Las biopelículas tienen interacciones complejas con su entorno circundante. Para investigar de manera exhaustiva las interacciones entre el biofilm y el medio ambiente, presentamos aquí una serie de métodos para crear un entorno químico heterogéneo para el desarrollo de biopelículas, para cuantificar la velocidad del flujo local y para analizar el transporte de masa dentro y alrededor de las colonias de biopelículas.
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Artículo de método
Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Los biofilms son comunidades microbianas unido a la superficie que tienen estructuras complejas y producen heterogeneidades espaciales significativos. El desarrollo del biofilm está fuertemente regulada por el flujo que rodea y el entorno nutricional. El crecimiento de biopelículas también aumenta la heterogeneidad de la microambiente local mediante la generación de campos de flujo complejos y patrones de transporte de solutos. Para investigar el desarrollo de la heterogeneidad en los biofilms y las interacciones entre los biofilms y su micro-hábitat local, crecimos biofilms mono-especies de Pseudomonas aeruginosa y biofilms de doble especies de P. aeruginosa y Escherichia coli bajo gradientes nutricionales en una celda de flujo de microfluidos. Proporcionamos protocolos detallados para la creación de gradientes de nutrientes dentro de la célula de flujo y para el cultivo y visualizar el desarrollo de biopelículas en estas condiciones. También protocolos actuales para una serie de métodos ópticos para cuantificar patrones espaciales en la estructura de la biopelícula, distri fluirbuciones sobre las biopelículas, y el transporte de masa alrededor y dentro de colonias de biopelícula. Estos métodos son compatibles con una amplia investigación sobre el co-desarrollo de biopelículas y la heterogeneidad de hábitats.
Introducción
Los microorganismos se adhieren a las superficies y formar biopelículas - agregados de células encerradas en una matriz extracelular-polímero 1. Las biopelículas se comportan de manera muy diferente a partir de células microbianas individuales, porque biofilms tienen heterogeneidad espacial dramática resultante de una combinación de limitaciones de transporte de solutos internos y las variaciones espaciales en el metabolismo celular 2,3. Las concentraciones de oxígeno y de nutrientes disminuyen drásticamente en la interfaz entre biofilm y fluido circundante y se agotan más dentro en la biopelícula 2. Las variaciones espaciales en la r....
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Protocolo
Configuración de la célula 1. Flujo y Inoculación
NOTA:. Utilice una celda de flujo de microfluidos de doble entrada se describe en Song et al, 2014 14 para crecer biopelículas. Esta celda de flujo es capaz de crear gradientes químicos lisas bien definidos. El diseño de la célula de flujo se muestra en la figura 1 y el flujo de fabricación de células se ha descrito anteriormente en Song et al., 2014 14. Aquí detalle nuestros métodos mediante el uso de P. aeruginosa y E. coli para formar biopelículas, pero otras especies puede ser adecuado también. Se utilizó....
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Resultados
La celda de flujo microfluídico de doble entrada permite la observación del crecimiento del biofilm en virtud de un gradiente químico bien definido formado por la mezcla de dos soluciones dentro de la cámara de flujo. El gradiente químico resultante se observó anteriormente por inyección de colorante y caracteriza en detalle por Song et al. 14. Gradientes de concentración lisas se formaron en la dirección transversal, como se muestra en la Figura 1. El perfil de concentración era emp.......
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Discusión
Hemos demostrado una serie de métodos para caracterizar tres importantes interacciones biofilm-ambiente: respuesta biofilm a gradientes químicos, los efectos de la formación de biopelículas en el microambiente que rodea el flujo, y la heterogeneidad biofilm resultante de las limitaciones de transporte interno.
En primer lugar, demostramos el uso de una celda de flujo de microfluidos novedoso para imponer un gradiente químico bien definido para el desarrollo de biopelículas. Para generar un g.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a Matt Parsek en la Universidad de Washington (Seattle, WA) para proporcionar P. aeruginosa y E. cepas de E. coli y Roger Nokes de la Universidad de Canterbury (Nueva Zelanda) para proporcionar acceso a software Arroyos. Este trabajo fue apoyado por el subsidio R01AI081983 de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Confocal de imágenes se realizó en las instalaciones de la Northwestern Imaging Biológica (BIF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bomba peristáltica | Gilson | Miniplus 3 | Configuración de celda de flujo e inoculación |
| Tubo de bomba 0.50 mm OVC, Naranja/Amarillo | Gilson | F117934 | Configuración e inoculación de la celda |
| de flujo Llave de paso de tres vías con cerradura Luer macho giratoria | Smiths Medical | MX9311L | Configuración e inoculación de celdas de flujo |
| Sylgard 184 Encapsulación de celdas solares para la fabricación de paneles solares | ML Solar LLC | Configuración e inoculación de celdas de flujo | |
| Pyrex Botella mediana, 1 L, GL45 | VWR | 16157-191 | Configuración e inoculación de la célula |
| de flujo C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Configuración e inoculación de la célula de flujo |
| Jeringa de TB de 1 ml | BD | 309659 | Configuración e inoculación de la célula de flujo |
| Tubo de polímero | IDEX | 1520G | Configuración e inoculación de la célula de flujo |
| Adaptador estéril Intramedic Luer Stub Clay | Adams | 427564 | Configuración e inoculación de la celda |
| de flujo PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Configuración e inoculación de la celda de flujo |
| Espectrofotómetro | HACH | Configuración e inoculación de la celda de flujo | |
| Filtros de jeringa estériles (0.2 μ m) | Fisherbrand | 09-719A Configuración e | inoculación de la celda de flujo |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Configuración e inoculación de la celda de flujo | |
| Sulfato de amonio | Sigma Aldrich | A4418 | Medios de crecimiento |
| Fosfato de sodio dibásico anhidro | Sigma Aldrich | RES20908-A7 Medios de | crecimiento |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma Aldrich | P5655 | Sustrato |
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S7653 | Sustrato |
| Cloruro de magnesio | Sigma Aldrich | M8266 | Sustrato |
| Cloruro de calcio | Sigma Aldrich | C5670 | Sustrato |
| Sulfato de calcio dihidratado | Sigma Aldrich | C3771 | Sustrato |
| Sulfato de hierro (II) heptahidratado | Sigma Aldrich | 215422 | Sustrato |
| Sulfato de manganeso (II) monohidratado | Sigma Aldrich | M7634 | Sustrato |
| Sulfato de cobre (II) | Sigma Aldrich | 451657 | Sustrato |
| Sulfato de zinc heptahidratado | Sigma Aldrich | Z0251 | Sustrato |
| sulfato de cobalto (II) heptahidratado | Sigma Aldrich | C6768 | Sustrato |
| Molibdato sódico | Sigma Aldrich | 243655 | Sustrato |
| Ácido bórico | Sigma Aldrich | B6768 | Sustrato |
| Dextrosa | Sigma Aldrich | D9434 | Sustrato |
| Luria Bertani Caldo | Sigma Aldrich | L3022 | Sustrato |
| TCS SP2 Microscopía confocal | Leica | Fluorescente | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Imágenes fluorescentes |
| Cy5 | GE Healthcare Ciencias de la vida | PA15100 | Imágenes fluorescentes |
| Fluorescente rojo (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Imágenes fluorescentes |
| BioSPA | Packman Lab | Procesamiento de imágenes | |
| ImageJ | Procesamiento de imágenes | los NIH | |
| Volocity | PerkinElmer | ||
| Flujos de procesamiento de imágenes 2.02 | Universidad de Cantebury | Procesamiento de imágenes |
Referencias
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 19....
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Reimpresiones y permisos
