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NOTA: Hombre C57BL / 6 ratones (5-7 semanas de edad) son de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canadá.) Y manipulados de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Sainte-Justine CHU. Alfombrillas de explantes de tejidos bronquiales son una buena fuente de células epiteliales bronquiales primarias para la investigación de los efectos pro-apoptóticos de LMP en las células epiteliales. Este protocolo describe la generación in vitro de LMP, así como un método para detectar células epiteliales apoptóticas en explantes de tejidos bronquiales tratados con LMP. Este protocolo consiste en 3 secciones.
1. LMP producción y caracterización
NOTA: Para evitar la contaminación, asegurar que todos los materiales utilizados en este experimento son estériles o en autoclave. Realice todos los pasos a TA en una cabina de seguridad biológica en condiciones estériles, a menos que se indique lo contrario.
1.1) La estimulación y percepción de los diputados9
- Descongelar una alícuota de 10 millones de células T CEM en un baño a 37 ° C. Diluir en 10 ml pre-calentado medio libre de suero hematopoyético tales como X-Vivo, en un tubo estéril de 15 ml y centrifugar a 200 gx 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio de pre-calentado.
- La transferencia de células en un matraz de cultivo de tejido T75 (para células en suspensión) con 15 ml de medio hematopoyético precalentado como X-VIVO e incubar durante 4 días en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Después de 4 días, transferir todo el medio de cultivo y las células en un matraz de cultivo de tejidos T175 que contiene 100 ml de medio fresco. Continuar la incubación de las células durante aproximadamente 72 horas bajo las mismas condiciones hasta que han crecido hasta una densidad de 2 millones de células / ml.
- Células uniformemente dividido entre cuatro matraces T175 cada 150 ml de medio fresco que contiene y continuar el cultivo de células hasta que las células han crecido (aproximadamente 48 h de incubación) a una densidad de 2 millones / ml.
- 6 células en un nuevo frasco T175 que contiene 150 ml de medio fresco, para mantener los 2 millones / ml densidad celular.
- Añadir actinomicina D (disuelto en DMSO a 2 mg / ml) al medio a una concentración final de 0,5 mg / ml y se incuba durante 24 hr.
- Transferir todo el medio de cultivo en tubos de 50 ml cónicos y centrifugar las células a 750 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante a 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 1500 xg durante 15 min para eliminar los fragmentos de células grandes.
- Transferir el sobrenadante en una botella de 250 ml y ultracentrífuga a 12.000 xg durante 50 min. Descartar el sobrenadante y recoger pellets.
- Gránulos Wash LMPs enriquecido con PBS 40 ml estéril en un tubo de 50 ml por centrifugación a 12.000 xg durante 50 min. Repita este paso dos veces.
- Recoger el último sobrenadante de lavado; que se utilizará como control del vehículo. Suspender los pellets LMPS en 1ml de PBS y transferir en un 1,5 ml microtubo estéril. Alícuotas y almacenar LMP aisladas a -80 ° C (para evitar múltiples ciclos de libre deshielo).
1.2) Caracterización de los diputados mediante análisis FACS 4
- Preparar 2 muestras de tampón de anexina, 1 con y otro sin CaCl 2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, más o menos 5 mM CaCl 2.
- Filtra búfer anexina y FACS fluido envolvente de flujo usando un filtro de 0,22 micras para eliminar las partículas.
- Diluir 1 l de LMP en 44 l de tampón de anexina con 5 mM CaCl 2 en un tubo de FACS. Preparar otro tubo con 1 l de LMP en 44 l de tampón de anexina sin CaCl 2 (control negativo).
- Añadir 5 l de AnnexinV-Cy5 en cada tubo y mezclar bien. Incubar durante 15 min a TA en la oscuridad. Detener la reacción mediante la dilución de la mezcla con 400 l de FACS de fluido de funda flujo en cada tubo.
- Añadir 10 l (200.000 cuentas) de 7 micras conteo beasuspensión ds como estándar interno en cada tubo para obtener un recuento absoluto.
- Establecer puertas de tamaño relativo (FSC-H, PMT E00, escala logarítmica) y granularidad relativa (SSC-H, PMT 325, escala logarítmica) gráfico de puntos en el citómetro de flujo usando perlas fluorescentes de tamaño calibrado de 1 m (puerta 1) y que cuenta granos puerta a las 7 micras (puerta 2).
- Analizar la muestra LMP en FSC-H / SSC-H parcela usando las puertas establecidas y FL-4 canales para anexina (PMT 765, escala logarítmica) gráfico de puntos, mediante la adquisición de una señal de hasta 20.000 contar bolas se alcanzan en la puerta 2.
- Determinar los eventos AnnexinV positivos de LMP en tampón anexina contiene CaCl2, y luego restar los acontecimientos de LMP en tampón anexina sin CaCl2 (control negativo).
- Calcular el número absoluto de MPs en base a la siguiente ecuación:
1.3) Determinación de MP Protein Concentración (Bradford ensayo)
- Preparar 5 diluciones en serie de un estándar de proteína de 1,25 a 20 mg / ml. Pipetear 800 l de cada solución patrón y la muestra en un tubo de ensayo limpio por duplicado. Añadir 200 l de reactivo de colorante de Bradford a cada tubo. Mezclar bien, a continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
- Medir la absorbancia a 595 nm. Determinar la concentración de proteína de LMP usando la regresión lineal de la curva estándar.
2. Los explantes de tejido bronquial y LMP Tratamiento
NOTA: Preste especial atención al entorno de trabajo estéril y aséptica preparar las soluciones y medio utilizados en los siguientes experimentos. Para preparar la completa curación Medium, añadir 1 ml de tejido cicatricial Mediano suplementos con suero (descongelado en el hielo) a 100 ml de Tejidos Healing mediano y mezclar bien.
2.1) Preparación de explantes de tejidos bronquiales
- Antes de cultivo, rayar 6 áreas de 1 cm 2cada uno en el borde de la superficie de cada 100 mm placa de cultivo de tejidos con una hoja de bisturí. Cubra cada rascó 100 mm placa de cultivo de tejidos con 2 ml de la solución de revestimiento placa de cultivo, y se incuba el plato en un incubador de CO2 humidificado O / N a 37 ° C. Vacío aspirar la solución excedente y llenar el recipiente con 15 ml de lavado de tejidos Medio.
- La eutanasia a C57BL / 6 ratones (5 a 7 semanas de edad) por inhalación de CO2 de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité de ética del cuidado animal.
- Asépticamente diseccionar el tejido pulmonar con bisturí, pinzas Dumont super fino, y tijeras quirúrgicas. Retire con cuidado parénquima y los vasos sanguíneos. Coloque el tejido pulmonar en helada Tissue Lavado Medio para el transporte al laboratorio, en su caso.
- Además diseccionar bronquio sumergido en el medio de lavado de tejidos y separar el bronquio con un diámetro de 1 a 2,5 mm de tejidos pulmonares periféricos. Slice tejidos bronquiales en ~ 5 mm anillos bronquiales gruesas con un bisturí.
Use un movimiento de pala con las pinzas microdissecting curvas estériles para recoger los fragmentos bronquiales y colocarlos en las áreas rayadas de los platos. - Retire el medio de lavado de tejido, e incubar los fragmentos a temperatura ambiente durante ~ 5 min para permitir que se adhieran a los platos.
- Añadir 10 ml de la cicatrización completa de medio a cada plato y colocarlos en una cámara incubadora modular atmósfera controlada. Enjuague con la cámara de alta mezcla de gas O 2 (70% O 2, 25% de N 2 y 5% de CO 2,). Coloque la cámara en una incubadora orbital de sobremesa y agitar a 37 ° C. Agitar la cámara durante 24 horas a 10 ciclos por minuto para permitir que el medio fluya intermitentemente a través de los fragmentos.
- Después de 24 horas de incubación, observar los explantes de tejido bajo un microscopio óptico de contraste de fase invertida. Seleccione explantes bronquiales con movimiento completo, pelo fino y animado epitelio bronquial para el tratamiento LMP posterior.
2.2) Tratamiento LMP
- Preparar medio de crecimiento completo de la siguiente manera: crecimiento deshielo suplementos medianas con inhibidor de suero y fibroblastos en hielo. Añadir 1 ml de los suplementos de medio de crecimiento con suero y 200 inhibidor de fibroblastos l a 100 ml de medio de crecimiento; mezclar bien. Calentar el medio de crecimiento completo a 37 ° C durante 10 min antes de usar.
- Diluir LMPs aislados en un nuevo tubo eppendorf estéril con PBS para preparar una acción LMPs a una concentración de 800 mg / ml.
- Añadir 0,5 ml de medio completo de crecimiento a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.
- La transferencia de los explantes bronquiales seleccionados con las pinzas microdissecting curvas del protocolo anterior (sección 2.1) a cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos.
- Etiqueta de la placa de cultivo apropiado para identificar pozos de tratamiento LMPS y pozos de control. Añadir 25 l de stock LMP en cada tratamiento LMPs bien (para una concentración final de 40 mg / ml) y 25 l vehículo de control (véase LMP producción s) a los pocillos de control.
- Continuar la incubación en una cámara incubadora modular atmósfera controlada a 37 ° C con agitación suave.
- Después de 24 horas, lavar explantes 3 veces con PBS y se procederá a la (fijación paraformaldehído al 4% [PFA]) siguiente paso.
3. El examen histopatológico
3.1) Preparar las siguientes soluciones antes de proceder a los próximos pasos
- Preparar tampón PBS 1x mezclando NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2 PO 4, pH 7,4.
- Para preparar 4% PFA, se disuelven 20 g de PFA en 400 ml de agua, se calentó a 60 ° C con agitación; añadir unas gotas de NaOH 10 M para borrar la solución. A continuación añadimos tampón PBS 1x y ajustar el volumen a 500 ml y el pH a 7,4. Filtro y alícuota; almacenar a -20 ° C.
- Prepare los siguientes reactivos de deshidratación o de rehidratación; 100%, 90%, 70%, 50% de etanol y xileno.
e_step "> 3.2) Explante Fijación y Tejidos Sección desparafinización
- Coloque cada explante en un tubo de microcentrífuga marcado con 1,5 ml de PFA al 4% y se incuba O / N a 4 ° C. Enjuague los explantes dos veces con PBS 1x.
- Deshidratar explantes a través de una serie de alcohol (etanol 70%: 3 veces 30 minutos cada uno; etanol al 90%: 2 veces 30 minutos cada uno; etanol al 100%: 3 veces 30 min cada uno, y luego xileno: 3 veces 20 min cada uno). Realice todos los pasos a TA en una campana de humos.
- Imbed explantes de tejidos en parafina a 58 ° C en un horno. Preparar 5 micras secciones de tejido de espesor usando un micrótomo rotatorio.
- Flotador las secciones en un 56 ° C baño de agua, y luego montar las secciones en portaobjetos histológicos etiquetados. Colocar los portaobjetos en bastidores de tinción manuales y seco a 65 ° C durante 1 hora. Permita que las diapositivas se enfríen a temperatura ambiente.
- Sumerja los bastidores en 4 platos mancha consecutivas que contienen xileno durante 10 minutos cada uno para eliminar la parafina. Sumergir los bastidores en una serie de etanol para eliminar el xileno: 100%, luego 95%, THes 80%, entonces el 70%, luego etanol al 50% (5 minutos por cada paso). Enjuague los bastidores con agua del grifo durante 5 min para eliminar el etanol.
3.3) hematoxilina y eosina (H & E) tinción
- Continuar trabajando con las secciones de tejido fijadas; coloque el estante en una placa de tinción de llenado con hematoxilina de Mayer durante 15 min. Enjuague la rejilla con agua del grifo para eliminar hematoxilina durante 20 min.
- Colocar en agua destilada durante 30 sec.Place en etanol al 95% durante 30 seg. Colocar en Eosina Y placa de tinción de solución durante 1 min. Deshidratar a través de 2 cambios de etanol 95%, etanol al 100%, y xileno para 2 min cada uno.
- Realice una comprobación rápida con un microscopio para asegurarse de que se elimina el exceso eosina. Coloque 2 a 3 gotas de medio de montaje (Fisher SP15-100) en cada diapositiva, luego cubra con una tapa de vidrio.
3.4) En Detección Muerte Situ Cell: Ensayo de TUNEL
- Antes de empezar, preparar la solución de trabajo de proteinasa K: 20 g / ml enTris 10 mM / HCl, pH 7,4.
- Repita los pasos 1 a 5 de la sección 3.2 (fijación del explante y la sección de deparaffinization tejido). Enjuagar los portaobjetos con desionizada H 2 O.
- Sumergir los portaobjetos con PBS 1x durante 10 min. Escurrir el exceso de PBS. Incubar las secciones de tejido durante 30 min a RT con solución de trabajo de proteinasa K. Enjuague desliza dos veces con PBS 1x.
- Lleve a cabo el ensayo de TUNEL como se describe en el manual de instrucciones de kit de detección de muerte celular. Montar utilizando medio de montaje y cubreobjetos manualmente con cubreobjetos de vidrio.
- Analizar las muestras en un microscopio de luz. Utilice Image Pro 4.5 para analizar las células apoptóticas en el color marrón.