Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Resumen

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Resumen

Analizando las respuestas fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas (OSN) cuando son estimuladas con ligandos específicos es fundamental para entender la base de comportamientos-olfativas impulsada y su modulación. Estas propiedades de codificación dependen en gran medida de la interacción inicial entre las moléculas de olor y el receptor olfatorio (OR) expresados ​​en las OSN. El espectro de la identidad, la especificidad y el ligando de la O expresado son críticos. La probabilidad de encontrar el ligando de la O expresado en una OSN elegido al azar dentro del epitelio es muy baja. Para hacer frente a este reto, este protocolo utiliza genéticamente ratones etiquetados que expresan la proteína fluorescente GFP bajo el control del promotor de RUP definidos. OSNs se encuentran en un epitelio apretado y organizada que recubre la cavidad nasal, con las células vecinas influir en su maduración y función. Aquí se describe un método para aislar un epitelio olfatorio intacto y grabar a través de patch-clamp grabaciones las propiedades de OSN correoXpressing receptores de olor definidas. El protocolo permite que uno para caracterizar propiedades de la membrana OSN mientras se mantiene la influencia del tejido vecino. Análisis de los resultados de patch-clamp produce una cuantificación precisa de ligando / O interacciones, las vías de transducción y la farmacología, las propiedades de codificación OSN y de su modulación a nivel de la membrana.

Introducción

Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) representan el primer paso de la percepción olfativa. Situado en el epitelio olfativo que recubre la cavidad nasal en roedores, transforman la información química de los odorantes en los potenciales de acción se ha enviado a través de su axón al cerebro. Para entender mejor los mecanismos de codificación olfativas, es necesario para caracterizar las propiedades de transducción y de membrana de OSN. Hasta hace poco, la mayoría de las técnicas utilizadas para caracterizar las propiedades de OSN mamíferos se llevaron a cabo en disociado OSN ^1-4. El proceso de disociación utiliza varios (es decir, enzimas) procesos mecánicos y químicos para liberar a los OSNs de su entorno. Estos procesos provocan un bajo número de células disponibles para las grabaciones. Este número bajo puede ser aún más crítico en el caso de células GFP marcado. La disociación también elimina los locales interacciones célula a célula entre OSN y otras células del epitelio olfativo que pueden mejorar survivcol y la modulación de las propiedades OSN. Con el fin de eludir el procedimiento de disociación, una preparación intacta fue desarrollado ^5.

Cada OSN expresa un receptor olfativo (OR) seleccionado de una gran familia multigénica ^6. Hay ~ 1000 RUP expresadas en el epitelio olfativo principal en el ratón. Debido a la gran cantidad de O en los animales de tipo salvaje, las posibilidades para grabar OSN que expresan el mismo o son muy bajas. Para superar estas limitaciones, los ratones de genes dirigidos están disponibles en el que todos OSN expresan un identificadas o están etiquetados con una proteína fluorescente ^7-9. Estos OSN marcadas se usan para hacer el análisis funcional en preparaciones disociadas ^7,10,11 con los inconvenientes mencionados anteriormente. Una preparación epitelio intacto ⁵ de ratones genéticamente etiquetados por lo tanto, evita estos problemas. Permite el seguimiento de la actividad de OSN expresando RUP definidas con precisión en un entorno tan cerca en vivo posible. Además, patch-clamp grabaciones de OSN también permiten un análisis preciso de las propiedades de membrana, vía de transducción de la farmacología, ligando / O interacciones. Todos estos temas casi no se pueden analizar usando grabaciones extracelulares. Se utilizó esta técnica para controlar las respuestas de OSN que expresan los receptores de olor SR1 y MOR23 ^12,13. La viabilidad de la técnica fue confirmado por otros grupos en MOR23 expresan OSN ^14, así como en otras regiones ultraperiféricas que expresan neuronas ^15,16. El seguimiento de una población definida de OSN puede conducir al análisis de sus propiedades en muchos contextos diferentes, tales como el desarrollo ^14, el envejecimiento ^17, plasticidad inducida odorante ^18, y el papel de las variaciones en la secuencia del receptor de odorizantes de olor en la codificación de ^15. Así, este protocolo proporciona una poderosa herramienta para controlar las propiedades funcionales de OSN definidos a nivel de la membrana.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices de cuidado de los animales de la Université de Bourgogne y fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Bourgogne.

1. Los animales

1. Utilice ratones O-IRES-tauGFP ingeniería genética disponibles en el Laboratorio Jackson. Estos ratones fueron desarrollados en el laboratorio del Dr. Peter Mombaerts 'con el fin de analizar la orientación axón y el desarrollo del sistema olfativo ^19. Por ejemplo, la línea MOR23-IRES-tauGFP, código RS 006643, lleva el nombre de la cepa B6 oficial; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; del mismo modo, la línea SR1-IRES-tauGFP, código RS 6717 lleva el nombre B6 oficial; 129P2- Olfr124 ^tm1Mom / MomJ.
2. En cuanto a la edad de los animales: para un mejor resultado del protocolo, utilizar animales entre 2 y 4 semanas de edad. En este grupo de edad, la disección es más fácil (huesos más blandos, más firme epitelio olfativo) y las perillas dendríticas son bigger comparar a los animales más viejos.

2. Preparación de electrodos y Soluciones

1. Para las pipetas estimulantes: compra prepulled estimular pipetas. De lo contrario, preparar manualmente.
   1. El uso de una llama, doble seis 1 mm pipetas de vidrio en alrededor de 1 cm de la punta. Inserte estos seis pipetas más unas rectas 7 ^º en 1,5 cm tubo de aislamiento fortalecer por un ojal.
   2. Termocontraíbles el tubo para mantener los barriles unidos juntos. Adjuntar un tubo de aislamiento adicional a la otra extremidad de los barriles. Tire de esta pipeta estimulante con un extractor de múltiples barril.
   3. Añadir un poco de pegamento líquido blanco alrededor del ojal para fortalecer las puntas dobladas. Deje secar O / N.
2. Preparar 1 o 2 litros de solución extracelular normal del timbre (en mM: NaCl 124, KCl 3, _MgSO4 1,3, _CaCl2 2, _NaHCO3 26, NaH ₂ PO ₄ 1,25, glucosa 15; pH 7.6 y 305 mOsm). Mantenga a 4 ° Chasta su uso.
3. Preparar solución madre intracelular (en mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanosulfónico 30, EGTA 5, HEPES 10, sacarosa 70; pH 7,2 (KOH) y 310 mOsm. Mantenga a 4 ° C hasta su uso. Bueno para varias semanas.
4. Prepare la solución intracelular de grabación con nistatina extemporáneamente (a última hora) antes de experimento.
   1. Pesar 3 mg de nistatina, añadir 50 l de DMSO; vórtice 20 seg después sonicar 2-3 min hasta diluido por completo.
   2. Añadir 20 l de solución de DMSO-nistatina en 5 ml de solución madre intracelular. Vortex 20 seg, después sonicar 3 min. Mantener esta solución a 4 ° C y proteger de la luz directa, nistatina es sensible a la luz. Esta solución se puede usar durante unas pocas horas. Vuelva a colocar todos los días.
   3. Una vez que la preparación epitelio olfativo está bajo el microscopio, tomar parte de esta solución en una jeringa de 1 ml con una punta amarilla llama alargada para rellenar los electrodos; protegerlo de la luz directa. Una vez a temperatura ambiente, la solución de nistatinano es estable; sustituir la solución en la jeringa de 1 ml cada hora o mantenerlo en hielo.
5. Tire de electrodos de grabación con un extractor para obtener cuello largo y pequeña propina (~ 2 m) con una resistencia de 15 a 20 mO con la solución de nistatina interna.
6. Prepare la solución odorante en 0,5 M en DMSO bajo campana de humos; alícuota y mantenerse a -20 ° C hasta su uso. Diluir odorante en solución de Ringer hasta la concentración deseada. Llenar la pipeta estimulante.

3. Preparación de epitelio olfativo

Nota: los ratones O-IRES-tauGFP expresan la tauGFP bajo el control de la O promotor. En estos ratones, todas las neuronas que expresan el OR de interés están etiquetados con las buenas prácticas agrarias. Este protocolo está adaptado para RUP expresadas en todas las zonas. Sin embargo, disecciones y grabaciones son más fáciles para las RUP expresadas en la zona dorsal.

1. Anestesiar al animal mediante la inyección de una mezcla de ketamina y xilazina (150 mg / kg y 10 mg / kg de DBOpeso y, respectivamente). Decapitación puede realizarse con unas tijeras afiladas para ratones jóvenes o con una guillotina roedor adecuadamente mantenido para los ratones de más edad.
   1. Usando anillo tijeras de disección hacen una incisión medial longitudinal a través de la piel dorsal. Quitar la piel tirando de él aparte. Usando las tijeras, corte la mandíbula inferior en la articulación de la mandíbula. Retire los dientes frontales superiores por un corte coronal paralela a los dientes.
   2. Haga un corte coronal de la cabeza detrás de los ojos y mantener sólo la parte anterior de la cabeza. Sumergir en solución de Ringer helada para la disección en el ámbito.
2. Diseccionar bajo el ámbito de aplicación: en la parte ventral, hacer un corte longitudinal a lo largo de la mandíbula superior / los dientes. Cortar los huesos dorsales longitudinalmente, siguiendo el lado dorso-lateral de la cavidad nasal. Retire la mayoría de los huesos y el paladar; transferir el tabique y el epitelio que se le atribuye en Ringer oxigenada a TA.
3. Para la disección definitiva: Justo antes de comenzar la grabaciónsesión, pelar lejos el epitelio del tabique subyacente con fórceps. Separe el epitelio con pinzas y con dos 4-5 mm cortes de tijera (uso microvannas tijeras) en la parte anterior del tabique, donde la adherencia es más fuerte.
   1. Retirar con cuidado el órgano vomeronasal por el corte a lo largo de su conexión dorsal al epitelio septal. Transferir el epitelio a una cámara de grabación con la capa de moco hacia arriba; mantenga plana en la cámara con un arpa.
4. Instalar cámara bajo un microscopio vertical equipado con óptica de fluorescencia y una cámara sensible. Visualice la preparación en la pantalla del ordenador a gran aumento a través de un 40X objetivo de inmersión en agua (apertura numérica 0,8) y una ampliación 2X o 4X adicional alcanzado por una lente de aumento. Perfundir continuamente con Ringer oxigenada a TA (1-2 ml / min).

4. Grabación Sesión

1. Búsqueda de células fluorescentes: excitar a la preparación a 480nm para EGFP, que emite luz en el rango de 530 a 550 nm; orientar una perilla dendríticas que es visible de forma fiable en la fluorescencia y bajo campo brillante.
2. Llenar electrodo con solución intracelular con nistatina; eliminar las burbujas golpeando suavemente sobre el electrodo.
3. Inserte electrodo sobre soporte del electrodo, aplique presión positiva en la pipeta; La resistencia debe ser 15-20 mO.
4. Traiga electrodo cerca de la célula; una vez que la resistencia alcanza ~ 40 mO, liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa para llegar a un gigaseal.
5. Una vez que se alcanza el sello, configure el potencial de membrana en alrededor de -75 mV;
6. Una vez que se abre la celda, proceder con protocolos de estimulación, tratamientos farmacológicos. Para medir la respuesta a una sola estimulación odorante, ficha 200-500 mseg de la actividad espontánea, para estimular 500 mseg y medir la respuesta de la célula para un máximo de 10 seg ^13. Para los tratamientos farmacológicos, perfundir los agentes farmacológicos enla concentración deseada ^20.

Análisis 5. Datos

1. Analizar las corrientes provocados por la estimulación odorante como sigue: la amplitud máxima, el tiempo de subida (tiempo necesario para alcanzar el 90% de la amplitud máxima, en mseg), la corriente total (área bajo la curva en PAS), el tiempo en el 50% (tiempo entre el inicio y el desplazamiento de la respuesta al 50% de la amplitud máxima, en mseg).
   1. El uso de las corrientes de pico de transducción (amplitud máxima alcanzada) a diferentes concentraciones, dibujar y ajustar una curva dosis-respuesta utilizando la ecuación de Hill: I = Imax / (1 ​​+ (K _medio / C) ^n), donde I representa la corriente máxima IMAX la respuesta máxima a concentraciones de saturación, K1 / 2 la concentración a la que se llegó a la mitad de la respuesta máxima, C la concentración de odorante y n el coeficiente de Hill.
2. Analizar las grabaciones de potencial de membrana en pinza de corriente para la despolarización máxima, la total potencial suscitó (área bajo la curva en mVsec); registro de actividad clavar espontánea durante 30 seg a 1 min grabaciones; registro de la excitabilidad través picos provocados por la inyección de corrientes (10.5 Pa).

Resultados

El resultado de este protocolo depende de la calidad de la disección. Estos pasos de disección deben ser cortos (menos de 10 a 15 min) y preciso (es decir, para evitar daños del epitelio). La Figura 1 ilustra cómo una preparación ideal se parece a diferentes niveles de aumento. Con una ampliación baja en campo claro los diferentes tipos de células (tales como perillas de OSN, el apoyo a las células) son distinguibles (Figura 1). En el nivel de ampliación más alta, normalmente 8...

Discusión

La capacidad de este protocolo para controlar correctamente las propiedades de OSN saludables depende en gran medida de la calidad de la preparación. Por lo tanto, los pasos de disección son críticos. En primer lugar, es crítico que prestar atención a la calidad (pH, osmolaridad), la oxigenación y la temperatura del medio de disección (pero no congelado enfriado con hielo). En segundo lugar, la manipulación del epitelio con herramientas de disección debe ser tan limitado como sea posible para evitar daños. Por último, e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
mesa vibratoria con jaula de Faraday	TMC	63-500 SERIES	requerida : aísla el sistema de grabación de las vibraciones inducidas por el entorno (movimientos del experimentador, vibraciones de equipos como ventiladores para enfriar computadoras, etc.); también se puede comprar con una jaula de Faraday, o equipar con una jaula de Faraday hecha a medida; esta jaula se recomienda para evitar el ruido eléctrico de la
óptica
del entornomicroscopio	Olympus	BX51WI	microscopio vertical equipado con epifluorescencia; platina fija o móvil según la preferencia del usuario
	objetivos Olympus	LUMPLFL40XW	al menos 2 objetivos requeridos: un 4X o 10X para el aproximación aproximada a la célula; y un ejemplo de inmersión de larga distancia 40X Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
lupa	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUTAMENTE NECESARIO: colocado en la trayectoria de luz entre el objetivo y la cámara; permite ampliar la imagen en la pantalla para llegar con precisión a la perilla con la cámara de electrodos de grabación
	Olympus	DP72	se requiere una buena cámara para ver las neuronas en fluorescencia así como en campo claro; el software de control es simple y permite tomar fotografías y hacer imágenes de cámara en vivo para monitorear el acercamiento del electrodo a la celda. No es necesaria una cámara ultrasensible
que filtre	Olympus/Chroma		en función de la proteína fluorescente utilizada en los ratones; ejemplo para GFP: excitación: BP460-490: emisión: HQ530/50m
amplificador	HEKA	EPC10 USB	monitorea las corrientes que fluyen a través del electrodo de registro y también controla el soplado enviando una señal TTL al spritzer; la configuración del EPC10 está controlada por
software	informáticoHEKA	Patchmaster	controla el amplificador durante el experimento
micromanipulador	Sutter	MP225	micromanipulador de precisión, permite movimientos precisos de hasta 1/10 de micrómetro; este modelo es muy estable; evite los manipuladores hidráulicos que pueden derivar
extractor de electrodos	Sutter	P97	con un filamento de canal ancho FT345-B;   para preparar pipetas de grabación de aproximadamente 2µ m de diámetro con una punta larga para llegar a las células; la resistencia debe ser de 15 a 20Mohm con solución de abrazadera de parche perforada
vidrio	Sutter	BF120-69-10	en nuestras condiciones de grabación, este vidrio es ideal para registrar pipetas
grabación	Warner Instruments	RC-26G	se necesita una cámara para establecer la preparación bajo el microscopio. Para mantener la preparación en el centro de la cámara, se debe usar una red/ancla.
	WPI	TW100F-4	unido en grupos de 7, estas pipetas se utilizan para preparar pipetas estimulantes pretiradas
extractor multibarril	MDI	PMP-107-Z	por asociación de tracción y torsión, este extractor nos permite preparar electrodos de soplado con inyector de presión de precisión de 7 barriles
	Compañía Toohey	P / N T25-1-900 Un solo canal	este inyector de presión de precisión controla la presión expulsada en el extractor de barriles múltiples; es controlado manualmente o por el amplificador por un 5V
Micromanipulador	Narishige	YOU-1	Un manipulador grueso es suficiente para acercar el electrodo de soplado al lugar de registro
Tubos N	/A		tygon para llevar la presión del puffer a la pipeta de soplado
Soluciones/perfusión/Productos químicos
bomba de vacío	gardner denver	300 series	Una bomba de membrana vibratoria es más silenciosa y eficiente que otros tipos de bombas
sistema de perfusión	N/A	N/A	sistema de perfusión por gravedad con tubo de polietileno para introducir y sacar la solución externa de la cámara de registro
nistatina	Sigma-Aldrich	N3503	obligatorio para perpar solución interna para parche perforado abrazadera de parche
DIMETILSULFÓXIDO	Sigma-Aldrich	D5879	utilizado para disolver la nistatina para la solución interna del parche perforado
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S9625	solución extracelular
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P4504	solución intracelular/extracelular
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma-Aldrich	C7902	solución extracelular
Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	solución extracelular
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	solución extracelular
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	solución extracelular
Bicarbonato de sodio Sigma-Aldrich S6297EGTA (Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético)	Sigma-Aldrich	Solución interna	E3889
Hidróxido de potasio	Sigma-Aldrich	P1767
solución interna Sulfóxido de metilo	Sigma-Aldrich	W387509	solución intracelular
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389	solución intracelular