Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad

Resumen

Las biopelículas tienen interacciones complejas con su entorno circundante. Para investigar de manera exhaustiva las interacciones entre el biofilm y el medio ambiente, presentamos aquí una serie de métodos para crear un entorno químico heterogéneo para el desarrollo de biopelículas, para cuantificar la velocidad del flujo local y para analizar el transporte de masa dentro y alrededor de las colonias de biopelículas.

Resumen

Los biofilms son comunidades microbianas unido a la superficie que tienen estructuras complejas y producen heterogeneidades espaciales significativos. El desarrollo del biofilm está fuertemente regulada por el flujo que rodea y el entorno nutricional. El crecimiento de biopelículas también aumenta la heterogeneidad de la microambiente local mediante la generación de campos de flujo complejos y patrones de transporte de solutos. Para investigar el desarrollo de la heterogeneidad en los biofilms y las interacciones entre los biofilms y su micro-hábitat local, crecimos biofilms mono-especies de Pseudomonas aeruginosa y biofilms de doble especies de P. aeruginosa y Escherichia coli bajo gradientes nutricionales en una celda de flujo de microfluidos. Proporcionamos protocolos detallados para la creación de gradientes de nutrientes dentro de la célula de flujo y para el cultivo y visualizar el desarrollo de biopelículas en estas condiciones. También protocolos actuales para una serie de métodos ópticos para cuantificar patrones espaciales en la estructura de la biopelícula, distri fluirbuciones sobre las biopelículas, y el transporte de masa alrededor y dentro de colonias de biopelícula. Estos métodos son compatibles con una amplia investigación sobre el co-desarrollo de biopelículas y la heterogeneidad de hábitats.

Introducción

Los microorganismos se adhieren a las superficies y formar biopelículas - agregados de células encerradas en una matriz extracelular-polímero ^1. Las biopelículas se comportan de manera muy diferente a partir de células microbianas individuales, porque biofilms tienen heterogeneidad espacial dramática resultante de una combinación de limitaciones de transporte de solutos internos y las variaciones espaciales en el metabolismo celular ^2,3. Las concentraciones de oxígeno y de nutrientes disminuyen drásticamente en la interfaz entre biofilm y fluido circundante y se agotan más dentro en la biopelícula ^2. Las variaciones espaciales en la respiración de biopelículas y la síntesis de proteínas también pueden ocurrir como respuesta al oxígeno localizada y la disponibilidad de nutrientes ^2.

En los ambientes acuáticos y del suelo, la mayoría de las bacterias viven en los biofilms. Biofilms naturales llevan a cabo importantes procesos biogeoquímicos incluyendo el ciclo del carbono y nitrógeno y reduciendo metales ^4,5. Clínicamente, la formación de biopelículas es responsble para pulmonar prolongada e infecciones urinarias ^6. Infecciones biofilm asociado son muy problemático porque las células en biofilms tienen muy alta resistencia a los antimicrobianos en comparación con sus homólogos planctónicas ^6. Debido a que las biopelículas son importantes en diversos entornos, una cantidad sustancial de investigación se ha centrado en la comprensión de los factores ambientales que controlan las actividades de biofilm y la heterogeneidad espacial en biofilms y el microambiente que rodea.

Estudios previos han encontrado que el desarrollo de biopelículas está fuertemente regulada por una serie de factores ambientales: biopelículas se desarrollan diferentes morfologías en diversas condiciones de flujo; oxígeno y nutrientes disponibilidad influencia morfología de la biopelícula; y la tensión de cizallamiento hidrodinámico afecta a la unión de las células planctónicas a las superficies y el desprendimiento de las células de las biopelículas ^7-9. Por otra parte, el estado de flujo externo influye en la entrega de los sustratos into y dentro de los biofilms ^10. El crecimiento de biofilms también altera rodea condiciones físicas y químicas. Por ejemplo, el crecimiento de biopelículas conduce a la reducción local de oxígeno y nutrientes ^2; biofilms se acumulan compuestos inorgánicos y orgánicos desde el ambiente circundante ^11; y grupos de biofilm desvían el flujo y el aumento de superficie de fricción ^12,13. Debido a que las biopelículas interactúan con su entorno de maneras muy complejas, es fundamental para obtener simultáneamente información sobre las propiedades del biofilm y las condiciones ambientales, y los enfoques multidisciplinarios necesita ser utilizado para caracterizar exhaustivamente interacciones biofilm y medio ambiente.

Aquí les presentamos una serie de métodos integrados para caracterizar los patrones espaciales en el crecimiento microbiano en mono-especies y biofilms de doble especies bajo un gradiente nutricional impuesta, y observar la consiguiente modificación de la química local y microambiente fluido. Nos FIRst describen el uso de una celda de flujo microfluídico de doble entrada recientemente desarrollado para observar el crecimiento de biopelícula bajo gradientes químicos bien definidos. A continuación, demuestran el uso de esta celda de flujo de microfluidos para observar el crecimiento de dos especies de bacterias, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, en biofilms bajo un rango de condiciones nutricionales. Se muestra cómo en la visualización in situ de propagación trazador fluorescente en colonias de biopelícula puede ser utilizado para evaluar cuantitativamente los patrones de transporte de solutos en biofilms. Por último, se muestra cómo microescala velocimetría de seguimiento de partículas, realizado con microscopía confocal, se puede utilizar para obtener el campo de flujo local alrededor de las biopelículas que crecen.

Protocolo

Configuración de la célula 1. Flujo y Inoculación

NOTA:. Utilice una celda de flujo de microfluidos de doble entrada se describe en Song et al, 2014 ¹⁴ para crecer biopelículas. Esta celda de flujo es capaz de crear gradientes químicos lisas bien definidos. El diseño de la célula de flujo se muestra en la figura 1 y el flujo de fabricación de células se ha descrito anteriormente en Song et al., 2014 ^14. Aquí detalle nuestros métodos mediante el uso de P. aeruginosa y E. coli para formar biopelículas, pero otras especies puede ser adecuado también. Se utilizó P. aeruginosa PAO1- gfp, que expresa constitutivamente una proteína fluorescente verde (GFP), como un organismo modelo para el desarrollo de biopelículas. Además, se utilizó E. coli DH5a para formar biopelículas de especies mixtas con P. aeruginosa. P. aeruginosa y E. cepas de E. coli se cultivaron en placas de agar LB.

1. Prepare la celda de flujo usando polidimetilsiloxano (PDMS) unido a uncubreobjetos de vidrio a través del tratamiento con plasma de oxígeno como se describe en ^14. Las dimensiones de la cámara de celda de flujo son 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (longitud x anchura x profundidad).
2. Preparar modificado medio de crecimiento FAB ^15. Para observar el crecimiento de biopelícula bajo un gradiente nutricional dentro de la celda de flujo, la introducción de Fab modificado medio ¹⁵ con glucosa 0,6 mM en una entrada y introducir medio FAB sin ninguna fuente de carbono a través de la otra entrada. Filtro-esterilizar (tamaño de poro = 0,2 micras) la solución de glucosa de valores (60 mM) antes de añadir al medio de FAB. También autoclave el medio FAB con el ciclo 1 (líquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) antes de su uso.
3. Esterilizar el sistema de flujo. Antes de la inoculación, autoclave toda la trayectoria de flujo (botellas medianas, tubos, trampas de burbujas, las células de flujo) usando el ciclo 1, a excepción de las válvulas de tres vías de plástico desechables (y pre-esterilizados) situados aguas arriba de la celda de flujo. (Válvulas de tres formas se utilizan para inyectar células cultura, trazador fluorescente y microperlas.) Para evitar la contaminación durante el montaje, cubre todas las aberturas de tubos y conectores con papel de aluminio o bolsas de autoclave antes de la esterilización en autoclave.
4. Conectar el sistema de flujo. Montar los componentes del sistema de celda de flujo cuidadosamente (ver video para el montaje sistema de flujo) y entregar medio de crecimiento a la célula de flujo a través de una bomba peristáltica que controla con precisión la velocidad de flujo.
5. Preparar el cultivo de células para la inoculación mediante la transferencia de una colonia de P. aeruginosa o E. coli a partir de placas de LB a 3 ml de caldo LB y agitar el cultivo O / N a 225 rpm y 37 ° C. Diluir los cultivos de células S / N en 1 ml esterilizados agua a una DO final ₆₀₀ = 0,01 como el inóculo. (Cultura y diluir las bacterias en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.)
6. Para los experimentos con las biopelículas de especies mixtas, diluir los dos cultivos bacterianos a una relación de 1: 1 en 1 ml con una DO ₆₀₀ = 0,01 equivalente para cada bacteria.
7. Inocular la celda de flujo. Inyectar 1 ml de inóculo a la entrada de la celda de flujo de la válvula de tres vías. Después de la inyección, una pausa en el flujo durante 1 hora para permitir que las células bacterianas que se adhieren a la cubierta de vidrio. (Asegúrese de que la celda de flujo se coloca con el lado cubreobjetos hacia abajo para permitir que las células suspendidas se asienten en el cubreobjetos.)
8. Después de 1 hr, reanudar el flujo y bombear el medio de crecimiento a la célula de flujo a una velocidad constante de 0,03 ml / min para cada entrada durante 3 días.

2. Caracterización de Biofilm Desarrollo en respuesta a gradientes de nutrientes Utilizando Microscopía Confocal

NOTA: P. aeruginosa se ​​pueden obtener imágenes con GFP expresada constitutivamente, pero E. coli en las biopelículas de especies mixtas debe ser imaginada por counterstaining.

1. Tenga en cuenta las biopelículas de 3 días usando microscopía confocal. Para los resultados representativos, observar biofilms utilizando un microscopio confocal con un objetivo 63X. Antes de la proyección de imagen, marcala célula de doble entrada de flujo con una rejilla en el lado de cubierta de vidrio. (El propósito de esta rejilla es permitir que el experimentador para localizar las regiones de formación de imágenes dentro de la cámara de la celda de flujo.)
2. Para contrateñir, diluir 10 l de rojo fluorescente colorante de ácidos nucleicos de células permeante, tales como mancha nucleico fluorescente verde ácido, tal como STYO 62, solución madre (1 mM) en 990 l de agua esterilizada y luego inyectar lentamente la mancha diluida utilizando una jeringa en la cámara de la celda de flujo de la válvula de tres vías aguas arriba. Mantenga la celda de flujo estancado y en la oscuridad durante 30 min, luego reanudar el flujo para lavar la mancha no unida durante 15 min.
3. Realizar imagen confocal. Active el 488 nm láser de argón para la excitación y la emisión de canales de recogida de las buenas prácticas agrarias (500-535 nm) y la mancha de ácido nucleico (por colorante de ácidos nucleicos fluorescente verde, 650-750 nm). Ajustar las ganancias y las compensaciones para los dos canales para tener imágenes brillantes y limpias. Seleccione xyz y el modo de imágenes simultáneas. Utilice el mando de control de z para identificar la parte inferior y la parte superior de la biopelícula en el campo. Ajuste el z-paso para 0,5 micras para la adquisición de una imagen pila 3-D. (Para garantizar una alta calidad de imagen, utilice un promedio de la línea de cuatro para la adquisición de imágenes.)
4. Para asignar los patrones espaciales de desarrollo de la biopelícula dentro de la celda de flujo, las biopelículas de la imagen en tres o más longitudinal (x) las distancias a lo largo de la entrada de la celda de flujo, y a las tres transversal (y) posiciones relativas al gradiente nutricional impuesta, como se muestra en la Figura 1 .

3. Caracterización de solutos Interna Transporte por inyecciones de trazador fluorescente Conservador

NOTA: Un indicador fluorescente conservador, como Cy5, puede ser utilizado para caracterizar los patrones de transporte de solutos dentro de la biopelícula.

1. Disolver Cy5 (Mono-reactiva NHS Ester) en agua a una concentración final de 10 mg / ml como una solución madre. La solución madre, Cy5 en un congelador a -20ºC.
   NOTA: Como Cy5 es luz-sensitive, almacenar, diluir e inyectar soluciones Cy5 en la oscuridad.
2. Antes de las inyecciones de trazador fluorescente, tomar una imagen de la pila 3-D de la biopelícula de 3 días con la microscopía confocal (con un objetivo 63X). (Regiones anchas de colonias biofilm son ideales para las observaciones de series de tiempo de transporte de tinte.) También elegir un plano z con colonias bien separadas para imágenes (como se muestra en la Figura 5A).
3. Para cada experimento de inyección Cy5, diluir 2 l de la solución madre Cy5 en 998 l de agua esterilizada para producir una solución de inyección que tiene una concentración Cy5 de 20 mg / ml.
4. Parar la bomba para pausar el flujo e inyectar la solución en el Cy5 aguas arriba de la celda de flujo usando una jeringa a través de la válvula de 3 vías. (Es importante para evitar las burbujas de aire entren en la trayectoria de flujo mientras se inyecta. Trampas de burbujas deben mantenerse abierta durante la inyección de nuevo.)
5. Después de inyectar la solución Cy5, cerrar las trampas de burbujas, ajuste la válvula de 3 vías, y reinicie elbomba para suministrar la solución Cy5 se inyecta en la celda de flujo.
6. Cambiar el modo de imagen confocal para XYT. Activar canales Cy5 y GFP bajo el modo de imágenes simultáneas. Ajustar la configuración confocal en intensidad Cy5 (intensidad del láser, la ganancia y offset) para evitar la saturación de señales, lo cual es crítico para la cuantificación. (Se prefiere alta resolución temporal para la visualización de penetración del colorante. Sin embargo, el escaneo rápido disminuye la calidad de la imagen.) Elija la velocidad de exploración adecuada y media línea para equilibrar el tiempo de resolución de la imagen y la calidad de imagen. Para este protocolo utilizar un promedio de la línea de cuatro y una velocidad de 0,15 Hz.
7. Reanudar el flujo para entregar Cy5 en la célula de flujo (todavía a un caudal de 0,03 ml / min). Al mismo tiempo la hora de inicio de la serie de imagen confocal.
8. Cuantificar la penetración Cy5 por radialmente promedio de intensidad Cy5 dentro de una colonia biofilm circular 2-D. Para promedio, primero identificar el borde de un clúster de biofilm, a continuación, generar un mapa de distancia para una sección de 2-D de la agrupaciónY, finalmente, los patrones radiales promedio de las intensidades de Cy5 para generar una curva de penetración (véase la figura 6).
   1. Para darse cuenta computacionalmente paso 3.8, utilice Biospa (Análisis del patrón espacial Biofilm) paquete de software (no publicado, paquete de software y manual disponibles bajo petición) u otros programas de análisis de imágenes.
   2. Para utilizar Biospa, primero importar una imagen definida en Biospa. A continuación, seleccione el umbral adecuado para los canales de las buenas prácticas agrarias y Cy5 para que las imágenes binarias. En el menú de análisis / cálculo, seleccione Análisis Avanzado y luego Análisis Difusión. Utilice el canal de las buenas prácticas agrarias para definir el borde de un clúster y utilizar la herramienta de polígono para seleccionar un clúster como la región de interés (ROI).
   3. Haga doble clic en el cluster biofilm seleccionado para realizar el análisis de la difusión. Guardar los resultados del análisis de difusión y calibrar la intensidad de Cy5 a la concentración de Cy5 usando una curva de calibración.
      1. Para generar Cy5 curva de calibración de concentración, medir intensidades de Cy5 sobre un conce Cy5gradiente ntration bajo microscopía confocal. (Intensidad Cy5 y la concentración tienen una relación lineal.)

4. Caracterización de la Rodeando Flow Field de Seguimiento fluorescente Partículas

NOTA: Las partículas fluorescentes, como microperlas fluorescentes, se puede utilizar para caracterizar el campo de flujo alrededor de las biopelículas. Campo de flujo alrededor de biofilms puede calcularse a partir de las observaciones de series de posiciones de las partículas que utilizan el software de seguimiento de partículas velocimetría. Los resultados mostrados aquí fueron obtenidos con el software Streams 2.02 paquete de ¹⁶ (descarga de software y guía del usuario disponible en http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

1. Diluir las microperlas fluorescentes (diámetro ~ 1 mM) en agua esterilizada a una concentración de sólidos final de 0,2% y un volumen final de 0,5 ml. Vortex para asegurarse de que las microperlasson bien dispersado.
2. Inyectar y entregar las microperlas fluorescentes diluido en la celda de flujo siguiendo los procedimientos de los pasos 3.3 a 3.5. Para permitir un seguimiento preciso de la trayectoria de la partícula, utilice una tasa relativamente baja de flujo (0,01 ml / h para los resultados de rastreo de partículas en este documento).
3. Cambie la configuración confocal al modo XYT para seguir el movimiento de las partículas en un z-slice y tomar imágenes de series de tiempo. (A la velocidad de fotogramas de 1 Hz se utilizó para los resultados representativos que se muestran en este documento.) Repetir la inyección de partículas y la imagen en diferentes lugares z para generar flujo de campo 3-D.
4. Pre-proceso de la serie temporal de imágenes confocal restando la señal de fluorescencia de fondo (la señal en la primera imagen adquirida del conjunto de imágenes) utilizando ImageJ (descargar el software y el manual disponible en http://imagej.nih.gov/ij/ ) u otros programas.
5. En ImageJ, abrir la primera imagen de un conjunto de imágenes y luego importar el conjunto de imágenes. Bajo Proceso / Imagen Calculator, reste la primera imagen de la imagen de conjunto. Guarde el conjunto de imágenes pre-procesado.
6. Para calcular los vectores de flujo, la importación de series de tiempo confocal de imágenes en Streams 2.02. En "vista del proceso abierto", seleccionar y ejecutar "Identificar partículas". Utilice umbral adecuado para identificar partículas. Utilice 0,5 y 5 micras de diámetro como umbrales mínimos y máximos de 1 micras partículas.
7. A continuación, en "vista del proceso abierto", seleccionar y ejecutar "análisis de tuberías PTV" para generar trayectorias de las partículas. Compruebe las trayectorias de las partículas para ver si representan el movimiento de las partículas. Por último, seleccionar y ejecutar "Crear campo de velocidad" para generar un mapa vectorial de flujo.

Resultados

La celda de flujo microfluídico de doble entrada permite la observación del crecimiento del biofilm en virtud de un gradiente químico bien definido formado por la mezcla de dos soluciones dentro de la cámara de flujo. El gradiente químico resultante se observó anteriormente por inyección de colorante y caracteriza en detalle por Song et al. ^14. Gradientes de concentración lisas se formaron en la dirección transversal, como se muestra en la Figura 1. El perfil de concentración era emp...

Discusión

Hemos demostrado una serie de métodos para caracterizar tres importantes interacciones biofilm-ambiente: respuesta biofilm a gradientes químicos, los efectos de la formación de biopelículas en el microambiente que rodea el flujo, y la heterogeneidad biofilm resultante de las limitaciones de transporte interno.

En primer lugar, demostramos el uso de una celda de flujo de microfluidos novedoso para imponer un gradiente químico bien definido para el desarrollo de biopelículas. Para generar un g...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba peristáltica	Gilson	Miniplus 3	Configuración de celda de flujo e inoculación
Tubo de bomba 0.50  mm OVC, Naranja/Amarillo	Gilson	F117934	Configuración e inoculación de la celda
de flujo Llave de paso de tres vías con cerradura Luer macho giratoria	Smiths Medical	MX9311L	Configuración e inoculación de celdas de flujo
Sylgard 184 Encapsulación de celdas solares para la fabricación de paneles solares	ML Solar LLC		Configuración e inoculación de celdas de flujo
Pyrex Botella mediana, 1  L, GL45	VWR	16157-191	Configuración e inoculación de la célula
de flujo C-FLEX Tubing	Cole-Parmer	06422-02	Configuración e inoculación de la célula de flujo
Jeringa de TB de 1 ml	BD	309659	Configuración e inoculación de la célula de flujo
Tubo de polímero	IDEX	1520G	Configuración e inoculación de la célula de flujo
Adaptador estéril Intramedic Luer Stub Clay	Adams	427564	Configuración e inoculación de la celda
de flujo PrecisionGlide Needle	BD	305195	Configuración e inoculación de la celda de flujo
Espectrofotómetro	HACH		Configuración e inoculación de la celda de flujo
Filtros de jeringa estériles (0.2 μ m)	Fisherbrand	09-719A Configuración e	inoculación de la celda de flujo
MAXQ Shaker	Thermo Scientific		Configuración e inoculación de la celda de flujo
Sulfato de amonio	Sigma Aldrich	A4418	Medios de crecimiento
Fosfato de sodio dibásico anhidro	Sigma Aldrich	RES20908-A7 Medios de	crecimiento
Fosfato de potasio monobásico	Sigma Aldrich	P5655	Sustrato
Cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S7653	Sustrato
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M8266	Sustrato
Cloruro de calcio	Sigma Aldrich	C5670	Sustrato
Sulfato de calcio dihidratado	Sigma Aldrich	C3771	Sustrato
Sulfato de hierro (II) heptahidratado	Sigma Aldrich	215422	Sustrato
Sulfato de manganeso (II) monohidratado	Sigma Aldrich	M7634	Sustrato
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	451657	Sustrato
Sulfato de zinc heptahidratado	Sigma Aldrich	Z0251	Sustrato
sulfato de cobalto (II) heptahidratado	Sigma Aldrich	C6768	Sustrato
Molibdato sódico	Sigma Aldrich	243655	Sustrato
Ácido bórico	Sigma Aldrich	B6768	Sustrato
Dextrosa	Sigma Aldrich	D9434	Sustrato
Luria Bertani Caldo	Sigma Aldrich	L3022	Sustrato
TCS SP2 Microscopía confocal	Leica		Fluorescente
SYTO 62	Life Technology	S11344	Imágenes fluorescentes
Cy5	GE Healthcare Ciencias de la vida	PA15100	Imágenes fluorescentes
Fluorescente rojo (580/605) FluoSphere	Life Technology	F-8801	Imágenes fluorescentes
BioSPA	Packman Lab		Procesamiento de imágenes
ImageJ	Procesamiento de imágenes	los NIH
Volocity	PerkinElmer
Flujos de procesamiento de imágenes 2.02	Universidad de Cantebury		Procesamiento de imágenes