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Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

Amplificación de ácidos nucleicos cuantitativa es una técnica importante para la detección del medio ambiente, transmitidas por los alimentos, y los patógenos transmitidos por el agua, así como para el diagnóstico clínico. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) es el método estándar de oro para la detección sensible, específica y cuantitativa de ácidos nucleicos, por ejemplo, para el VIH-1 pruebas de carga viral, la detección de patógenos bacterianos, y la detección de muchos otros organismos ^{1 – 3.} Durante tiempo real qPCR, cebadores amplifican ADN del patógeno en ciclos, y una señal fluorescente que se genera es proporcional a la cantidad de ADN amplificado en la muestra en cada ciclo. Una muestra que contiene una concentración desconocida de ADN del patógeno puede ser cuantificada usando una curva patrón que relaciona la concentración de ADN inicial de muestras estándar y el tiempo en que la señal fluorescente alcanza un cierto umbral (es decir, el umbral de ciclo, o C _T).

<p class="Jove_content"> Debido a tiempo real qPCR requiere costosos equipos de ciclo térmico y varias horas para recibir los resultados, las técnicas de amplificación isotérmica alternativos, tales como la amplificación recombinasa polimerasa (RPA), se han desarrollado ^4. Estas plataformas generalmente proporcionan resultados más rápidos y amplifican los ácidos nucleicos en una, solo temperatura más baja, que se puede lograr con un equipo menos caro, más simple. RPA, que es particularmente atractivo para aplicaciones de punto de cuidado, amplifica ADN en minutos, requiere una temperatura de amplificación baja (37 ° C), y permanece activo en la presencia de impurezas ^5,6. Ensayos de RPA se han desarrollado para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el análisis de alimentos, la detección de patógenos, detección de drogas cáncer, y la detección de agentes biothreat ^7-12. Sin embargo, el uso de RPA para la cuantificación de ácidos nucleicos se ha limitado ^13,14.

En trabajos anteriores, que era shown que en tiempo real RPA cuantitativa (qRPA) es factible ^15. Aquí, se proporciona un protocolo más detallado para el uso en tiempo real RPA cuantitativa para cuantificar muestras desconocidas utilizando una curva estándar, un método que es análogo a la cuantificación mediante qPCR. Este protocolo se describe cómo realizar una reacción RPA en un termociclador para detectar el VIH-1 de ADN como prueba de concepto, así como la forma de desarrollar un control positivo interno (IPC) para asegurar que el sistema está funcionando correctamente. La recolección de datos utilizando un termociclador o microscopio y análisis de datos para la construcción de una curva estándar utilizando datos de entrenamiento también se detalla. Por último, el método para cuantificar muestras desconocidas usando la curva estándar con un script personalizado se demuestra. Esta técnica qRPA permite la cuantificación de las muestras con concentraciones desconocidas y tiene muchas ventajas sobre en tiempo real tradicional qPCR.

Protocol

1. Programe el termociclador de tiempo real las reacciones qRPA

1. Crear un nuevo protocolo en el software termociclador.
   1. Inserte una etapa de pre-incubación: 39 ° C durante 1 min.
   2. Añadir un segundo paso: 39 ° C durante 20 seg seguido por una placa de lectura.
   3. Por último, inserte un "ir a" que se repite el segundo paso 59 veces más.
   4. Guarde el protocolo.
2. Crear una nueva placa en la pestaña "Editor de placa" del software. Seleccionar pocillos de la placa correspondientes a las ubicaciones de las reacciones RPA (aquí, el uso de los pocillos A1, A4-A8, B1, y B4-B8).
   NOTA: No es importante si se especifica el tipo de muestra de los pozos (por ejemplo, "Estándar", "NTC"), como el análisis de los datos se realiza mediante un script personalizado.
   1. Para los experimentos con el VIH-1 de ADN solamente, seleccione el fluoróforo "HEX" para todos los pozos. Para los experimentos de VIH-1 que contienen ADN y un co positivo internontrol, seleccione tanto "HEX" y "fluoróforos FAM" para todos los pozos. Guarde la placa.

2. Prepárese para experimentos VIH-1 qRPA

1. Ensamble reacciones RPA en un espacio de trabajo de pre-amplificación designado contiene pipetas designados, puntas de pipeta, vórtice, y mini-centrífuga, como por qPCR. Como RPA puede amplificar una sola copia de ADN de hasta diez órdenes de magnitud (datos no mostrados), manejar y disponer de tubos que contienen productos de ADN post amplificado en una zona post-amplificación designado.
   1. Evitar el contacto entre todos los reactivos pre-amplificación y productos post-amplificación. Rocíe las áreas de trabajo y el equipo con 50% de lejía pre-amplificación, antes y después de todos los experimentos. Use una toalla de papel para limpiar el exceso de cloro.
2. Compra secuencia de cebador directo 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'y revertir secuencia del cebador 5' CCC GAA AAT TTT TTT GAA TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'de los sintetizadores de ADN comerciales. Compra la secuencia de sonda 5'-TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC CCC AAT C-3 'de fuentes comerciales. Almacenar todos los cebadores y sondas a 4 ° C en alícuotas a una concentración de 10 mM antes de su uso.
   NOTA: El ensayo qRPA amplifica una única secuencia de VIH-1. Para este ensayo de prueba de concepto, utilizar el plásmido pHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVpr descrita por Sutton et al., Que contiene la secuencia diana ^16. Para los experimentos de qRPA, el plásmido se almacenó a 4 ° C en alícuotas que contienen 1, 10, 10 ^2, 10 ^{3, 4} y 10 copias por l en un tampón que contenía Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM a pH 8,0, y 1 ng / ADN genómico humano l portador (360486). Esta concentración de ADN portador es equivalente a la concentración de ADN obtenido a partir de kits de extracción de ADN de suero comerciales utilizados para el VIH-1 diagnóstico ^17. Estos VIH-1diluciones se utilizaron como plantillas en las reacciones qRPA para construir una curva estándar.

3. Montar un VIH-1 qRPA curva estándar

1. Antes de montar las reacciones qRPA, preparar el área de trabajo de pre-amplificación como se describe en el paso 2.1.1. Coloque un bloque de 96 pocillos frío en almacenamiento a 4 ° C.
2. Preparar reactivos para 12 reacciones:
   1. Mueva el acetato de magnesio, la rehidratación de amortiguación, y 12 del EPR pellets de reacción al área de trabajo de pre-amplificación.
   2. Descongelar el acetato de magnesio y el tampón de rehidratación a temperatura ambiente.
   3. Alícuota de 32,5 l de acetato de magnesio (2,5 l por reacción) a un tubo de microcentrífuga.
   4. Prepare una mezcla 13x maestro. Añadir 383,5 l de la rehidratación de amortiguación (29,5 l por reacción) a un tubo de microcentrífuga separado para la mezcla maestra. Añadir 41,6 l de agua libre de nucleasa (3,2 l por reacción) a la mezcla maestra. Agite la mezcla maestra.
   5. Devuelva la ACETA magnesiotampón TE y la rehidratación de su almacenamiento a -20 ° C.
   6. Mueva las alícuotas de cebadores y sondas de la nevera a la zona de pre-amplificación, evitar la exposición excesiva luz para minimizar fotoblanqueo.
   7. Añadir 27,3 l cada uno de los 10 cebadores directos e mu M (2,1 l por cebador por reacción) a la mezcla maestra inversa.
   8. Añadir 7,8 l de la pandemia del VIH-1 sonda de ADN marcada con HEX 10 mm (0,6 l por reacción) a la mezcla maestra.
   9. Volver cebadores y la sonda de almacenamiento.
3. Adaptación de la disposición de la placa se describe en la Sección 1.2, coloque 1 enzima pellet en cada uno de los tubos de la extrema izquierda y 1 de la enzima de pellets en cada uno de los 5 tubos de extrema derecha de 2 de baja altura de 8 pocillos tiras de tubos PCR.
4. Añadir con cuidado 37,5 l de mezcla maestra a cada tubo que contiene una bolita enzima, utilizando una nueva punta de pipeta para cada tubo y agitar suavemente la mezcla maestra y pellet con la punta hasta que la pastilla se haya disuelto completamente. Revuelva suavemente para evitar formati burbujaen, y quitar la punta con cuidado para evitar cualquier pérdida de volumen de reacción.
5. Después de todas las pastillas de enzimas han sido rehidratado con la mezcla maestra, recuperar el bloque de 96 pocillos frío de 4 ° C de almacenamiento. Colocar las tiras de tubos de PCR en el bloque frío para enfriar la mezcla maestra.
6. Mientras que la mezcla maestra se está enfriando, cargar el software termociclador con el protocolo y la placa se describe en la Sección 1.
7. Cortar 2 tiras de plástico transparente micro-sello adhesivo a ser ligeramente más ancho que los tubos de PCR, y recuperar 2 PCR tira tubo tapas planas.
8. Recuperar 6 alícuotas de plantilla de almacenamiento (que contienen 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^{3, 4} o 10 copias del plásmido de VIH-1 por microlitro).
9. Añadir 10 l de cada plantilla a los tubos designados para que la concentración de plantilla. Use una nueva punta de pipeta para cada tubo, se agita suavemente la solución con la punta de mezclar la mezcla maestra y plantilla. Asegúrese de agregar la plantilla a la ubicación correcta para match la disposición de la placa se describe en la Sección 1.2.
10. Asegúrese de que un adaptador de tiras tubo de PCR para la microcentrífuga está en su lugar.
11. Dispensar 2,5 l de acetato de magnesio en cada tapa de tubo que se coloca en un tubo que contiene una reacción qRPA.
12. Con cuidado, coloque las tapas en la parte superior de los tubos de PCR de manera que no están completamente sellados y pueden ser quitados. El acetato de magnesio se adherirá a las tapas y sea claramente visible desde arriba.
13. Inserte cada tira tubo de PCR con tapas en cada lado del soporte de tubo de PCR. Cerrar la tapa de la Minifuge para hacer girar el acetato de magnesio de los párpados y en la reacción de RPA, iniciando la reacción RPA. Se centrifuga hasta que se eliminen todas las burbujas y todo el líquido se recoge en la parte inferior de cada tubo (aproximadamente 10 segundos).
14. Quite rápidamente las tiras de tubos PCR y devolverlos al bloque frío para detener las reacciones qRPA.
15. Retire con cuidado las tapas para evitar la formación de aerosoles y sellar cada tira de tubo de PCR con el cortetrozos de película de micro-seal clara.
16. Rápidamente caminar hasta el termociclador y cargar las dos tiras de tubos PCR en el termociclador en los lugares que concuerden con la disposición de la placa (pocillos A1-B8). Cierre la tapa del termociclador, haga clic en "Ejecutar", y designar un nombre de archivo para el experimento.
    Nota: Aunque el fabricante recomienda agitar la muestra después de 5 min de incubación, este paso no es necesario para este ensayo particular y puede ser omitido.
17. Una vez finalizada la ejecución, seleccione "Configuración", "Ajuste de línea de base", "No Base Resta" para mostrar los datos de fluorescencia primas. Exportar los datos a una hoja de cálculo mediante la opción "Exportar", "Exportar todas las Fichas de Datos de Excel." Un archivo con el Anexo "Resultados Cuantificación de amplificación" se creará con los datos de fluorescencia en tiempo real primas.

4. Desarrollar un control positivo interno

1. Seleccionar una secuencia de ADN de una especie que es poco probable que se encuentran en la muestra objetivo. La secuencia debe ser más largo que el amplicón diana de manera que se favorece la generación de la secuencia diana.
   NOTA: Para este ensayo, Cryptosporidium parvum, un parásito intestinal, fue elegido para servir como la plantilla para la generación de la secuencia de IPC porque este organismo es poco probable que se encuentra en la sangre y estaba disponible en el laboratorio de otro proyecto. Para generar la secuencia de IPC, extraer y purificar el ADN de C. ooquistes parvum como describen en otra parte ^18.
2. Compra el delantero (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') y atrás (5' CCC GAA AAT TTT TTT GAA TTG TAA TTT TTT GTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA-3 ') cebadores de fuentes comerciales. Los cebadores IPC de PCR utilizados en este ensayo se muestran en la Figura 1 y contienen una región que es complementaria a la plantilla de IPC DNA (por ejemplo, C. parvum, púrpura en la Figura 1) y una región que es complementaria con el organismo objetivo (por ejemplo, VIH-1, azul en la Figura 1).
3. Realizar PCR usando los cebadores y el ADN plantilla de IPC.
   1. Montar 50 l reacciones de PCR utilizando los reactivos del kit Phusion de alta fidelidad de la polimerasa de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con exclusión de la polimerasa. Utilice 2 l de ADN molde y Phusion Buffer HF.
   2. Añadir la Phusion polimerasa para cada reacción después de un arranque en caliente a 98 ° C, seguido de 60 segundos a 98 ° C, seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 98 ° C, 30 segundos a 62 ° C y 30 segundos a 72 ° C con una extensión final a 72 ° C durante 5 min. Después de los ciclos térmicos, mantenga las muestras a 4 ° C.
   3. Analizar las muestras por electroforesis en gel en un gel de TAE agarosa al 2%, y luego extraer y purificar el ADN usando el kit de extracción de gel QIAquick según el protocolo incluido con microcentrífugael kit.
4. Se tamizan los candidatos del IPC por su capacidad para amplificar utilizando qRPA.
   1. Preparar reacciones qRPA como se describe en la Sección 3, utilizando el VIH-1 primers, una sonda FAM-etiquetados específicos para el IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A-3 '), y un total de 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^{4, 5} o 10 copias de cada candidato IPC por reacción, probando todas las concentraciones por duplicado.
   2. Elija el candidato IPC que amplifica más consistente y tiene el límite de detección más bajo.
5. Co-amplificar VIH-1 y el CPI para determinar la concentración óptima de ADN IPC.
   1. Al igual que en la sección 3, se combinan los siguientes en cada reacción de 50 l: 29,5 l de tampón de rehidratación, 2,1 l de RPA de cebador directo [10 mM], 2,1 l de RPA imprimación [10 mM] revertir, 0,6 l de VIH-1 HEX sonda marcada con [10 mM], 10 lde VIH-1 de ADN a concentraciones variables, 2,5 l de acetato de magnesio, y 1 enzima pellet. En lugar de añadir 3,2 l de agua libre de nucleasa como se hizo en el paso 3.2.4, añadir 0,6 l de sonda marcada con FAM IPC [10 mM], y 2,6 l de ADN IPC. Utilice la concentración IPC que es el límite de detección-de-(LOD) cuando qRPA se realiza con ADN IPC solo (LOD definida como la concentración más baja donde la cantidad de generación de señal de fluorescencia es mayor que la generada por la fluorescencia generada por las muestras con sin ADN diana).
   2. Incubar las muestras usando el protocolo descrito en la sección 1.1.
   3. Si el IPC no amplifica en todas las muestras, considere repetir el experimento con un IPC concentración de un orden de magnitud más alto. La concentración óptima de ADN IPC para el ensayo de VIH-1 es 10.000 copias / l. Mientras que las muestras se considerarán válidas si hay o IPC o el VIH-1 de amplificación de ADN, idealmente el IPC muestra la amplificación detectable decada reacción.

5. La construcción de una curva patrón de múltiples experimentos

1. Asegúrese de que los datos de cada experimento se ha exportado a una hoja de cálculo como se describe en la Sección 3.13.
2. Abrir y ejecutar el script "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Todas las entradas se les solicita automáticamente en la ventana de comandos. Después se inicia la secuencia de comandos, se solicita al usuario automáticamente para designar el "Número de archivos de datos" usado para construir la curva estándar.
3. En la ventana de comandos, escriba el número de archivos que se utiliza para construir la curva estándar y pulse enter.
4. Escriba en la ventana de comandos del número de muestras y el número de repeticiones en cada archivo de entrenamiento (pulsar enter después de cada entrada).
   NOTA: En el diseño de la placa se describe en la Sección 1.2, hubo 6 muestras con diferentes concentraciones y 2 réplicas de cada muestra).
5. Escriba en la ventana de comandos el más bajo DNUna concentración utilizada para construir la curva estándar (en log10 copias) y pulse Enter (para el diseño de la placa se describe en la sección 1.2, la concentración de la plantilla más baja es '1' log10 copias).
6. Tipo en la ventana de comandos la diferencia de concentración entre cada estándar (en log10 copias) y presione Intro (para la disposición de la placa se describe en la sección 1.2, el intervalo de concentración es '1' log10 copias).
7. Después de que se le pida, escriba el "umbral de pendiente" en la ventana de comandos y presione intro.
8. En la ventana de comandos, escriba el "Número (z) desviaciones estándar por encima del fondo para el umbral positivo", y luego presione intro. Los valores típicos para el rango de z de 1 a 5.
9. Especifique si los datos fueron recolectados mediante el termociclador ('1'), * .tiff imágenes de microscopio ("2") o * .jpg imágenes de microscopio ('3') escribiendo el número '1', '2' o '3', y pressing entrar.
10. Seleccione establecer un nuevo umbral IPC o utilizar un valor predeterminado para el umbral escribiendo 'y' o 'n', respectivamente, cuando se le solicite.
11. A continuación, seleccione cada una de las hojas de cálculo utilizadas para construir la curva estándar.
    NOTA: La secuencia de comandos a continuación, importar automáticamente los datos HEX y fluorescencia FAM; determinar si cada reacción era válido (es decir, si las señales de fluorescencia superen los umbrales para el HEX o canales FAM); determinar el coeficiente r ² para una exponencial, lineal y de segundo orden ajuste polinómico; complot "log10 copias frente al ciclo umbral" para cada muestra utilizada para construir la curva estándar; y crear un archivo de hoja de cálculo que contiene variables esenciales para reconstruir la curva estándar para la validación de los experimentos sin que el usuario vuelva a introducir todos los parámetros de entrada de nuevo.

6. Ensayo de validación y cuantificación de muestras desconocidas Usola curva estándar

1. Utilice el script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" para estimar la precisión y exactitud del ensayo mediante el uso de muestras con concentraciones conocidas o utilizarlo para cuantificar las muestras con concentraciones desconocidas.
   NOTA: Debido a que la investigación publicada anteriormente mostró que un ajuste exponencial cedió el mejor coeficiente r cuadrado ^18, este script utiliza un ajuste exponencial de la curva estándar. Si se desea un tipo diferente de ajuste, el script puede modificarse en consecuencia.
   1. Abrir y ejecutar el script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Después se inicia la secuencia de comandos, se solicita al usuario automáticamente a introducir todas las entradas en la ventana de comandos.
   2. Ingresa "1" para validar un ensayo usando una curva estándar con concentraciones de la muestra que se sabe o introducir "2" para cuantificar muestras desconocidas.
   3. Cuando se le solicite, seleccionar una curva estándar guardado o construir uno nuevo introduciendo ªinformación de correo que se solicitó automáticamente en la ventana de comandos (la misma información que se requiere para la secuencia de comandos "JoVE_qRPA_standard_curve.m" de la Sección 5).
   4. Escriba el número de experimentos (es decir, archivos de hojas de cálculo) para analizar la validación / cuantificación.

7. Preparación para la recopilación de datos que usa un microscopio de fluorescencia y un chip climatizada

1. Asegúrese de que el microscopio de fluorescencia tiene un calentador de escenario y controlador de temperatura de 1 Canal de precisión de alta estabilidad en su lugar.
2. Asegúrese de que el microscopio de fluorescencia tiene un cubo de filtro para excitar y recoger la fluorescencia de cada fluoróforo. Excite y recoger la fluorescencia FAM generada durante la amplificación de ADN IPC a través de un filtro de GFP (excitación BP 470/40 nm, emisión BP 520/50 nm). Excite y recoger la fluorescencia HEX generado durante el VIH-1 de amplificación de ADN a través de un filtro de HEX (excitación BP 530/30 nm, emisión BP 575/40 nm).
3. Utilice el software de edición de guiones microscopio para crear un algoritmo automatizado para replicar de recopilación de datos en el termociclador.
   1. Primero inserte un "Configuración" paso para cerrar el obturador. A continuación, agregue una "Exposición" paso para establecer la exposición a 60 seg. Inserte un "complemento" para ejecutar el retraso de 60 segundos, que implementa el período de pre-incubación de 1 min. Añadir un paso "Configuración" para cambiar el grupo de trabajo para el filtro de las buenas prácticas agrarias. Inserte otro "Exposición" paso para ajustar la exposición de 200 ms. Todas las exposiciones utilizando el GFP o los filtros HEX cubos se establecerá en 200 ms.
   2. Después del paso de "Exposición", añade un "Snap" y especifique la cámara con la que se tomó la imagen. Utilice otro paso "Configuración" para cerrar el obturador y un paso "Guardar imagen" para guardar la imagen en una carpeta temporal definida por el usuario.
   3. Siguiente interruptor al cubo filtro HEX utilizando otro "Configuración" paso y XXen agregar una "exposición" a 200 ms, un "Snap", y una "Guardar imagen" paso.
   4. Repita este proceso 59 veces con un retraso inicial de 20 segundos en lugar de 60 (cerca del obturador, espere 20 segundos, cambie al cubo de filtro de las buenas prácticas agrarias, ajuste la exposición a 200 ms, a presión, cierre el obturador, guardar, cambiar al cubo filtro HEX, exposición establecido a 200 ms, snap).
4. Crear un chip que contendrá reacciones qRPA.
   1. Para los experimentos utilizando el microscopio, utilizar el archivo JoVE_qRPA_base.ai cortar una base rectangular 40 x 15 mm a partir de una hoja de 1/8 "de espesor de acrílico negro usando un cortador láser ajustado a 100% de potencia, la velocidad del 10%.
   2. Utilice el archivo JoVE_qRPA_well.ai cortar reacción bien consiste en un cuadrado de 10 x 10 mm, con un diámetro de 5 mm de corte agujero circular a partir de una hoja de 1,5 mm de espesor de acrílico transparente.
   3. Conecte hasta tres pozos a una sola base usando gel superglue.
   4. Secar durante la noche.

8. Recolección de datos y Analysis que usa un microscopio de fluorescencia

1. Preparar el microscopio para la recopilación de datos mediante la carga de la secuencia de comandos de recogida automática de datos JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. Ajuste el calentador de fase a 48 ° C y precalentar el chip de reacción en el calentador etapa durante aproximadamente 20 min. Un ajuste de la temperatura de 48 ° C mantiene una temperatura de 39 ° C en el pocillo de reacción (datos no mostrados).
   2. Usando un objetivo de 10X, 0,45 NA, se centran en la parte superior del borde interno de la reacción bien con el filtro de GFP en su lugar. Los bordes del acrílico son autofluorescentes después de corte por láser y pueden ser visualizados fácilmente. Después de enfocar, no ajuste la altura de la platina del microscopio hasta que se recogen todos los datos.
2. Montar la mezcla maestra qRPA en un espacio de trabajo de pre-amplificación designado como se describe en el paso 4.5.1. Para cada muestra, mezclar un pellet enzima, mezcla maestra, y el VIH-1 plantilla de ADN en un tubo de microcentrífuga. Añadir 2,5 l de acetato de magnesio a la primera reaction y agitar brevemente.
3. Transportar rápidamente el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra qRPA al microscopio de fluorescencia.
   1. Cuidadoso pipeteado 30 l de la reacción RPA en la reacción bien sin crear burbujas. Coloque una gota de aceite mineral de calidad para PCR sobre la reacción RPA para evitar la evaporación.
   2. Coloque el bien directamente debajo del objetivo del microscopio, teniendo cuidado de imagen sólo en el centro del pozo, no cualquiera de los bordes de acrílico auto-fluorescente. Después de que el bien se posiciona, ejecute el script automatizado 7. El script genera una imagen JPEG utilizando la imagen JPEG utilizando el filtro de cubo HEX cada 20 segundos cubo filtro FAM y.
4. Después de que se completó la secuencia de comandos, transferir estas imágenes de la carpeta de almacenamiento temporal antes de ejecutar muestras adicionales.
   1. Crear 2 carpetas: 1 para cada fluoróforo (es decir, "HEX" y "FAM"). Almacene las dos carpetas en la misma carpeta principal. En cada fluoróforocarpeta, crear una carpeta marcada con el número de copias de ADN presentes en la muestra (por ejemplo, 0, 10, etc.).
   2. Transfiera todos los archivos con el prefijo 'HEX' en la subcarpeta correspondiente en la carpeta 'HEX'. Transfiera todos los archivos con el prefijo "GFP" en la subcarpeta correspondiente en la carpeta 'FAM'.
5. Repetir las Secciones 8.2 a 8.4 para las reacciones qRPA con 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^{4, 5} y 10 VIH-1 copias de ADN.
6. Después de recoger los datos de todas las muestras qRPA en un experimento, cargar el script "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Cuando se le pregunte por el guión, seleccione la carpeta principal que contiene las carpetas fluoróforas 2, que a su vez contienen las imágenes para cada concentración en subcarpetas.
   NOTA: La secuencia de comandos generará automáticamente un archivo de hoja de cálculo en el directorio padre en el que los datos de fluorescencia HEX se guardarán en una hoja named 'HEX', y los datos de fluorescencia FAM se guardarán en una hoja denominada 'FAM'. En cada hoja, el número de ciclos está en la lista en la columna B, y los datos de fluorescencia en tiempo real para aumentar las concentraciones de la plantilla se dan en las columnas C, D, etc. Cada dato de fluorescencia en tiempo real es la intensidad media de fluorescencia de la imagen capturada en ese punto de tiempo.
7. Utilice la función de gráfico de dispersión predeterminada en el programa de hoja de cálculo para trazar las celdas B2: H61 de la "HEX" y hojas 'fam' para visualizar la fluorescencia en tiempo real y generar gráficos similares a las de las figuras 2A, 2B, 3A y 3B.
   NOTA: La hoja de cálculo generada en la etapa 8.6 también se puede utilizar en los guiones "JoVE_qRPA_standard_curve.m" y "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Representative Results

Discussion

Con el fin de obtener datos significativos de cuantificación utilizando el algoritmo de MATLAB, el usuario debe seleccionar valores de entrada apropiados cuando se le solicite. Después de iniciar cada secuencia de comandos en las secciones 5 y 6, todas las variables de entrada se solicitan automáticamente en la ventana de comandos y salidas se generan automáticamente. En la sección 5.7 se pide al usuario que seleccione un umbral de pendiente. El valor del umbral de pendiente afecta al cuadrado del coeficiente de correlación (r ²⁾ de la forma. Al utilizar datos de fluorescencia primas exportadas desde un termociclador, los valores entre 2,0 y 5,0 tienden a producir un alto coeficiente r ^2. En la sección 5.8, el usuario debe indicar el número de desviaciones estándar por encima del fondo para establecer el umbral positivo. Para anotar una muestra como positiva o negativa, el script determina automáticamente la _muestra diferencia Δ entre el máximo y el mínimo de fluorescencia para cada muestra utilizando los datos de fluorescencia primas exportadas de la termal ciclador. Se calcula la diferencia promedio Δ _fondo y _fondo estándar σ la desviación de las muestras de control de todo no-objetivo. Una muestra se considera positiva si _muestra Δ es más que z × _fondo σ anteriormente Δ _fondo. En la Sección 5.10 que el usuario decida si desea utilizar el umbral predeterminado o establecer un nuevo umbral. Si el usuario desea establecer un nuevo umbral, determinar el nuevo umbral experimentalmente mediante la realización de 3 experimentos cada uno conteniendo 12 reacciones RPA sin ningún VIH-1 ADN presente. Establecer el umbral en el aumento promedio en la intensidad de fluorescencia a partir de estos experimentos, más 3 desviaciones estándar. Después de completar la sección 6, el guión JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m vuelve automáticamente la concentración de ADN estimado para cada reacción qRPA (en log10 copias). Si el script determina que no ADN del VIH-1 estaba presente en la muestra, la concentración estimada aparece como "Necias negativas para el VIH "o" no válido ", dependiendo de si la señal fluorescente para el control positivo interno supera el umbral (z × σ _fondo + Δ _fondo). Si el usuario está validando la curva estándar con concentraciones de muestra conocida, la secuencia de comandos también devolverá una tabla adicional similar a la de la Tabla 1.

A fin de desarrollar un ensayo de RPA en tiempo real que proporciona la cuantificación exacta, la consistencia experimental es crucial. Por ejemplo, utilizar los mismos cebadores y sondas alícuotas tanto para la curva estándar y experimentos de validación. También evitar los ciclos de congelación-descongelación mediante el almacenamiento de las alícuotas de cebadores y sondas a 4 ° C entre los experimentos en lugar de -20 ° C. Las alícuotas de plantilla utilizados para los experimentos de curva estándar de validación y se almacenan en la misma manera. Gránulos de enzimas del EPR y reactivos del mismo lote se utilizan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Por último, becautilizar RPA carece verdaderos «ciclos» para controlar con precisión la velocidad de amplificación, la estandarización de pasos de usuario es absolutamente imprescindible. En el montaje de las reacciones, el usuario siempre debe seguir los mismos pasos en el mismo orden, el gasto de aproximadamente la misma cantidad de tiempo en cada paso. Reacciones siempre se deben mezclar suavemente con una punta de pipeta nueva, y las burbujas siempre deben ser eliminadas. Antes de la amplificación, las reacciones deben mantenerse a una temperatura constante, y el termociclador o software microscopio siempre deben estar preparados antes de cargar las reacciones para evitar cualquier amplificación a temperaturas subóptimas que podrían influir en la cuantificación. Cualquier variación en las condiciones iniciales de la reacción puede dar lugar a la inconsistencia en los resultados experimentales.

Cuando se utiliza un microscopio para recoger datos, variables adicionales deben ser controladas para minimizar la variación en la intensidad de fluorescencia. Todas las reacciones se deben colocar en la misma región en la etapa más caliente, y el microscoPE debe centrarse en la misma región del pozo para cada muestra. Incluso si se siguen estas prácticas, los datos de fluorescencia recogidos en un microscopio pueden presentar variabilidad debido a puntos brillantes locales que forman de manera natural durante las reacciones RPA, la formación de burbujas dentro de las cámaras de reacción, o fotoblanqueo resultantes de la exposición repetida a la luz de excitación. La influencia de estas variables es evidente en los datos de fluorescencia recogidos en el microscopio (Figuras 4A y 4B), que demuestran la variabilidad de referencia, picos, y depresiones. Estas características están ausentes de los datos de fluorescencia recogidos en el ciclador térmico (Figuras 3A y 3B). En última instancia, la recogida de datos en el microscopio es sólo para fines de prueba de principio y el final del ensayo se llevará a cabo en un lector de fluorescencia de campo operable con una geometría más precisa y software de control que minimiza estas variables.

Otro importanteaspecto del proceso de desarrollo del ensayo qRPA es la consistencia en el procesamiento de datos. El protocolo descrito en la sección de métodos utiliza secuencias de comandos para procesar los datos de fluorescencia primas (almacenados en un archivo de hoja de cálculo) recogidos de un ciclador térmico o un microscopio. Todos los experimentos se utilizan para construir la curva estándar se deben formatear de forma idéntica. Cuando se utiliza un termociclador para recopilar datos, la misma disposición de la placa debe ser utilizado, y los datos de los pozos que no contienen reacciones RPA no debe ser exportado. Cuando se utiliza un microscopio para recopilar datos, el formato de los datos debe coincidir con el formato de los datos exportados de forma automática desde el termociclador. Por ejemplo, los datos no-control de destino deben estar en las celdas C2: C61, y los datos de aumento de las concentraciones de la plantilla debe estar en celdas D2: D61, E2: E61, etc. Si hay varias repeticiones de cada concentración en un experimento, la serie de dilución ^2º replicar debe pedirse izquierda a derecha desde la ausencia de control de destino (NTC) de mayor concentración yguardado en las columnas inmediatamente a la derecha ^de la 1ª replicar serie de dilución. Por ejemplo, en el diseño de la placa utilizada en la Sección 1.2 con 2 repeticiones para cada muestra, los datos de fluorescencia para la primera repetición de cada muestra en la serie de dilución se deben guardar en las celdas C2: datos H61 y fluorescencia para la segunda repetición de cada muestra en la serie de dilución debe estar guardado en células I2: N61. Para el diseño de la placa utilizada en la Sección 1.2, este es el formato predeterminado al exportar datos desde el software termociclador a una hoja de cálculo.

Los datos representativos proporcionados a partir de experimentos VIH-1 qRPA demostrar el apoyo de prueba de concepto de que RPA puede utilizarse para la cuantificación de la concentración de ácido nucleico en muestras desconocidas. Clínicamente útil VIH-1 pruebas de carga viral tienen un rango clínico de al menos 4 órdenes de magnitud, una precisión de 0,5 log10 copias, y un límite de detección-de-de por lo menos 200 copias ^19,20. El ensayo de ADN del VIH-1 descrito cumple estos criteria y es más preciso a bajas concentraciones, como se muestra en la Tabla 1. Por lo tanto, con la inclusión de una etapa de la transcriptasa inversa, estos resultados sugieren que un ensayo de VIH-1 RT-RPA puede tener el potencial para medir el VIH-1 en la carga viral muestras clínicas. Cuando se desarrolla un ensayo de qRPA, ajustando los parámetros del algoritmo puede sintonizar el rango dinámico sensibilidad y lineal en función de las necesidades clínicas. La Figura 6 muestra que el ajuste de z (un parámetro que determina el umbral para las muestras positivas) puede influir en la sensibilidad y precisión a baja y alta concentraciones objetivo. Además, puede ser posible para aumentar la resolución y la precisión de la cuantificación mediante la incubación de las reacciones a una temperatura inferior o usando menos de acetato de magnesio, disminuyendo así la tasa de amplificación.

Esta prueba de concepto qRPA ensayo se puede usar para cuantificar la concentración de las muestras que contienen el VIH-1 de ADN. El ensayo descrito en este qRPA manuscript incluye instrucciones detalladas sobre cómo montar reacciones RPA en tiempo real, desarrollar y defender un IPC, y procesar los datos de fluorescencia primas para construir una curva estándar que se puede utilizar para cuantificar muestras desconocidas. Con las instrucciones detalladas que se incluyen, este protocolo puede adaptarse para cuantificar la concentración de ADN en una amplia variedad de muestras.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI