Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

Summary

Provided es un protocolo para desarrollar un ensayo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real para cuantificar la concentración inicial de muestras de ADN utilizando un termociclador o un microscopio y calentador de etapa. También se describe el desarrollo de un control positivo interno. Se proporcionan scripts para procesar datos de fluorescencia sin procesar en tiempo real.

Abstract

Recientemente se demostró que la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA), una plataforma de amplificación isotérmica para la detección de patógenos, puede utilizarse para cuantificar la concentración de muestras de ADN utilizando una curva estándar. En este manuscrito, se proporciona un protocolo detallado para desarrollar e implementar un ensayo cuantitativo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real (ensayo qRPA). Utilizando la cuantificación del ADN del VIH-1 como ejemplo, se describe el ensamblaje de reacciones de RPA en tiempo real, el diseño de una secuencia de control positivo interno (IPC) y la coamplificación del IPC y el objetivo de interés. Se proporcionan instrucciones y scripts de procesamiento de datos para la construcción de una curva estándar utilizando datos de múltiples experimentos, que se pueden utilizar para predecir la concentración de muestras desconocidas o evaluar el rendimiento del ensayo. Por último, se describe un método alternativo para recopilar datos de fluorescencia en tiempo real con un microscopio y un calentador de etapa como paso hacia el desarrollo de un ensayo qRPA en el punto de atención. El protocolo y los scripts proporcionados se pueden utilizar para el desarrollo de un ensayo qRPA para cualquier objetivo de ADN de interés.

Introduction

Amplificación de ácidos nucleicos cuantitativa es una técnica importante para la detección del medio ambiente, transmitidas por los alimentos, y los patógenos transmitidos por el agua, así como para el diagnóstico clínico. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) es el método estándar de oro para la detección sensible, específica y cuantitativa de ácidos nucleicos, por ejemplo, para el VIH-1 pruebas de carga viral, la detección de patógenos bacterianos, y la detección de muchos otros organismos ^{1 - 3.} Durante tiempo real qPCR, cebadores amplifican ADN del patógeno en ciclos, y una señal fluorescente que se genera es p....

Protocol

1. Programe el termociclador de tiempo real las reacciones qRPA

1. Crear un nuevo protocolo en el software termociclador.
   1. Inserte una etapa de pre-incubación: 39 ° C durante 1 min.
   2. Añadir un segundo paso: 39 ° C durante 20 seg seguido por una placa de lectura.
   3. Por último, inserte un "ir a" que se repite el segundo paso 59 veces más.
   4. Guarde el protocolo.
2. Crear una nueva placa en la pestaña "Editor de placa" del software. Seleccionar pocillos de la placa correspondientes a las ubicaciones de las reacciones RPA (aquí, el uso de los pocillos A1, A4-A8, B1, y B4-B8).
   NOTA: No es importante si se esp....

Results

Antes de seleccionar una secuencia para servir como el IPC en experimentos con qRPA objetivo (VIH-1) ADN, control positivo interno (IPC) candidatos se generan y se seleccionaron por su capacidad para amplificar en las reacciones qRPA sin el VIH-1 ADN presente. Candidatos IPC son más largos que el objetivo (VIH-1) DNA para prevenir la formación IPC desde fuera de la competencia del VIH-1 la formación de amplicón. Como se muestra en la Figura 2A, la generación de dos C. candidatos parvum.......

Discussion

Con el fin de obtener datos significativos de cuantificación utilizando el algoritmo de MATLAB, el usuario debe seleccionar valores de entrada apropiados cuando se le solicite. Después de iniciar cada secuencia de comandos en las secciones 5 y 6, todas las variables de entrada se solicitan automáticamente en la ventana de comandos y salidas se generan automáticamente. En la sección 5.7 se pide al usuario que seleccione un umbral de pendiente. El valor del umbral de pendiente afecta al cuadrado del coeficiente de correla.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			qRPA
VIH-1 cebador directo	Tecnologías de ADN integradas	oligos de ADN personalizados	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'
Imprimación inversa para el VIH-1	Integrated DNA Technologies	oligos de ADN personalizados	5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3'
Sonda de VIH-1	BioSearch Technologies	oligonucleótidos de ADN personalizado	5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'
Sonda IPC	BioSearch Technologies	oligos de ADN personalizado	5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
Reactivos RPA exo (pellets, tampón de rehidratación, acetato de magnesio	TwistDx	TwistAmp exo
Tiras de tubo de PCR	BioRad	TLS0801
PCR tiras de tubo de tapa plana	BioRad	TCS0803
Adhesivo Micro-seal	BioRad	558/MJ
Diana del VIH-1 (pHIV-IRES- eYFPΔ Env y Delta; VifΔ Vpr)			plásmido personalizado, véase: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Caracterización y detección de lentivirus competentes para la replicación artificial de un rango de huéspedes alterado. Terapia Molecular 8, 118– 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
ADN genómico masculino humano Applied	Biosystems	360486
bloque frío de 96 pozos	Cole Parmer	EW-36700-48
Termociclador	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tampón Tris 1,0 M, pH 8,0	EMD Millipore	648314
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Promega	V4321
Agua libre de nucleasas	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	También es posible pedir un objetivo sintético de doble cadena de IDT si el usuario no está equipado para trabajar con C. parvum (un agente infeccioso BSL-2). Los cebadores de PCR y RPA para C. parvum se diseñaron utilizando el número de acceso AF115377.1
de GenBank cebador de largo avance	Tecnologías de ADN integradas	Oligos de ADN personalizados	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'
Imprimación inversa larga PCR	Integrated DNA Technologies	oligos de ADN personalizados	5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Kit de extracción	Qiagen	28704
TAE 10X tampón	EMD Millipore	574797
Agarosa	Sigma Aldrich	A9539
Experimentos de
Microscopio de fluorescencia vertical	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Calentador de etapa	Bioscience Tools	TC-GSH
Controlador de temperatura de alta estabilidad de precisión de 1 canal	Bioscience Tools	TC-1100S
CUBO DE FILTRO FAM/GFP Juego	Zeiss	38 (000000-1031-346)	excitación BP 470/40 nm, emisión BP 520/50 nm
Cubo de filtro HEX	Chroma	49014	excitación BP 530/30 nm, emisión BP 575/40 nm
Cortadora láser	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" acrílico negro	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm acrílico transparente	McMaster Carr	PD-72268940
Súper pegamento	Office	Depot Duro súper pegamento
Aceite mineral de grado PCR	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Análisis de datos
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB MATLAB
script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"	Incluido en el
MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"	Incluido en el
MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"	Incluido en SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Incluido en SI
JoVE_qRPA_base.ai	Incluido en SI
Software AxioVision	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Incluido en SI