A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.
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Artículo de método
Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón
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Resumen
Resumen
La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de vasos dañados y lesionados como resultado de enfermedades cardiovasculares. El protocolo actual presenta una estrategia eficiente y reproducible en la que se pueden generar injertos de vasos de ingeniería tisular funcional utilizando células madre pluripotentes parcialmente inducidas (PiPSC) a partir de fibroblastos humanos. Diseñamos un biorreactor de andamio de vaso descelularizado, que imita de cerca la estructura de la proteína de la matriz y el flujo sanguíneo que existe dentro de un vaso nativo, para la siembra de células endoteliales de PiPSC o células de músculo liso antes del injerto en ratones. Este enfoque demostró ser ventajoso porque los ratones inmunodeficientes injertados con los injertos derivados de PiPSC presentaron una tasa de supervivencia marcadamente mayor 3 semanas después de la cirugía. Este protocolo representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y la terapia celular potencialmente específica del paciente en un futuro próximo.
Introducción
La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de los vasos dañados y heridos resultantes de enfermedades cardiovasculares. Hasta la fecha, los materiales utilizados en la cirugía de injerto biocompatible incluyen polímeros sintéticos (politetrafluoroetileno [teflón], politetrafluoroetileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] o tereftalato de polietileno [Dacron]), aloinjertos, tejido autólogo (pericardio o vena safena) y xenoinjertos 1. Mientras que los injertos artificiales (por ejemplo, Gore-Tex y Dacron) son los más utilizados, estos materiales probablemente causan numerosas complicaciones a corto y....
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Protocolo
Realice todos los experimentos con animales de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de Medios de Cultivo
- Hacer medios de cultivo para la línea celular de fibroblastos humanos CCL-153: F-12K mediana, suero bovino fetal al 10% (FBS) y 100 U / ml de penicilina y estreptomicina.
- Hacer reprogramación de medios para la generación de PIPSC: medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (DMEM) que contiene 20% suero sustitución Knockout, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM Medio Esencial Mínimo (MEM) de ácidos no esencial Amino, 10 ng / factor de crecimiento de fib....
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Resultados
La generación exitosa de PIPSC fue confirmado 4 días después nucleofecting fibroblastos humanos con un plásmido linealizado pCAG2LMKOSimO llevar 4 factores de transcripción, Oct4, SOX2, KLF4 y c-myc (OSKM). PIPSC muestra un fenotipo notablemente distinta en comparación con fibroblastos (Figura 2A) y expresó los 4 factores de reprogramación en el mRNA (Figura 2B) y los niveles de proteína (Figura 2C) 10. La eficacia de un injerto vascular a base de PIPSC es al.......
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Discusión
El protocolo actual indica un sonido, la estrategia rápido, simple, eficiente y reproducible en la que los vasos de ingeniería tisular funcionales se pueden generar utilizando PIPSC a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y terapia celular específica del paciente potencialmente en el futuro cercano. Los pasos críticos para garantizar la eficacia del protocolo incluyen la preparación de PIPSC, preparación de injertos aórtico.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Británica del Corazón y la Fundación Oak.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fibroblastos humanos CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Fibroblastos embrionarios humanos prenatales |
| ATCC F-12K Medio (Modificación de Kaighn del medio F-12 de Ham) | ATCC | 30-2004 | |
| Suero fetal bovino | ATCC | 30-2020 | |
| Medio DMEM knockout optimizado para células madre embrionarias | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| medio alpha-MEM | Tecnologías de vida (Invitrogen) | 32571093 | |
| PDGF humano | R& D System | 120-HD-001 | |
| Solución de gelatina 2% | Sigma | G1393 | |
| Plásmido 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| Enzima de restricción PvuI | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomicina | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Iluminación para microscopía estereoscópica | SCHOTT | KL 1500 LCD | Iluminación de luz fría para microscopía |
| estereoscópicaNikon Zoom Esterommicroscopio SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparina sal sódica | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Solución madre Reactivo de biología molecular | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10 mg / ml) | BD | A6661 | |
| Agitador IKA Vibrax con plataforma de agitación VX 7 | Jepson Bolton's, Janke& Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Accionamiento de bomba digital | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S Cabezal de bomba de cartucho de 6 canales y 6 rodillos | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S cartuchos grandes para cabezal de bomba | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex tubo de bomba de silicona curada con platino, L/S 14, 25 pies | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | El tubo pasa a través de la bomba peristáltica |
| Tubo de silicona de 0,5 mm de diámetro interior, 0,8 mm de diámetro exterior | Los tubos SILEX | N / A | conectan la cámara de incubación, el depósito de medios y la cámara de cumplimiento |
| Racor Reductor 0.5 a 1.6, polipropileno natural | Ibidi | 10829 | Adaptador conectar por encima de dos tipos de tubos Tubo de |
| 1/32", ID 0.01" (250µ m) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubería a través de la pared de la cámara de incubación que conecta el injerto con la tubería exterior |
| Accesorios de una pieza | LabSmith | T-132-100 | Fije los tubos anteriores a través de la pared de la cámara de incubación |
| Tubos de nailon (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) | de Smiths Medical N/A | insertan en dos extremos del injerto de aorta | |
| NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl ratón | Charles River | ||
| Suturas quirúrgicas, 8-0 seda | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgésico para uso en ratones |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Inducción de la anestesia |
| Microscopio de disección | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Tubo de nylon | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0,65 mm de diámetro y 1 mm de longitud; para hacer manguito arterial |
| Electrocoagulador | Martin | SN 54.131 | Ligadura de ramas de arteria en la aorta |
| Pinza de microhemostático bipolar | Martin | 80-91-12-04 | Fijación de los extremos de los vasos |
| Dilatador de vasos | S& T | JFX-7 | |
| Dilatador de recipiente | S& T | JFL-3dZ | |
| Dilatador | recipiente S& T | D-5aZ | |
| Mini aplicador | AESCULAP | FE572K | |
| Micro pinzas hemostáticas | AESCULAP | FE720K | |
| Suturas quirúrgicas, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
Referencias
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr
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Etiquetas
Células madre pluripotentes inducidas parcialmenteinjertos de aorta decelularizadoscircuito de flujo de biorreactortécnica de siembra dualprocedimiento de injerto en ratóndiferenciación endotelial del músculo lisoterapia para enfermedades cardiovascularesenfoque de medicina regenerativamodelo de ratón inmunodeficiente
