Hemos desarrollado un hipocampo desplegada in vitro que conserva CA1-CA3 variedad de neuronas. En combinación con la matriz de micro-electrodo de penetración, la actividad neural puede ser monitoreado en ambas las orientaciones longitudinales y transversales. Este método proporciona ventajas sobre las preparaciones de cortes de hipocampo como la propagación en todo el hipocampo se pueden grabar simultáneamente.
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Artículo de método
Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz
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Resumen
Resumen
Este protocolo describe un método para preparar un nuevo en preparación hipocampo plana vitro combinado con una matriz de micro-mecanizado para mapear la actividad neuronal en el hipocampo. La preparación de cortes de hipocampo transversal es la preparación del tejido más común para estudiar la electrofisiología hipocampo. Una rebanada del hipocampo longitudinal también se desarrolló con el fin de investigar las conexiones longitudinales en el hipocampo. El hipocampo del ratón intactas también se pueden mantener in vitro debido a su grosor permite la difusión adecuada de oxígeno. Sin embargo, estas tres preparaciones no proporcionan acceso directo a la propagación de los nervios ya que algunos de los tejidos es falta o doblada. El hipocampo intacto desplegada proporciona tanto transversal y conexiones longitudinales en una configuración plana para el acceso directo al tejido para analizar la extensión completa de propagación de la señal en el hipocampo in vitro. Con el fin de controlar con eficacia la actividad neuronal de tque la capa de células, una costumbre hizo penetrar matriz de micro-electrodo (PMEA) se fabricó y se aplica al hipocampo desplegada. El PMEA con 64 electrodos de 200 m de altura podría registrar la actividad neuronal en el interior de el hipocampo del ratón. La combinación única de una preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva herramienta in-vitro para estudiar la velocidad y la dirección de propagación de la actividad neuronal en las dos dimensiones regiones CA1-CA3 del hipocampo con una elevada relación señal a ruido.
Introducción
La comprensión de la conducción neural o la propagación de señales neuronales es crucial para la determinación del mecanismo de la comunicación neural tanto en la función normal y condiciones patológicas en el cerebro 1-3. El hipocampo es una de las estructuras más ampliamente estudiados en el cerebro, ya que juega papel fundamental en varias funciones cerebrales como la memoria, y el seguimiento espacial y participa en varios cambios patológicos que afectan drásticamente el comportamiento, así 1,6. Aunque, el hipocampo exhibe una organización compleja, los diferentes elementos de su estructura se pueden identificar y acceder en la preparación rebanada 4-6 fácilmente. En la dirección transversal del hipocampo, la actividad neural se conoce para propagar a través de la vía de tri-sináptica que comprenden el giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Se cree que la transmisión sináptica y la conducción axonal juegan un papel importante para communicatien este circuito transversal 4,6. Sin embargo, la propagación de la señal neural tiene lugar tanto en direcciones transversal y longitudinal 4,6. Esto implica que el hipocampo no puede ser completamente investigó mediante el uso de preparaciones rebanada que limitan la observación a una dirección de propagación particular 4. El corte longitudinal se desarrolló para investigar las vías axonales lo largo del eje longitudinal 5. Los investigadores han observado gamma y oscilaciones theta-conducta específica predominantemente a lo largo del ejes transversal y longitudinal respectivamente 6. Estos comportamientos se han estudiado por separado, pero el acceso simultáneo a las dos direcciones es crucial para entender estos comportamientos. Incluso con el desarrollo de la preparación hipocampo intacto, es difícil controlar la propagación a lo largo de todo el tejido debido a la estructura plegada de la hipocampo 4. El hipocampo desplegada proporciona acceso a las neuronas envasadosen una forma de un plano de dos dimensiones 7,8 capa de células.
Desplegando el giro dentado (DG) (Figura 1), el hipocampo adopta una forma aplanada con una configuración rectangular en la que tanto transversal y conexiones longitudinales permanecen intactos con la capa de células piramidales dispuestos en una lámina bidimensional que contiene tanto CA3 y CA1, dejando una pieza plana de tejido neural que se puede utilizar para investigar la propagación neural (Figura 2) 8. La actividad neuronal puede entonces ser monitoreado con pipetas de vidrio individuales, arrays de microelectrodos, electrodos de estimulación, así como colorantes sensibles al voltaje (VSD) 3,7,8. Además, el indicador de tensión codificado genéticamente de ratones transgénicos se puede utilizar para rastrear el patrón de propagación 9.
La configuración plana de la red del hipocampo desplegada es muy adecuado para la grabación método óptico sino también para una matriz de microelectrodos. Ma mayoría de las matrices disponibles en el mercado están fabricados con electrodos perfil plano o baja y puede registrar la actividad neuronal en los dos cortes de tejido y las neuronas cultivadas 10-12. Sin embargo, la relación señal-ruido (SNR) disminuye cuando las señales se obtienen de un tejido intacto desde el soma de las neuronas se encuentra más profunda en el tejido. Se requieren conjuntos de electrodos microelectrodos con altas relaciones de aspecto para mejorar la SNR.
Para este efecto, una matriz de microelectrodos penetrante (PMEA) se ha desarrollado en nuestro laboratorio, y proporciona la capacidad para sondar directamente en el tejido mediante la inserción de espigas 64 con un diámetro de 20 micras y 200 micras de altura en el hipocampo desplegadas 7,13 . Esta matriz de microelectrodos tiene mayor SNR en comparación con la formación de imágenes colorante sensible al voltaje y la SNR se mantiene estable durante un experimento 7,13. La combinación de la preparación del hipocampo desplegada y la PMEA proporciona una nueva manera de invertirIgate la propagación neural sobre un plano de dos dimensiones. Los experimentos utilizando esta técnica ya han dado resultados significativos sobre los mecanismos de propagación de la señal neuronal en el hipocampo mediante el cual la actividad neuronal puede propagarse independientemente de las sinapsis sinápticas o eléctricos 7.
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Protocolo
NOTA: Animal protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la universidad. Ratones CD1 de cualquier sexo a la edad de P10 a P20 se utilizan en este estudio.
1. Soluciones de Cirugía Experimental y grabación
- Preparar tampón normal de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) que contiene (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO3 26, dextrosa 10, y CaCl 2 2. Utilice esta LCRa normal para la recuperación del tejido después de la disección, así como para el sistema de lavado al comienzo del experimento.
- Preparar LCRa sacarosa que se utiliza durante la disección hipocampo y contiene (mM): Sacarosa 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1,3, MgSO4 2, NaHCO3 26, dextrosa 10, y CaCl 2 2. Con el fin de inducir la actividad epileptiforme en la preparación intacta tejido del hipocampo, añadir 4-aminopiridina (4-AP) a LCRa normal ala concentración de 100 mM.
2. Procedimiento quirúrgico para la Intacto Preparación Hippocampus
- Caiga isoflurano (1 ml) a la cámara en el fondo de un frasco de vidrio desecador (No.1 en Materiales y Equipos Específicos) y use una toalla de papel ordinario para cubrir la superficie de la etapa de fondo para que el animal no se interpone en contacto con el líquido. Luego, coloque el ratón CD1 en el frasco y cierre la tapa. Mantenga el animal en el frasco cerrado durante aproximadamente 1 min a 2 min. Cuando la frecuencia de la respiración es de aproximadamente uno por segundo, quite el ratón de la jarra.
- Coloque el ratón en el escenario de la cirugía y decapitar con unas tijeras adecuadas. Inmediatamente después de la decapitación, coloque la cabeza en la enfriado con hielo (3-4 ° C), LCRa sacarosa oxigenada durante aproximadamente 30 seg.
- Con unas tijeras finas (No.5 en Materiales y Equipos Específicos) para eliminar la piel en la parte superior del cráneo y de cortar el cráneo a lo largo de la línea media de la cabeza, así como en los dos extremos cercanos al tempolóbulo ral. Use pinzas (No. 6 en Materiales y Equipos Específicos) para pelar el cráneo corte hacia cada lado de la cabeza con el fin de exponer el cerebro.
- Inserte una espátula de laboratorio micro (No. 8 en Materiales y Equipos Específicos) en el espacio entre los lóbulos parietales del cerebro y el cráneo de pelar cuidadosamente el cerebro desde la parte inferior del cráneo y luego colóquelo en un helado preparado (3 -4 ° C) fase quirúrgica cubierta con papel filtro húmedo (No.2 en Materiales y equipos específicos). Retire el cerebelo con una hoja enfriada con hielo y separar los dos hemisferios mediante la reducción de la línea media del cerebro. Luego, coloque los dos hemisferios separados en un vaso de precipitados lleno con el LCRa sacarosa enfriado con hielo burbujeado con 95% de O2 / 5% de CO 2.
- Tome la mitad del hemisferio y el lugar en el escenario de papel de filtro helada. Coloque toallas de papel normal o papel de filtro alrededor del cerebro para aspirar la solución extra. Utilice dos herramientas de pipeta de vidrio pulido al fuego (No. 10 en Materiales yEquipo) para separar la corteza del resto de la parte central del cerebro.
- Después de que el hipocampo se expone desde el interior de la corteza y se puso la etapa de enfriado en hielo, colocar dos o tres gotas de helado sacarosa LCRa sobre el tejido y luego eliminar la solución adicional alrededor del hipocampo. Cortar las conexiones con la corteza en los dos extremos del hipocampo. Entonces, diseccionar el hipocampo de cerebro con las herramientas de vidrio pulidas al fuego y retirar la parte restante del cerebro.
- Separe todo el hipocampo con el lado de alveus y surco del hipocampo hacia abajo. Caen rápidamente dos o tres gotas de helado sacarosa LCRa sobre el tejido de nuevo y eliminar la solución adicional alrededor del tejido usando un trozo de toalla de papel. Utilice una herramienta de vidrio pulida al fuego a entregar todo el hipocampo para exponer el surco (Figura 1B, C).
- Bajo el microscopio óptico normal, insertar una aguja de vidrio hecho a medida (Nº 11 en específico MateriALS y Equipo) en un extremo del surco y cortar las conexiones de fibra, de giro dentado (DG) para subiculum o el campo CA1, a lo largo de la dirección del surco (Figura 1C). Aplicar una hoja helada para recortar los extremos del tabique y temporales del hipocampo si es necesario. Inserte un asa de alambre de metal por encargo (No. 12 en Materiales y Equipos Específicos) en el surco de corte y tire sobre la DG lejos del tejido mientras sujeta el extremo subiculum / CA1 del hipocampo mediante una herramienta de vidrio pulido fuego (Figura 1D) .
- Siguiendo el procedimiento de despliegue anteriormente, añadir otros dos o tres gotas de la sacarosa LCRa enfriado con hielo sobre el tejido y eliminar la solución adicional alrededor del tejido. A continuación, recortar el hipocampo desplegada con la hoja enfriada con hielo en los bordes (Figura 1E) y coloque la preparación por una espátula en la cámara de recuperación de llenado con LCRa normal y burbujeado con 95% de O2 / 5% de CO 2 a RT (alrededor 25 ° C). Dejarel tejido hipocampo desplegada para recuperar aproximadamente 1 hr antes de colocarlo en la cámara de grabación.
- Tome el otro hemisferio del cerebro y lo utilizan para ir a través de los pasos 2,5 a 2,9. Por lo general, tomar alrededor de 1 a 2 min para terminar todo el procedimiento para desplegar una sola hipocampo y gota fría con hielo sacarosa LCRa continuamente para mantener el tejido oxigenada e hidratada.
Configuración 3. Sistema Experimental
- Pegue un PMEA fabricado a medida en un paquete de pin grid array (PGA) y utilizar micro unión de cables para conectar cada pad de un solo microelectrodos a la almohadilla de un alfiler en el envase (Figura 3B). Luego, inserte el paquete en la toma de una placa de circuito a medida 13.
- Conectar individualmente cada microelectrodo a sus filtros de paso de banda con frecuencia de corte de 1 Hz a 4 KHz y amplificadores con ganancia de 100 en la placa de circuito por encargo 13. Digitalizar la salida analógica de la tarjeta de circuitos por un D conv / Asistema dosificando, y adquirir y almacenar los datos en un ordenador.
- Pegar una cámara de registro de plástico o hechos a medida alrededor de la matriz con tubos de entrada y salida para el flujo de la solución (Figura 4A). Use por lo menos dos botellas para mantener diferentes soluciones en el sistema, y unirse a y controlar el tubo de salida de las botellas por una válvula de tri. Conectar la salida de la válvula tri a un sistema de tubos con una cámara de goteo IV que está guiando la solución en la cámara de grabación.
- Entre la válvula tri-y la entrada de la cámara de grabación, añadir un calentador eléctrico para calentar la solución a una temperatura controlada (35 ° C) antes de que la solución se guía a la cámara de grabación. Coloque la salida de la cámara de grabación para un tubo de vacío para recoger la solución en un matraz conectado tubo de vacío. No reciclar cualquier solución en cualquier experimento en este estudio.
4. Colocación del Desplegado Hippocampus en el PMEA para registrar la actividad neuronal
- Para preparar el montaje experimental, llenar una botella con LCRa normal y otra botella con 4-AP LCRa. En las dos botellas, burbuja 95% de O2 / 5% de CO 2 desde el comienzo de cada experimento. Utilice un conector tri-válvula para controlar qué solución será seleccionado durante un experimento. Conectar un tubo de vacío en la salida de la cámara para bombear la solución en un recipiente de polvo. Calentar la tubería antes de entregarlo a la cámara de grabación y mantener la solución a un nivel de temperatura controlada (35 ° C).
- Cuando la entrada y salida de la cámara de grabación están cerradas, usar un gotero pipeta de vidrio por encargo para transferir y colocar el hipocampo desplegada en la cámara de grabación. Bajo el microscopio, posicionar el hipocampo desplegada con un cepillo pequeño regular de pintura mientras que el tejido está flotando en la solución. Coloque el hipocampo desplegada con el lado de alveus abajo, área CA3 apuntando en dirección opuesta, y el campo CA1 apuntando hacia el investigador.
- Aspirar con cuidado la solución en la cámara utilizando una pipeta de vacío desde el borde de la cámara de grabación para bajar el nivel de la solución hasta que la cámara se seca y el tejido se hace descender sobre la matriz. Luego, coloque un anclaje de tejidos hecho a medida (Figura 4) (Nº 14 en Materiales y Equipos Específicos) en la parte superior del tejido para mantener el hipocampo desplegada sobre la matriz. Ponga unas gotas de solución en la cámara de registro para volver a llenarlo, y poco a poco abrir la entrada y la salida para ajustar la velocidad de flujo a aproximadamente dos gotas por segundo en la cámara de goteo IV.
- Incubar el tejido en la cámara de registro con LCRa normal para alrededor de 1 min para recuperar, a continuación, conmutar el suministro de la solución de 4-AP LCRa disuelto y ajustar la velocidad de flujo correctamente. Incubar el tejido en 4-AP disuelto LCRa durante aproximadamente 5 a 10 minutos y luego el investigador podría iniciar el software para grabar la señal cuando aparece la actividad espontánea.
5. Extracción de laEl tejido de la PMEA Después de un experimento
- Controlar el anclaje de tejidos por un micromanipulador y levantar gradualmente el tejido de la cámara de registro. Apagar tanto de entrada y salida para detener el flujo en la cámara de grabación. La cámara de registro debe estar llena con solución o añadir unas gotas de solución para llenar la cámara si la cámara de grabación no está lleno.
- Utilice un pincel pequeño levantar cada esquina del tejido. Si el tejido no está flotando en la solución, a continuación, emplear el tubo de vacío para secar la cámara cuidadosamente con el tejido todavía sentado en la matriz. A continuación, abra cuidadosamente la entrada para volver a llenar la cámara gradualmente y cerrar la entrada para detener el flujo cuando la cámara de grabación está lleno. Aplicar el pincel pequeño para levantar cada esquina del tejido de nuevo.
- Repita el paso 5.2 hasta que el tejido se separa de la matriz y flotando en la solución. Si el tejido está flotando en la solución, a continuación, utilizar el tubo de vacío para aspirar el pañuelo. Abrir tque fluya en la entrada y abrir el vacío en la toma de corriente. Lave el sistema con agua destilada y secarlo.
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Resultados
Los datos mostrados en las figuras aquí se registraron en la preparación hipocampo desplegada con 4-AP (100 mM) LCRa añadido durante la incubación del tejido en la cámara de registro a TA (25 ° C). Normalmente la actividad comienza a los 5 minutos, pero en algunos tejidos del hipocampo de los animales de más edad puede tomar más tiempo. El disparo neuronal inducida por 4-AP observada con el PMEA es el mismo que se informó anteriormente 14,15. Dado que los electrodos tienen una altura de 200 m, las puntas de l...
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Discusión
El desarrollo de la preparación hipocampo desplegada, donde los ejes longitudinales y transversales del hipocampo se conservan en combinación con una matriz de microelectrodos penetrante, proporciona una poderosa herramienta para investigar las conexiones anatomía o propagación neuronal en el hipocampo 7. Este procedimiento de despliegue es también aplicable para el estudio de hipocampo en ratones adultos. Estudios recientes con esta preparación mostraron que la actividad epileptiforme inducida-4-AP podría pr...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares) Subvención 1R01NS060757-01 y por la cátedra E.L. Lindseth a Dominique M. Durand. Agradecemos al laboratorio del Dr. Andrew M. Rollins por la ayuda en las imágenes de OCT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tarro desecador | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Coloque toallas de papel regulares en el fondo del frasco para uso con anestesia animal. |
| Una cuchilla y una etapa quirúrgica hecha a medida para desplegar el hipocampo | N/A | N/A | Una placa de Petri se coloca boca abajo (en el centro) en el hielo con un papel de filtro húmedo colocado encima de ella. |
| Cámara de recuperación de tejidos hecha a medida | N/A | N/A | Los tubos de plástico se pegaron con malla de plástico en la parte inferior y se burbujearon con un 95% de O2 / 5% de CO2 en el aCSF. |
| Funcionamiento recto Tijeras | Fisher Scientific S17336B | Nº de instrumentos Medco:81995 | Esta tijera se utiliza para Decapita a los ratones. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Tijeras | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | Esta tijera se utiliza para cortar el cráneo de los ratones. |
| Miltex Pinzas de histerectomía | Claflin Equipo médico | CESS-722033-00001 | Esta pinza se utiliza para pelar el cráneo cortado para exponer el cerebro |
| Micro espátula | Cardinal Health | Esta microespátula se utiliza para transferir todo el cerebro de una semiesfera a la cámara de regrabación. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | esta semi micro espátula se utiliza para transferir el hipocampo desplegado al aCSF de glucosa en la cámara de recuperación. | |
| pincel pequeño | Lowe's | tem #: 105657 Modelo #: 90219 | El que tiene el tamaño más pequeño en un paquete de pinceles de pintura normal |
| Herramienta de ayuda de vidrio pulido al fuego | N/A | N/A | Esta herramienta fue pulida al fuego y fabricada con las pipetas de vidrio Pasteur normales. |
| Aguja de vidrio hecha a medida | N/A | N/A | Esta herramienta fue pulida al fuego y fabricada con las pipetas de vidrio Pasteur normales. |
| Herramienta de vidrio hecha a medida con un bucle de alambre de metal | N/A | N/A | Esta herramienta fue pulida al fuego y fabricada con las pipetas de vidrio Pasteur normales con un bucle de alambre de metal remodelado. |
| Gotero de solución de vidrio hecho a medida | N/A | N/A | Esta herramienta fue hecha con las pipetas de vidrio Pasteur regulares con sus puntas cortadas y una cabeza de goma unida con el extremo cortado. |
| Anclaje de tejido hecho a medida | N/A | N/A | La malla de fibra de nailon se pegó en un anillo de alambre de cobre aislado. El anclaje de tejido fue sostenido por un micromanipulador. |
| Matrices de microelectrodos fabricadas a medida | N/A | N/A | Para obtener más detalles sobre la matriz, consulte Kibler, et al, 2011. |
| Circuitos de filtro y amplificadores hechos a medida para la matriz | N/A | N/A | Más detalles sobre la matriz, consulte Kibler, et al, 2011. |
| Procesador de adquisición de datos 3400a | Microstar Laboratories | N/A | Este es un sistema completo de adquisición de datos con convertidor A/D. |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
