Manchas de sangre seca - preparación y procesamiento para su uso en inmunoensayos y en técnicas moleculares

Resumen

La preparación y tratamiento de manchas de sangre seca (DBS) para su análisis final son todavía poco estandarizados para diagnóstico mayoría de las aplicaciones. Para superar esta deficiencia, un completo protocolo paso a paso se sugiere y posteriormente evaluado en cuanto a su eficacia para la detección de marcadores de las infecciones virales.

Resumen

La idea de recolectar sangre en una tarjeta de papel y posteriormente usando las manchas de sangre seca (DBS) para el diagnóstico que se originó hace un siglo. Desde entonces, DBS pruebas por décadas se ha mantenido predominantemente centrado en el diagnóstico de enfermedades infecciosas especialmente en contextos de recursos limitados o sistemática de los recién nacidos para trastornos metabólicos hereditarios y sólo recientemente tienen una variedad de nuevas e innovadoras aplicaciones de DBS comenzadas a surgir. Durante muchos años, sólo inadecuadamente se consideraron variables pre analíticas en el campo de pruebas de DBS y aún hoy, con excepción de recién nacidos cribado, la fase pre-analítica completa, que comprende la preparación y procesamiento de DBS para su definitiva no se ha estandarizado. Dado este contexto, un amplio protocolo paso a paso, que cubre a las fases esenciales, se propone, es decir, acumulación de sangre; preparación de manchas de sangre; secado de manchas de sangre; almacenamiento y transporte de DBS; elución de DBS y finalmente análisis de eluatos DBS. La eficacia de este protocolo fue evaluada primero con pares acoplados 1.762 suero/DBS para la detección de marcadores de virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y las infecciones del virus de inmunodeficiencia humana en una plataforma analítica automatizada. En un segundo paso, el protocolo se utilizó durante un estudio piloto, que se llevó a cabo sobre los usuarios de droga activa en las ciudades alemanas de Berlín y Essen.

Introducción

La idea de utilizar sangre recogidas en una tarjeta de papel de celulosa se atribuye a Ivar Christian Bang (1869-1918), el padre de moderno microanálisis clínicos^{1, 2}. En 1913, Bang determinó glucosa de eluatos de sangre seca manchas (DBS)³ y, posteriormente, también realizadas mediciones de nitrógeno utilizando el método de Kjeldahl con esta técnica de papel de filtro². Posteriormente, varios investigadores informaron sobre el uso de DBS para prueba serológica para diagnosticar sífilis². Como temprano como en 1924, Chapman resume las ventajas de la DBS prueba cuando particularmente destacó cuatro elementos, que siguen siendo válidas hoy: punción venosa en comparación con convencional (1), se requiere menos volumen de sangre y este hecho fue más importante en Pediatría diagnóstico; (2) colección de la sangre es simple, no invasivo y de bajo costo; (3) el riesgo de contaminación bacteriana o de hemólisis es mínimo; y (4) DBS pueden ser conservados durante largos períodos con casi ninguna deterioración de los analitos^{2, 4}. Además de su uso en las pruebas para sífilis, otras primeras aplicaciones de la técnica DBS incluyen, por ejemplo, la detección de anticuerpos contra sarampión, paperas, poliomielitis, virus de parainfluenza y virus sincitial respiratorio (VSR) en 1953², la identificación de Shigella en heces secas sobre papel de filtro y enviados por correo ordinario a Indonesia a Leiden en los países bajos, así como la detección de anticuerpos contra Schistosoma en DBS en áreas endémicas y analizado más de tres meses más tarde⁵ . En 1963, cincuenta años después de la explosión original comunicación^{2, 6}, Guthrie finalmente publicó su famoso método para el diagnóstico de fenilcetonuria de DBS obtenido por un pinchazo del talón de los recién nacidos de^{7, 8}.

Aunque desde ese momento en adelante, DBS fueron mirada como un método general aplicable para recoger, almacenar, transportar y analizar una variedad de fluidos del cuerpo humano⁵, su uso en el diagnóstico seguía siendo predominantemente centrado en el diagnóstico de infecciones especialmente en contextos de recursos limitados y la proyección sistemática de los recién nacidos para trastornos metabólicos hereditarios para décadas^{9, 10}. Desde 2005, sin embargo, una variedad de nuevas e innovadoras aplicaciones de DBS han comenzado a surgir. Esto resultó en un incremento casi exponencial del número de publicaciones científicas respectivas en DBS de cerca de 50 a casi 450 anualmente en la actualidad. Entre las aplicaciones emergentes son campos tan diversos como toxico - y estudios farmacocinéticos, perfiles metabólicos, monitoreo de drogas terapéuticas, toxicología forense o control de la contaminación del medio ambiente^{10, 11}.

DBS de prueba por lo tanto, ha hecho una marcha triunfal a través de diagnóstico clínico de laboratorio durante los últimos 100 años². Como en química clínica¹², sin embargo, durante este mes de marzo variables pre-analíticas no eran adecuadamente consideradas durante muchos años. De hecho, incluso hoy, después de actividades eminentes como los CDC papel filtro evaluación proyecto¹³ o la formulación de un estándar nacional para recolección de sangre en papel filtro en el marco del recién nacido¹⁴, de detección de la fase pre analítica sigue siendo en gran parte infravalorados en la mayoría de los otros campos, en el cual prueba de DBS es aplicada^{5, 10}.

Dado este contexto, sugiere un amplio protocolo paso a paso^14-16 para su uso en inmunoensayos y en técnicas moleculares, que cubre todos los pasos esenciales, para la preparación y procesamiento de DBS en la siguiente comunicación: (1) colección de la sangre; (2) preparación de manchas de sangre; (3) sequedad de manchas de sangre; (4) almacenamiento y transporte; (5) elución de DBS; y finalmente (6) análisis de eluatos DBS. La eficacia del protocolo primero se evaluó con pares acoplados 1.762 suero/DBS para detectar hepatitis B virus (HBV) antígeno de superficie (HBsAg), anticuerpos contra el antígeno core de VHB (anti-HBc), anticuerpos contra el antígeno de superficie de VHB (anti-HBs), HBV DNA, anticuerpos para el virus de la hepatitis C (HCV) (anti-HCV), pruebas de ARN del VHC y virus de inmunodeficiencia humana (VIH) 1-p24-antígeno/anti-VIH 1/2 utilizando una plataforma totalmente automatizada o sensibles ácidos nucleicos cualitativa. ¹⁷. en un segundo paso, el protocolo se utilizó en el estudio piloto "drogas y enfermedades infecciosas crónicas" ("estudio de DRUCK") que se llevó a cabo por el Instituto Robert Koch-en estrecha colaboración con el Centro Nacional de referencia para la Hepatitis C en activo usuarios de drogas en las ciudades alemanas de Berlín y Essen¹⁸.

Protocolo

Puesto que el protocolo está diseñado para uso en diagnóstico médico, su aplicación debe seguir los principios de la declaración de Helsinki¹⁹. Para la primera parte de los resultados presentados en esta comunicación, tanto un contrato por separado por los pacientes y aprobación por un Comité de ética parecen prescindible por dos razones: (1) "sobre la admisión" al hospital universitario de Essen, "ofrece a cada paciente consentimiento por escrito a todas las investigaciones necesarias del bioquímicas, bacteriológicas y virológicas." ¹⁷ (2) "todas las muestras que utiliza a lo largo de la evaluación de la prueba de DBS fueron enviadas al Instituto de virología en el proceso de diagnóstico clínico rutinario. Por lo tanto, ninguno de los especímenes fueron recogido específicamente con el propósito del estudio, no una sola venopunción adicional fue realizada y ninguno de los materiales fue probado para cualquier parámetro que no sean los requeridos por los médicos en el curso normal work-up de diagnóstico." ¹⁷ el estudio "Drogas y enfermedades infecciosas crónicas" (estudio de DRUCK")¹⁸, en el que DBS prueba finalmente fue utilizada en las ciudades alemanas de Berlín y Essen para evaluar activamente drogas inyectables, fue aprobado por la Comisión Federal para los datos Protección y libertad de información (Berlín, Alemania) y así como por el Comité de ética del médico Charité de la Universidad, (Berlín, Alemania).

1. recolección de sangre

1. Venopunción^{14, 15, 20, 21}
   1. Colóquese guantes desechables de látex de caucho y limpie el área del sitio previsto de punción (preferentemente la vena cubital media en la fosa antecubital) con un desinfectante apropiado, por ejemplo, alcohol isopropílico al 70%.
   2. Aplique un torniquete 4 – 6 pulgadas por encima de la supuesta punción a las venas se dilatan. Guiar la aguja en la vena del paciente y, una vez en el lugar, cuidadosamente llenar el tubo conectado de la sangre, que contiene EDTA como anticoagulante.
   3. Tan pronto como venopunción es completa, suelte el torniquete y retire la aguja. Pulse una gasa seca sobre el sitio de punción, que posteriormente puede ser sostenido por una venda.
2. Punción de la piel (figura 1A)^{13-15, 20, 22, 23}
   1. Poner en un par de guantes desechables de látex de caucho.
   2. Antes de punción cutánea, el paciente debe calentar sus manos. El dedo es masajes anterogradely enriquecen la sangre fluir hacia al sitio de la puntura.
   3. Limpiar la piel del lado palmar de la falange distal de la extremidad del tercer o cuarto dedo de la mano sin escritura con un desinfectante adecuado, por ejemplo, alcohol isopropílico al 70%. Punzar la piel por una lanceta de seguridad de un solo uso. Se celebrara el dedo en una posición tal que la gravedad facilita la recolección de sangre en la yema del dedo.
   4. Cuando termine la colección de sangre capilar por punción de la piel, coloque un vendaje sobre la punta del dedo.

2. preparación de manchas de sangre

1. Preparación de sangre recogidas por punción venosa¹⁵
   1. Ver la recogida anticoagulada (EDTA) toda la sangre venosa en las tarjetas de filtro tan pronto como sea posible. No prepare manchas de sangre seca de más de 24 horas después de la venopunción.
   2. Poner toda la información necesaria para la identificación del paciente en la ficha filtro. Una tarjeta debe ser identificada sólo con la sangre de un individuo.
   3. Colóquese guantes desechables de látex de caucho.
   4. Invierta suavemente el tubo de la colección de sangre 2 – 4 veces y posteriormente abrir el tapón con cuidado.
   5. Aspire 50 μl de sangre entera venosa utilizando una pipeta con una punta descartable. Transferencia de la sangre en el centro de un círculo sin tocar el papel de filtro directamente con la punta de la pipeta. Tratar de saturar totalmente el círculo.
   6. Repita este procedimiento para llenar todos los círculos requiere de la tarjeta.
2. Preparación de sangre recogida por piel puntura (figuras 1B y 1C)^{13-16, 23}
   1. Limpie la primera gota de sangre con una gasa porque pueden contener líquidos de exceso de tejido. Masajee el dedo otra vez para aumentar el flujo sanguíneo en el sitio de punción. Transferencia de la gota siguiente a uno de los círculos de la tarjeta filtro sin tocar la superficie directamente con la yema del dedo. Permite que la sangre se empapa en la textura del filtro por las fuerzas capilares solamente.
   2. Dejó la siguiente gota de forma capilar de la sangre en la punta del dedo grande y recoger en el círculo siguiente. Continúe este procedimiento hasta que todos los círculos están llenos o detiene el flujo de sangre.
   3. No apriete o "de leche" el dedo demasiado si el flujo de sangre no es suficiente para llenar todos los círculos requiere de la tarjeta de filtro. Si se detiene el flujo de sangre Coloque un vendaje sobre la punta de los dedos. Realizar una segunda punción cutánea en otro dedo si se necesita más sangre para el examen.

3. secado de manchas de sangre

1. Para secar las manchas de sangre, poner el filtro de tarjetas en un papel limpio de la toalla en un gabinete de seguridad biológico y dejaron secar, preferiblemente O/N (pero por lo menos 4 horas), a temperatura ambiente en ausencia de cualquier fuente externa de calor. Cuando el proceso de secado, las manchas de sangre tienen un color marrón uniforme oscuro y no áreas rojas son visibles ya (figura 1)^{13, 15, 16}.

4. almacenamiento y transporte de manchas de sangre seca (DBS)

Nota: Tratamiento de las manchas de sangre puede ser interrumpido después del secado. Las tarjetas de filtro ahora pueden ser almacenados^{13-16, 23}.

1. Para el almacenamiento, poner la tarjeta de papel filtro en una bolsa de cremallera solo, gas impermeable, que contiene 1 a 2 bolsitas desecantes para proteger a las muestras de humedad (Figura 1E). Opcionalmente, añada una tarjeta de indicador de humedad.
2. Transferencia de esta bolsa en un congelador a una temperatura de-20 ° C o bajar tan pronto como sea posible. Si no hay congeladores en condiciones de campo, es factible almacenamiento a-4 ° C o incluso a temperatura ambiente hasta por 14 días.
3. Transporte de muestras DBS congeladas en hielo seco. Para filtro tarjetas inicialmente mantenidas a temperatura ambiente, use un sistema de envasado triple, que consiste en la bolsas de cremallera el fuero interno así como un interior y un sobre exterior. No se requieren marcas contenidas en el sobre externo para el envío por correo ordinario pero el símbolo internacional de riesgo biológico debe colocarse en el envase interno principal¹⁶.
4. Excluir las tarjetas filtro de procesamiento posterior si los sacos desecantes o la tarjeta de indicador de humedad adicional cambia a un color rosado.

5. elución de sangre seca los puntos^{13, 15, 16, 23}

1. Perfore un lugar con un dispositivo de 6 mm de un solo uso de cada círculo de sangre-empapado de la tarjeta de filtro del grado 903 (Figura 1F). Transferir todo perforado manchas de sangre seca de un solo paciente a un pocillo de la placa de la pozo 12.
2. Llenar el pozo con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,05% Tween 20 y 0.08% de azida de sodio (figura 1). Adaptar el volumen de buffer adicional a los requisitos mínimos respectivos de los análisis utilizados para el análisis posterior de eluatos de manchas de sangre seca.
3. Repita estos pasos para obtener una segunda serie de eluatos de mancha de sangre seca para realizar análisis moleculares.
4. La placa de cultivo celular en un agitador de laboratorio y las manchas de sangre seca perforada eluir suavemente por un mínimo de 4 horas o, preferentemente, O/N (figura 1 H).
5. Al día siguiente, las manchas son casi libres de sangre y sobrenadantes hemolíticos han formado (figura 1I). Transferir estos eluidos a tubos de microcentrífuga. Entonces, someter a centrifugación durante 2 min a 10.500 x g (Figura 1J) para liberar a los sobrenadantes de cualquier residuo que se había formado durante la elución (figura 1 K).

6. Análisis de eluatos

1. Eluatos centrifugados ahora están listos para ser utilizado para los análisis previstos. Investigar los eluidos de los marcadores del virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y VIH usando kits disponibles en el mercado y siga cuidadosamente las instrucciones de los fabricantes respectivos (figura 1 L).

Figura 1. Resumen gráfico del protocolo propuesto en la presente comunicación para preparación y tratamiento de manchas de sangre seca para su uso en inmunoensayos y por técnicas moleculares. Sangre entera venosa y sangre capilar obtenida por punción venosa o por punción de la piel por una lanceta (A) pueden servir como muestras para el análisis de manchas de sangre seca. Después de la transferencia de la sangre a los círculos de una tarjeta de filtro del grado 903 (B, C), las muestras deben secarse preferiblemente O/N en la temperatura ambiente en un gabinete a puntos de la forma de un color uniformemente Pardo sin cualquier interspersion de rojo de seguridad de biohazard áreas (D). Cuando el secado de las manchas de sangre es completa y almacenamiento es necesario, las tarjetas de filtro pueden ser empaquetadas en bolsas con cremallera impermeable a gases que contienen bolsitas de desecante de 1 – 2 (E). Más procesamiento de laboratorio de DBS comprenden la generación de golpes por un dispositivo de uso individual de 6 mm desde el centro de los círculos (F, G), la elución de los golpes en un búfer de PBS durante un mínimo de 4 horas o, preferentemente, O/N en un agitador (H ), la recuperación de los eluidos () y finalmente la centrifugación de las tazas de laboratorio (J) para liberar los eluatos DBS de cualquier suciedad que pudo haber originado durante el proceso de elución (K). Posteriormente, los eluatos DBS están listos para el análisis, que fueron realizados por una plataforma totalmente automatizada (L) para la detección de marcadores serológicos de infecciones por VHB, VHC y VIH, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

La eficacia del protocolo sugerido para la preparación y procesamiento de DBS primero se evaluó mediante el análisis de 1.762 pares acoplados suero/DBS para los marcadores de infección por VHB, VHC y VIH. ¹⁷. para ello, DBS se prepararon de 100 μl de sangre entera venosa (cf. puntos 2.1.1, 2.1.6 del protocolo anterior) y se eluyó con 1000 μl de PBS tampón, cada uno, (cf. puntos 5.1 – 5.5 del citado Protocolo) para completar el proceso de para todos los siete parámetros en dos operaciones separadas. Este enfoque sin optimización cuidadosa de las condiciones de elución para cada analito individual parecía ser inevitable porque se esperaba un rendimiento bastante alto en un comparativamente a corto plazo durante el estudio de campo próximo "drogas y crónica Las enfermedades infecciosas"("estudio DRUCK").

Todas las mediciones adhirieron a las recomendaciones del fabricante en el curso de análisis DBS, pero tuvieron que ser modificado con respecto a determinaciones de HBsAg y anti-HBs para compensar el efecto de la hemólisis o el resultado de la dilución. Con un valor de corte de 0,05 UI/ml, HBsAg prueba del DBS eluatos conducen a una tasa de falsos positivos del 14,7% (52 de 354) comparados al suero muestras (figura 2A). Receptor de funcionamiento característico (ROC) análisis^{25, 26} de los datos indica que un aumento del umbral a 0,15 UI/ml daría lugar a una separación ideal de HBsAg-positivos HBsAg-negativos (0.986 [sensibilidad], 0.000 [1-especificidad], Figura 2B). Por otro lado, con un corte de 10 UI/l para la cuantificación de anti-HBs anticuerpos contra que una tasa de falsos negativos medidas de 14,2% (47 de 331) fue grabado (figura 2). Por lo tanto, tras análisis ROC otra vez, este corte se redujo a 1,5 UI/l para lograr una óptima discriminación de los valores (0.917 [sensibilidad], 0.007 [1-especificidad], Figura 2D).

Figura 2. HBsAg y anti-HBs en eluídos DBS (modificados de¹⁷). El aumento de ROC-dirigida del valor de corte para la cuantificación del HBsAg de 0,05 UI/ml (A) a 0,15 UI/ml (B) redujo la tasa de resultados falsos positivos de 14.7% a 0%. Del mismo modo, ROC análisis de concentraciones de anti-HBs sugirió una disminución de la umbral respectivo de 10 UI/l (C) a 1,5 UI/l (D), de tal modo eliminar falsos negativos, que inicialmente representan el 14,2% de todas las determinaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Los resultados de los análisis de suero/DBS acoplados se resumen en la tabla 1¹⁷. No especificidad no se registró en el curso de DBS para cualquiera de los siete analitos.

Cuando eluatos DBS se investigaban la presencia de HBsAg, i. e. el parámetro clave serológico de la infección aguda y crónica con el VHB, se determinó una sensibilidad analítica, del 98,6%. Concentraciones de HBsAg en el suero de falso negativo dos fueron 749 UI/ml y 6 UI/ml, respectivamente. Con éxito se detectaron anticuerpos anti-HBc en 176 clientes de los 204 (i. e 86.3%) Eluatos DBS. Veintidós de las 28 muestras que no fueron detectadas por las medidas que originaron individuos coinfectados con el VIH. Así, si las personas VIH-positivas fueron excluidos del cálculo, se logró una sensibilidad del 97.1% para recuperar los anticuerpos anti-HBc de sangre entera venosa seca eluída. Observaciones similares lugar cierto para la determinación de anticuerpos anti-HBs. Incluso después del ajuste del valor de corte del ensayo a 1,5 UI/l, nueve suero discrepantes DBS resultados ocurrieron. En los pacientes no coinfectados con el VIH, se encontraron concentraciones anti-HBs en suero de 11 – 26 UI/l, que eran demasiado bajos para permitir la detección después de la elución de la sangre seca.

Anticuerpos anti-VHC son indicativos de una infección aguda o crónica o resuelta. Sólo cuatro resultados de anti-HCV falso negativo (i. e. 2.2%) se determinaron de eluatos DBS y otros análisis serológicos y moleculares demostraron claramente que los respectivos sueros muy probablemente fueron tomados de pacientes cuyas infecciones desde hace mucho tiempo habían sido resuelto.

La detección de anticuerpos anti-VIH en eluídos DBS con el sistema completamente automatizado fue un proceso totalmente liso que rindió una sensibilidad analítica de 100%.

"Concentración media HBV DNA de eluatos de sangre fue realizada en 100 ejemplares (significa concentración de ADN: 1.573.898 UI/ml, rango: < 357 - > 17,860,000 UI/ml) y un valor de 93.0%. Así, siete muestras con concentraciones bajas de suero HBV DNA entre 409 y 3.643 UI/ml no fueron detectadas por el DBS de prueba. De 100 sera que había demostrado para ser ARN-VHC positivo (significa concentración de ARN del VHC: 1.415.944 UI/ml, rango: 2.479 - > 7.692.000 UI/ml), disponía de alícuotas de sangre correspondiente. La investigación comparativa dio lugar a una sensibilidad del 100% para las determinaciones de ARN de VHC de eluatos DBS." ¹⁷

Para probar el protocolo delineado para la preparación y procesamiento de DBS en condiciones de campo, se utilizó en estrecha colaboración con el Instituto Robert Koch-(Berlín, Alemania) durante la fase piloto del estudio "Drogas y enfermedades infecciosas crónicas", que fue realizado en usuarios de droga activa en las ciudades alemanas de Berlín y Essen¹⁸. Todos 534 los participantes inscritos (433 hombres y 101 mujeres) experimentaron la muestra de sangre capilar como se describe en detalle en las secciones 2.2.1, 2.2.3 del protocolo anterior, y DBS fueron, otra vez, eluida por la adición de 1000 μl de tampón de PBS.

Dos individuos fueron diagnosticados para ser infectados crónicamente con el VHB, y 39 mostraron el patrón serológico de una infección de HBV resuelta. Además, los quince participantes fueron positivos para anti-HBs (estado después de la vacunación) y ocho fueron encontrado para ser positivos para anti-HBc solo. La prevalencia de anti-VHC entre los participantes fue de 57.3% (N = 193) en Berlín y 73.0% (N = 144) en Essen. De anticuerpo-positivos muestras de 65% (N = 125) y el 62% (N = 89) también fueron viremic. Veinticinco de las 534 personas probaron el positivo para anti-VIH. Diecinueve de las infecciones eran ya conocidos y 24 de estos individuos estaban coinfectados con VHC.

Los resultados obtenidos por la prueba de DBS cuidadosamente fueron comparados con datos anamnésticos los participantes del estudio sobre el estado el VHB y VHC. Esta comparación en relación con los resultados de la prueba junto a pares de suero/DBS conducidos a modificaciones menores del algoritmo prueba para la fase principal del "Estudio de DRUCK", que será matricular usuarios de droga activa en seis ciudades alemanas grandes adicionales: "individuos infectados con VIH se probará siempre la presencia de VHB ADN. Los participantes cuyos eluatos DBS son positivos para anti-HBc o anti-HBs deben ser sometidos a una punción venosa durante una segunda consulta para aclarar definitivamente su estatus de anti-HBc/anti-HBs y, por último, se proyectará todos los eluatos DBS para ARN de VHC independientemente de los resultados de la prueba anti-HCV". ¹⁷

Parámetros	Sera acoplado/DBS eluidos (N)	Resultados discrepantes (N)	Motivo de discrepancias entre la prueba de suero y eluatos DBS
HBV
HBsAg	299	2	Dos pacientes con infección crónica de HBV. Ambos estaban bajo tratamiento antiviral y uno de ellos fue co-infectados con el VIH. Concentraciones de HBsAg en suero: 749 IU/ml y 6 UI/ml, respectivamente.
Anti-HBc	305	28	En suero, veinte y dos pacientes tenían una infección de HBV resuelta. Seis individuos demostraron el hallazgo serológico "anti-HBc solos". Veintidós de los pacientes estaban coinfectados con el VIH. De las "resoluciones HBV", veinte años fueron evaluados como "Anti-HBs positivo solo" por la prueba de DBS y por lo tanto, fueron clasificados falsamente como "condición después de la vacunación".
Anti-HBs	310	9	Los cuatro pacientes no coinfectados con el VIH tenían concentraciones del suero anti-HBs de 11-26 UI/l, que eran demasiado bajos para permitir la detección de anticuerpos después de la elución de las manchas de sangre seca.
ADN DE VHB	150	7	Los respectivos sueros habían sido obtenidos de siete pacientes con concentraciones bajas de suero HBV DNA desde 409 UI/ml a 3.643 UI/ml.
VHC
Anti-HCV	339	4	Habían tomados estos cuatro sueros de pacientes con larga desde resolver infecciones del VHC.
ARN-VHC	150	0	–
VIH
VIH 1-p24/anti-VIH 1/2	209	0	–

Tabla 1: Resultados obtenidos de 1.762 DBS, que fueron preparados y procesados de siguiente de sangre entera venosa el protocolo propuesto en la presente comunicación, en comparación con los resultados en muestras de suero acoplados como referencia.

Discusión

DBS se han utilizado durante 100 años² pero, sorprendentemente, todavía hay no hay un consenso general sobre su preparación y procesamiento. Hasta la fecha, una suficiente estandarización de esta importante fase pre-analítica sólo se ha logrado en el campo de la evaluación del recién nacido¹⁴, considerando que existe una variedad de diferentes protocolos para todas las demás aplicaciones de DBS de prueba^{5, 16, 23}. Para superar esta heterogeneidad notable, una completa instrucciones paso a paso para la preparación y procesamiento de DBS a utilizarse a inmunoensayos y por técnicas moleculares se presenta en esta comunicación y evaluados en cuanto a su eficacia para la detección de marcadores de VHB, VHC y VIH infecciones. El foco de la discusión siguiente se coloca principalmente en los distintos pasos del protocolo sugerido.

En la historia de DBS prueba muchos papel de filtro diferentes tarjetas han sido utilizadas² pero hoy solamente dos fuentes comerciales son aprobadas por la FDA como dispositivos médicos de clase II para colección de sangre^{5, 16}. Estos sistemas de filtro de la tarjeta son muy uniformes y tienen características muy similares de absorción para que los resultados analíticos obtenidos de sangre capilar, preparado en cualquiera de ellos no difieren en más de 4% – 5%²⁸. No en vano, Masciotra y colaboradores²⁹ por lo tanto detecta VIH-1 ARN igualmente bien con un análisis cualitativo después de elución de las tarjetas de colección de sangre de diferentes fuentes. Teniendo en cuenta estos datos, que puede ser prácticamente excluido que cualquiera de las discrepancias observadas cuando juntado parejas suero/DBS por marcadores de VHB, VHC y VIH infecciones¹⁷ fue causado por la elección de la tarjeta de filtro solo. Sin embargo, cuando precisa cuantificación de un analito es indispensable, a la fuente variación ya no puede ser insignificante y técnicas más sofisticadas, por ejemplo, perforada DBS (PDBS) como un método para microsampling³⁰ o la preparación de manchas de suero seco (DSS)³¹ deba aplicarse en lugar de DBS convencional prueba¹⁰.

Puesto que sólo pequeñas cantidades de sangre se utilizan para pruebas de DBS (una gota de sangre capilar consiste en aproximadamente 50 μL)^{5, 16}, las variaciones en el volumen de la muestra son cruciales y, ciertamente, al menos algunas de las discrepancias entre resultados serológicos y de los participantes informaron estado VHB y VHC en el pilotaje del "Estudio de DRUCK" son atribuibles a esta variable. El factor más importante para reducir al mínimo las "fluctuaciones" del volumen de muestra es sin duda una técnica correcta de recolección de sangre capilar, que sólo puede lograrse mediante la cuidadosa y constante capacitación del personal técnico²². Además, como medida de control de calidad, todos los laboratorios trabajando con DBS deben haber ya iniciado procedimientos para identificar y posteriormente excepto a muestras DBS que tienen que ser considerados como insatisfactoria o nula¹⁶.

Estudios realizados principalmente en el contexto del VIH³² y evaluación del recién nacido³³ han demostrado que la alta humedad puede conducir a una degradación de analitos, pero hasta ahora no se ha alcanzado ningún consenso con respecto a la pregunta de cuánto tiempo DBS debe ser secado al aire . Un intervalo de al menos 4 horas o de preferencia O/N se propone en esta comunicación, que por lo tanto, las condiciones que se utilizaron en la gran mayoría de todas las publicaciones relevantes^{32, 34} datos en almacenamiento de información de DBS para ser utilizado posteriormente para VHB y VHC prueba son contradictorios. En 1981, Villa y compañeros de trabajo³⁵, que aplica técnicas de análisis contemporáneas, informó de que almacenamiento a temperatura ambiente no afectó los resultados de análisis de VHB durante el período de observación completa de 180 días si fueron los títulos de anticuerpos > 1/1.000, sino que la DBS se convirtió en frontera-positivos o incluso negativos después de 15 días cuando los títulos en suero eran sólo 1/100. Almacenamiento a-20 ° C o 4 ° C no se tradujo en una mejora sustancial. En contraste, un estudio llevado a cabo treinta años más tarde³⁶ probado réplicas de una muestra de VHB positivo, y los autores encontraron anti-HBc, así como los anticuerpos anti-HBs fueron estables hasta por 183 días a temperatura ambiente, considerando que el HBsAg en las mismas condiciones se convirtió en falsos negativos ya después de 63 días. Con respecto a la detección de ADN de VHB de eluatos DBS, la concentración del ácido nucleico viral era estable durante al menos siete días a 37 ° C³⁷ o demostró para ser "resistente" a almacenamiento a temperatura ambiente hasta por tres semanas³⁸. Pruebas para anticuerpos anti-VHC usando dos tercera generación disponible comercialmente inmunoensayos³⁹ proporciona resultados precisos para un período de 117 días usando DBS muestras almacenadas a-20 ° C, 2 – 8 ° C y 20 – 25 ° C, respectivamente. Almacenamiento a-20 ° C, sin embargo, dio lugar a la menor variación de densidades ópticas. Aplicación de una cuarta generación anti-HCV ELISA, es decir, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, en el contexto de la DBS pruebas, Larrat et al. ⁴⁰ se observó un descenso agudo en especificidad analítica después de guardar a las muestras DBS durante más de tres días a TA. Por otro lado, se obtuvieron resultados precisos de pruebas con el mismo equipo utilizando muestras depositadas durante 60 días en diversas condiciones (-20 ° C, 2 – 8 ° C y 22-26 ° C) por Brandao y colaboradores⁴¹. Observaciones sobre la disminución de las concentraciones de ARN del VHC en DBS bajo diferentes condiciones de almacenamiento van desde ninguna alteración significativa a temperatura ambiente por hasta un año⁴² un cambio diez veces después de cuatro semanas a temperatura ambiente de⁴³. Tomando estos datos algo contradictorios en la estabilidad de HBV y HCV antígenos, ácidos nucleicos y anticuerpos en cuenta, parecía razonable retraer en el protocolo propuesto a un consenso, que fue definido anteriormente para el almacenamiento de las muestras DBS para VIH prueba^{15, 30}: de depósito a corto plazo (hasta dos semanas) anticuerpos, antígenos y ácido nucleico viral se consideran estable a temperatura ambiente, considerando que es óptima de almacenamiento por períodos más largos en condiciones heladas.

Como regla general, tres parámetros deben ser considerados al diseñar un protocolo de elución: (1) el tampón de elución; (2) la duración y temperatura de elución; y (3) el volumen de elución²³. En la mayoría de las publicaciones pertinentes con tampón fosfato salino (PBS) fue utilizado para liberador de DBS, y mayoría de los autores ha añadido una proteína, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o Tween 20, un surfactante, para mejorar la señal de ensayo con la estabilización de proteínas, como entran en solución y al mismo tiempo bloqueo sitios de fijación no específica²³. Solamente algunos informes, que comparan directamente tampones de elución diferentes en el contexto de la prueba de DBS, están disponibles. Villar et al. ³⁶, por ejemplo, registró capacidad de elución prácticamente equivalente para todos los búferes usados, pero PBS/BSA 0.5% resultó en el nivel más bajo de la reactividad inespecífica. Una observación muy similar fue hecha por Croom y compañeros de trabajo⁴⁴ al aplicar el diluyente de muestra de la genética sistemas rLAV EIA para la elución de los anticuerpos anti-VHC de DBS. Puesto que el riesgo de degradación de la muestra es excesivamente bajo en las primeras horas después de la preparación de DBS (véase arriba), se decidió a incubar las manchas O/N en la temperatura ambiente y para apoyar el proceso de elución mezclando suave sobre un extremo. Este enfoque tiene la ventaja de que ejemplares perforados fuera el anterior día puede ser transferido directamente al diagnóstico rutinario temprano la siguiente mañana²³. El volumen del buffer de elución debe adaptarse a los requisitos mínimos respectivos de los análisis utilizados para los análisis posteriores para mantener el factor de dilución tan bajo como sea posible. Sin embargo, una cuidadosa optimización de las condiciones de elución para cada analito individual no era posible en la evaluación anterior debido a un rendimiento alto tenía que garantizarse en un comparativamente a corto plazo en el "Estudio de DRUCK"¹⁷. En consecuencia, el volumen más bien desfavorable de 1000 μl de tampón de PBS-basado fue utilizado para completar el proceso de elución todo para todos los parámetros en dos operaciones separadas.

Este enfoque una parte falla "completamente en el sistema de anti-HBc/anti-HBs para las personas infectadas con el VIH debido a las concentraciones bajas de anticuerpos; ... y requiere procedimientos biológicos moleculares con óptima sensibilidad analítica con respecto a la DNA de HBV y HCV RNA pruebas. " ¹⁷ por otra parte, el volumen de elución alta resultó para ser de ninguna manera para la determinación de HBsAg, anti-HCV y anti-VIH por los kits utilizados en la evaluación. "La detección de HBsAg positivos materiales de eluatos de sangre tuvo éxito con una sensibilidad de 98,6% a un igualmente alto grado como en estudios anteriores, que en parte había utilizado un menor volumen de elución de 100 μl, 250 μl, 600 μl o 500 μl"^{17 ,36, 45, 46}. La sensibilidad de 97,8% determinado en la investigación de 179 parejas suero/DBS para anticuerpos anti-HCV correspondieron a los resultados de la ya existente informa^{24, 44, 47, 48, 49}, que había trabajado con un volumen de elución que fue menor en un factor de 5 a 10. "Además, los protocolos para la detección de anticuerpos anti-VHC habían sido adecuadamente optimizados... por estipulando sus propios puntos de corte"^{17, 24, 48, 49} ", o mediante el aumento de los volúmenes de muestra de 20 μl a 100 μl. ^{17, 49} finalmente, la especificidad analítica y la sensibilidad (100%) establecido para la detección de anti-VIH fueron iguales o superiores a las características de rendimiento de otros inmunoensayos adaptadas específicamente a DBS^{50, 51} de prueba "o un paso a paso procedimiento con el uso combinado de varias pruebas anti-VIH"^17,52. "Ellos, en efecto, también superaron el récord de rendimiento de un ensayo que había sido especialmente desarrollado y optimizado para la detección de anticuerpos anti-VIH en eluídos DBS (Q prevenir HIV 1 + 2 kit de DBS)." ^{17, 53}  

Tomados en conjunto, el protocolo paso a paso integral presentado en esta comunicación demostró para ser una herramienta factible y fácil de usar para la preparación y procesamiento de DBS y por lo tanto, puede, ser utilizado confiablemente en virología diagnóstica. Permite enfoques utilizando automatización ⁵⁴ y debido a sus características de funcionamiento excelentes tiene el potencial de servir como una especie de cimiento para un protocolo futuro consenso generalmente aceptado en el campo global de DBS pruebas en laboratorio medicina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Guantes de goma látex	Hartmann	#4049500041515
70% de alcohol isopropílico	Bode Chemie	#9768050
Cánula de seguridad Mulifly	Sarstedt	#85.1638
Tubo de extracción de sangre EDTA	Sarstedt	#02.1066.001
Venda adhesiva	Hartmann	#2994163
Gasa seca	Hartmann	#143213
Lanceta de seguridad de uso singel	Owen Mumford	#3802421
Tarjeta de papel de filtro	Whatman/sigmaaldrich	#10534612	Tarjeta de papel de filtro Grado 903
Puntas de pipeta desechables	Starlab	#S1126-7810, #S1120-8810
Bolsa con cremallera	Flexico	#20219
Mini bolsa desecante	Tropack	#-
Punzón desechable	pfmmedical	#48601	Punzón de biopsia desechable de 6.0 mm
Pinza desechable	Servoprax	#H7301
placa de cultivo celular de 12 pocillos	Greiner	#665180
Tampón PBS	Gibco	#14190-136
Tween 20	Aplicación	#A1389.0500
Azida de sodio	Merck	#66880250
Tubos Safe-Lock, 1,5 ml	Eppendorf	#30120086
ARCHITECT HBsAg (Cuantitativo)	Abbott	#6C3642
ARCHITECT anti-HBc II	Abbott	#8L4425
ARCHITECT anti-HBs	Abbott	#7C1825
ARCHITECT anti-HCV	Abbott	#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo	Abbott	#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit	Roche	#6374891001
artus HBV LC PCR Kit	Qiagen	#4506063 (24 pruebas), #4506065 (96 pruebas)
VERSANT HCV TMA Assay IVD	Siemens Healthcare	#2554311