hecho, las células madre pluripotentes una variedad de tipos de células madre, incluyendo células madre embrionarias 7, inducida (CMPI) 8,9, PIPSC 10,11, derivadas de la médula ósea 12, células madre mesenquimales 13, las células progenitoras endoteliales y la pared del vaso adulto -derivado células madre antígeno-1 (Sca-1) + células madre / progenitoras 14,15 todos se han demostrado que son capaces de diferenciarse en células endoteliales ya sea funcional o de músculo liso en respuesta a los medios de comunicación definidos ycondiciones de cultivo. Además, la capacidad ilimitada de auto renovación de las células madre a tomar mejores candidatos a diferencia endoteliales maduras y las células musculares lisas que sólo se puede dividir por un número finito de veces antes de someterse a la detención del crecimiento y la senescencia.

La selección del material de andamio para generar tejido éxito recipiente diseñado para el injerto depende de varios factores tales como la biocompatibilidad, propiedades biomecánicas, y la velocidad de biodegradación. Fundamentalmente, los materiales utilizados para crear andamios para los injertos deben ser biodegradables y no se montarán las respuestas inmunes receptores innecesario. Además, debe abarcar una porosidad adecuada y la microestructura para la fijación celular y la supervivencia posterior. Hasta la fecha, los materiales más comunes usados ​​para andamios en la ingeniería de tejidos vascular incluyen polímeros de ácido poliglicólico, ácido poliláctico, y poli ε-caprolactona 16. Más recientemente, los materiales biológicos descelularizados tienenTambién ha aplicado con cierto éxito. Varios laboratorios han demostrado que la siembra de los vasos porcina humana descelularizado, canino o con células autólogas proporciona un injerto biológico que resistió la coagulación y la hiperplasia intimal 17-19. Otras estrategias de ingeniería de tejidos vascular incluyen injertos vasculares extracelulares basado proteínas de matriz por ejemplo, células de siembra en gel de fibrina 13 y generando láminas de células sin el apoyo del andamio 20, 21.

El protocolo actual demuestra la diferenciación de PIPSC humano en endotelial funcional y células musculares lisas, la generación de un biorreactor que consiste en un andamio recipiente descelularizado para albergar células vasculares derivadas de PIPSC funcionales, y el injerto de los vasos de ingeniería tisular en la inmunodeficiencia combinada severa (SCID ) ratones. PIPSC son un tipo de célula óptima a utilizar para la ingeniería de tejidos de injertos de vasos ya que estas células no forman tumores en ratones o plantean ético yallo respuestas inmunes. Por otra parte, hemos demostrado que la estrategia para la generación de células musculares Pipa-células endoteliales y Pipa-lisas es eficiente y reproducible 10,11. A partir de entonces, se diseñó un recipiente de descelularizado para la siembra de las células vasculares derivadas de PIPSC para imitar las proteínas de la matriz que existe dentro de un vaso nativo, mejorando así la supervivencia de injerto y la eficacia. Además, la descelularización de los vasos antes de la siembra PIPSC previene la aparición de las respuestas inflamatorias montadas por tipos de células inmunes, tales como macrófagos. Más importante aún, este protocolo no sólo representan una metodología para generar prometiendo conductos vasculares para la traducción a los seres humanos, sino que también proporciona medios valiosos para el estudio y la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la regeneración del tejido vascular a través de modelos de ratón.

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Protocolo

Realice todos los experimentos con animales de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio.

1. Preparación de Medios de Cultivo

  1. Hacer medios de cultivo para la línea celular de fibroblastos humanos CCL-153: F-12K mediana, suero bovino fetal al 10% (FBS) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina.
  2. Hacer reprogramación de medios para la generación de PIPSC: medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (DMEM) que contiene 20% suero sustitución Knockout, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM Medio Esencial Mínimo (MEM) de ácidos no esencial Amino, 10 ng / factor de crecimiento de fibroblastos básico ml 2 (bFGF-2) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina. Añadir bFGF-2 frescos cada vez antes de usar los medios de comunicación.
  3. Hacer Diferenciación Media (DM) para inducir células del músculo liso (SMC) Diferenciación: α-MEM medios que contienen 10% de FBS, Factor de Crecimiento 0,1 mM β-mercaptoetanol, 100 U / penicilina y estreptomicina y 25 ml ng / ml derivado de las plaquetas(PDGF-ββ).
  4. Hacer endotelial Diferenciación Media (EC-DM) para inducir células endoteliales (CE) Diferenciación: medios que contienen 50 ng de crecimiento endotelial medios de comunicación-2 (EGM-2) / ml factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina.

2. Reprogramación fibroblastos humanos en células madre pluripotentes inducidas (parcialmente PIPSC)

  1. Cultura línea celular de fibroblastos humanos CCL-153 en 0.04% de la solución de gelatina frascos revestidos en medio de cultivo.
  2. Células Passage cada 3 días en una proporción de 1: 6. Utilice las células antes del paso 9 para una óptima eficiencia de la generación PIPSC. Las células están listas para la transfección al llegar a 80 - 90% de confluencia.
  3. Linealizar pCAG2LMKOSimO plásmido policistrónico que contiene 4 factores de reprogramación octamer vinculante factor de transcripción 4 (OCT4), Sox2, factor de Kruppel-like 4 (KLF4) y C-MYC (pCAG-OSKM). Digerir 5 g de plásmido con 5 unidades de enzima de restricción PvuI durante 3 horas a 37 ° C. Purificarel plásmido con un kit comercial según el protocolo del fabricante.
  4. Transfectar 2 x 10 6 fibroblastos humanos con 4 g de plásmido pCAG-OSKM linealizado mediante electroporación con el kit de fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) nucleofection según el protocolo del fabricante. Sembrar suavemente las células transfectadas en pre 0,04% de gelatina recubierta matraz T25 que contiene 5 ml de pre-calentado reprogramación de medios.
  5. Después de 24 horas, cambio de medio con suplementos de 25 mg / ml de neomicina para seleccionar una población pura de células transfectadas.
  6. Cambio de medio cada dos días hasta el día 4.
    Nota: Los fibroblastos humanos se convierten en PIPSC después de 4 días de reprogramación.

3. Diferenciación de PIPSC en células endoteliales y musculares lisas

  1. PIPSC Seed en platos de colágeno IV pre-recubiertos que contienen DM durante 4 días para inducir la diferenciación en las SMC. Cambio de medio cada dos días hasta el día 4.
  2. PIPSC Semilla de colágeno IV pre-recubierto platos containing endotelial-DM durante 6 días para inducir la diferenciación en las células endoteliales. Cambie medio cada dos días hasta el día 6.

4. Descelularizado Aorta Preparación del injerto

Nota: Todas las soluciones y equipos deben ser estériles.

  1. Sacrificar el ratón por dislocación cervical y fijar el ratón en una posición supina bajo microscopio de disección.
  2. Corte a través del esternón y alrededor de la caja torácica para abrir la cavidad torácica. Quite el corazón, los pulmones y el esófago para exponer la aorta. Retire con cuidado la grasa peri-aorta con fórceps.
  3. Cortar la aorta desde el extremo anterior con unas tijeras y coloque un lado del extremo con fórceps romos. Separe la aorta de la columna de la columna vertebral por detrás mediante disección roma. Cierre con cuidado todas las arterias de ramificación de la aorta por la ligadura con un electrocoagulador bipolar y el corte desde el otro extremo de la ligadura con unas tijeras.
  4. Utilice una jeringa de 5 ml para limpiar el lumen de la aorta con 3 ml de solución salina que contiene 100 U de heparina para prevenir la formación de coágulos de sangre.
  5. Cortar el extremo posterior de la aorta antes se ramifica en el renal. Mantener la integridad de la aorta es muy importante durante todo el procedimiento.
  6. Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de dodecilsulfato de sodio (SDS) solución de 0,075% diluido en tampón fosfato salino (PBS).
  7. Remojar la aorta torácica en solución de SDS al 0,075% en una placa de Petri de 10 cm. Coloque la placa de Petri en un agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente.
  8. Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de PBS.
  9. Remoje la aorta en PBS en una placa de 10 cm de Petri. Coloque la placa de Petri en el agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm a temperatura ambiente. Actualizar PBS cada 20 minutos.
  10. Enjuague el lumen de la aorta con 5 ml de PBS.
  11. Mantenga injerto aorta descelularizado en PBS a 4 ° C durante un máximo de una semana.

5. Dual Siembra de PIPSC y biorreactor acondicionado

Nota: Todas solución des y el equipo deben ser estériles. Realizar todas las operaciones en una campana de cultivo de tejidos.

  1. Montar el circuito de flujo de biorreactor, como se ilustra en la Figura 1. Conectar cámara de incubación, depósito de medio, la bomba peristáltica y la cámara de cumplimiento de la tubería. Volumen mínimo de medio necesario para la circulación es de 40 ml.
  2. Pre-condición del recipiente descelularizado con medio de cultivo empapando la aorta en un medio de DM en un plato de 10 cm Petri. Coloque la placa de Petri en el agitador orbital durante 1 hora a 50 rpm a temperatura ambiente.
  3. Introduzca 1 cm tubos de nylon de longitud (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) en ambos extremos de la vasija descelularizado bajo el microscopio. Ate el recipiente y los tubos con 8-0 suturas de seda.
  4. Montar el injerto de aorta descelularizado en la cámara de incubación mediante la conexión de los tubos de nylon con los puertos de entrada y salida (1/32 ") de tubos de la pared de la cámara. Mantener cámara de incubación con 5 ml de medio cada vez.
  5. Trypsinize PIPSC añadiendo precalentadotripsina para cubrir la placa de cultivo y el rock suavemente el plato 10 veces. Deseche la tripsina y dejar el plato en la incubadora durante 2 - 3 minutos. Añadir medio de cultivo pre-calentado en el plato y mezclar el medio con las células.
  6. Contar el número de células usando un hemocitómetro. Centrifugar dos alícuotas de suspensiones celulares que contienen 5 x 10 5 células cada uno durante 5 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante por completo.
  7. Después de aspirar el sobrenadante por completo, resuspender 1 pellet de las pepitas sedimentos celulares en 50 l de DM. Inyectar esta suspensión de células en la luz del vaso descelularizados.
  8. A continuación, volver a suspender el sedimento celular otra pips en 100 l de Matrigel. Pipetear con cuidado la mezcla sobre el injerto de aorta descelularizado.
  9. Espere de 10 - 15 min hasta que la mezcla se convierte en un estado similar a un gel uniformemente y se envuelve alrededor de la superficie externa del vaso. Llene la cámara de incubación con DM.
  10. Configuración de lugar en una incubadora de CO2 al 5% todo el biorreactor a 37 ° C. Girar manualmente el injerto descelularizado 90 ° alrededor del eje longitudinal cada media hora en el primero 2 hr.
  11. Mantenga la cultura estática durante 12 horas para permitir la adhesión celular.
  12. Entregar DM a través del lumen por la bomba peristáltica para inducir la diferenciación de células musculares lisas. Iniciar la velocidad de flujo inicial en 5 ml / min y aumento escalonado a 20 ml / min durante 24 hr.
  13. Mantener la tasa de flujo del medio circulante a 20 ml / min durante 24 horas.
  14. Detener el flujo del medio y mover el ajuste de la incubadora biorreactor.
  15. Re-semilla del lumen del injerto con PIPSC. Trypsinize, recuento y centrifugar 1 x 10 6 PIPSC como en los pasos 5.5 a 5.6. Resuspender las células en 50 l de medio EGM-2 que contienen 50 ng / ml de VEGF. Inyectar la mezcla de células en el lumen del injerto.
  16. Cambiar el medio en la cámara de incubación y toda la circulación en EGM-2 medio que contiene 50 ng de VEGF / ml para inducir la diferenciación endotelial.
  17. Mueva retrasando a th el biorreactore incubadora. Gire manualmente el injerto 90 ° cada 30 minutos en las primeras 2 horas y luego mantener una cultura estática durante 12 horas.
  18. Iniciar la circulación de flujo de 5 ml / min y aumento escalonado a 35 ml / min. Mantener el caudal a 35 ml / min durante 5 días. Cambiar circulante y medio cámara de cada dos días.
  19. Se recoge el injerto de ingeniería para su posterior injerto de ratón.

6. El injerto de doble cabeza de serie PIPSC injerto en ratones

  1. Uso NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl ratones macho como receptores de injertos buque. Asegúrese siempre de que los ratones son alrededor de 10 semanas de edad, pesan aproximadamente 25 - 35 g, y se encuentran en buenas condiciones de salud.
  2. Anestesie ratón receptor mediante la administración de una combinación de Hypnorm (25 mg / kg) y Hypnovel (25 mg / kg) por vía intraperitoneal. Aplicar vaselina pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirme anestesia eficiente, garantizando que los ratones tienen los músculos relajados y están respirando constantemente.
    1. Fijar el ratón en una posición supina con su cuello afeitó y extendido. Administrar sulfato de atropina (1,7 mg / kg) en combinación con los anestésicos para asegurar que las vías respiratorias del ratón sigue siendo clara.
  3. Preparar una incisión en la línea media de la mandíbula al esternón del ratón. Bajo un microscopio de disección con 5 a 10 veces la amplificación, levantar las glándulas salivales derecha lateralmente y eliminar el músculo esternocleido- derecho a exponer la arteria carótida común derecha.
  4. Retire con cuidado los tejidos unidos a movilizar a la arteria carótida común derecha desde el extremo distal hacia el extremo proximal. Ligar la porción media de la arteria carótida común dos veces con una sutura de seda 8-0 y disecar entre los dos lazos.
  5. Pasar a través de un manguito de tubo de nylon autoclavable en cada extremo del vaso y fijar cada extremo con pinzas microhemostat.
  6. Quitar el lazo de sutura en un extremo y aplicar una gota de heparina (100 U / ml). Inmediatamente después, invertir el extremo distal del ésimoe arteria para cubrir todo el cuerpo del manguito y fijar el recipiente invertido con una sutura de seda 8-0 en el manguito.
    1. Repetir el mismo procedimiento para la otra porción de la arteria. Arteria Lavar con solución salina para eliminar los coágulos de sangre.
  7. Implantar un injerto de vaso descelularizado entre dos extremos de la arteria carótida por deslizamiento los extremos de los vasos de la descelularizados a través de los puños de la arteria y la fijación con suturas de seda 8-0. Eliminar pinzas vasculares de cualquiera de los extremos antes de evaluar la pulsación del injerto.
  8. Coloque la glándula salival de vuelta a su posición original. Cierre de la piel en la ubicación quirúrgica con una sutura interrumpida usando una sutura de poliglactina 6-0.
  9. Consistentemente observar los signos vitales de ratón después de que se completa el procedimiento, hasta que se reanude la conciencia. Sacrificar los ratones receptores por dislocación y de los vasos de la cosecha injertos cervicales ya sea 24 horas o 3 semanas más tarde para su posterior análisis.

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Resultados

La generación exitosa de PIPSC fue confirmado 4 días después nucleofecting fibroblastos humanos con un plásmido linealizado pCAG2LMKOSimO llevar 4 factores de transcripción, Oct4, SOX2, KLF4 y c-myc (OSKM). PIPSC muestra un fenotipo notablemente distinta en comparación con fibroblastos (Figura 2A) y expresó los 4 factores de reprogramación en el mRNA (Figura 2B) y los niveles de proteína (Figura 2C) 10. La eficacia de un injerto vascular a base de PIPSC es al...

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Discusión

El protocolo actual indica un sonido, la estrategia rápido, simple, eficiente y reproducible en la que los vasos de ingeniería tisular funcionales se pueden generar utilizando PIPSC a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y terapia celular específica del paciente potencialmente en el futuro cercano. Los pasos críticos para garantizar la eficacia del protocolo incluyen la preparación de PIPSC, preparación de injertos aórtico...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Británica del Corazón y la Fundación Oak.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fibroblastos humanos CCL-153ATCCCCL-153Fibroblastos embrionarios humanos prenatales
ATCC F-12K Medio (Modificación de Kaighn del medio F-12 de Ham)ATCC30-2004
Suero fetal bovinoATCC30-2020
Medio DMEM knockout optimizado para células madre embrionariasLife technologies (Gibco)12660-012
Knockout Serum ReplacementLife technologies (Invitrogen)10828-028
Human Basic FGF-2 Miltenyi Biotech130-093-837
medio alpha-MEMTecnologías de vida (Invitrogen)32571093
PDGF humanoR& D System120-HD-001
Solución de gelatina 2%SigmaG1393
Plásmido 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)Addgene20866
  Enzima de restricción PvuINew England BiolabsRO150S
SureClean PlusBiolineBIO-37047
Nucelofection Kit (NHDF Kit)LONZAVPD-1001
NeomicinaSIGMAG418
KL 1500 LCD, Iluminación para microscopía estereoscópicaSCHOTTKL 1500 LCDIluminación de luz fría para microscopía
estereoscópicaNikon Zoom Esterommicroscopio SMZ800NikonSMZ800
Heparina sal sódicaSigmaH3393
10% SDS Solución madre Reactivo de biología molecularSevern BiotechCAS 151-21-3
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoSigmaD8537
Matrigel (10 mg / ml)BDA6661
Agitador IKA Vibrax con plataforma de agitación VX 7 Jepson Bolton's, Janke& KunkelS32-102
Masterflex L/S Accionamiento de bomba digitalCole-ParmerWZ-07523-80
Masterflex L/S Cabezal de bomba de cartucho de 6 canales y 6 rodillosCole-ParmerEW-07519-15
Masterflex L/S cartuchos grandes para cabezal de bombaCole-ParmerEW-07519-75
Masterflex tubo de bomba de silicona curada con platino, L/S 14, 25 piesCole-Parmer WZ-96410-14El tubo pasa a través de la bomba peristáltica
Tubo de silicona de 0,5 mm de diámetro interior, 0,8 mm de diámetro exteriorLos tubos SILEXN / Aconectan la cámara de incubación, el depósito de medios y la cámara de cumplimiento 
Racor Reductor 0.5 a 1.6, polipropileno naturalIbidi10829Adaptador conectar por encima de dos tipos de tubos Tubo de
1/32", ID 0.01" (250µ m) Material: PEEKLabSmithT-132-010PTubería a través de la pared de la cámara de incubación que conecta el injerto con la tubería exterior
Accesorios de una pieza LabSmithT-132-100Fije los tubos anteriores a través de la pared de la cámara de incubación
Tubos de nailon (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm)  de Smiths Medical N/Ainsertan en dos extremos del injerto de aorta
NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl ratónCharles River
Suturas quirúrgicas, 8-0  sedaETHICONW819
HypnormVetapharmVm21757/4000Neuroleptanalgésico para uso en ratones
Hypnovel (Midazolam)Roche59467-70-8Inducción de la anestesia
Microscopio de disecciónCarl ZeissStemi 2000
Tubo de nylonPortex LTD800/200/100/2000,65 mm de diámetro y 1 mm de longitud; para hacer manguito arterial
ElectrocoaguladorMartin SN 54.131Ligadura de ramas de arteria en la aorta
Pinza de microhemostático bipolarMartin80-91-12-04Fijación de los extremos de los vasos
Dilatador de vasosS& TJFX-7
Dilatador de recipienteS& TJFL-3dZ
Dilatadorrecipiente S& TD-5aZ
Mini aplicador AESCULAPFE572K
Micro pinzas hemostáticasAESCULAPFE720K
Suturas quirúrgicas, 6-0 VICRYLETHICONV489
Los tubos se de

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