Summary
حقن المجسم من lentiviruses معربا عن cDNAs أو shRNAs يمكن أن تعدل التعبير الجيني في مناطق محددة في الدماغ لدى الفئران. هنا، نقدم بروتوكول الجمع بين الحقن المجسم مع المهام السلوكية، مثل الاختبار الميداني المفتوحة (OFT) والسباحة الاختبار القسري (FST).
Abstract
حقن المجسم هو تقنية مفيدة لتقديم lentiviruses عيار عالية لمناطق الدماغ المستهدفة في الفئران. Lentiviruses يمكن إما بإفراط أو التعبير الجيني ضربة قاضية في منطقة مركزة نسبيا دون أضرار جسيمة للأنسجة الدماغ. بعد الشفاء، ويمكن اختبار الماوس حقنه في مختلف المهام السلوكية مثل اختبار الحقل المفتوح (OFT) والسباحة الاختبار القسري (FST). تم تصميم OFT لتقييم الحركة والنمط الظاهري حريصة في الفئران عن طريق قياس مقدار الوقت الذي يقضيه الماوس في وسط حقل مفتوح الرواية. سوف فأر أكثر قلقا يمضون وقتا أقل بكثير في وسط الميدان رواية مقارنة بالمجموعة الضابطة. وFST يقيم النمط الظاهري المضادة للاكتئاب عن طريق قياس مقدار الوقت الذي تنفق الفئران غير متحرك عند وضعها في دلو من الماء. وهناك الفأر مع النمط الظاهري المضادة للاكتئاب تنفق أقل بكثير متحرك الوقت مقارنة للسيطرة على الحيوانات. والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام ster يسودحقن eotactic من الفيروسة البطيئة بالتزامن مع الاختبارات السلوكية لتقييم مدى عوامل وراثية تعدل سلوك الحيوان.
Introduction
وقد الماوس تستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب لأنه من السهل التلاعب وراثيا. تقنيات الجينات خروج المغلوب تسمح للباحثين للتحقيق في كيفية عمل كل عامل وراثي الأشكال السلوكيات الماوس. وعلاوة على ذلك، يوفر نظام لجنة المساواة العرقية loxp أداة قيمة لنسيجيا وخلية type- بالضربة القاضية جين معين في الفئران، والتي تمكن الباحثين لدراسة وظيفة الجينات في الأنسجة المختلفة. 1 ومع ذلك، من الناحية العملية، وأنماط التعبير من المروجين لجنة المساواة العرقية يصعب السيطرة ولقد لذلك العديد من السائقين حتى الآن لجنة المساواة العرقية التي أنشئت لم يتحقق التعبير منطقة محددة. 2،3
بدلا من ذلك، حقن المجسم هو الأسلوب الذي يستهدف مناطق محددة في الدماغ من الماوس الكبار. عن طريق حقن الفيروسات المعدلة وراثيا معربا عن كدنا] أو shRNA، لا يمكن أن يتحقق التشكيل منطقة محددة في التعبير الجيني. على الرغم من أن حجم الدماغ من كل فأر يختلف، موقع مناطق محددة في الدماغ يمكن تحديدها باستخدام coordi المجسمتعيين المتحكمة من المعالم على الجمجمة من مخ الفأر. المعالم الأكثر شيوعا هي bregma، لامدا، والخط interaural. باستخدام الإحداثيات التي تم الحصول عليها من أطلس الدماغ، 4 في المكان المحدد من كل منطقة في الدماغ يمكن تحديدها من قبل انتيرو-الخلفي (A / P)، وسطي الاطراف (M / L)، و (D / V) محاور الظهري البطني من bregma / interaural خط التقاطع. عادة الفيروسات حقنها في أدمغة الفئران الموسومة هي إما أحمر أو أخضر بروتين فلوري (RFP أو GFP)، بحيث الحقن يمكن التأكد عن طريق الفحص المجهري الفلورسنت.
تقييم السلوكية للفئران ضرورية خصوصا للبحوث الأساسية من الاضطرابات النفسية. أعراض الاضطرابات النفسية لدى المرضى الذين عادة ما تشمل السلوكيات الشاذة. بعض هذه السلوكيات البشرية هي الحفظ تطويريا ويمكن تحاكي مباشرة، ولاحظ في الماوس. على سبيل المثال، والاكتئاب يمكن أن تكون على غرار في الماوس عن طريق قياس اليأس السلوكي. الأشخاص الذين يعانون من الاكتئاب كثيراأون تشعر وكأن شيئا لم يفعلوا سيساعد أي وقت مضى، من أعراض التي يمكن أن تؤدي في النهاية إلى الانتحار. في القوارض، وهذا يمكن أن تكون على غرار باستخدام اختبار السباحة القسري (FST)، والذي يقيس مقدار الوقت ماوس السباحة مقابل عائمة في بركة من الماء (ينظر إليها على التخلي). يتم التحقق من صحة هذا النموذج من قبل إنقاذ النمط الظاهري مع عقاقير مضادة للاكتئاب. 7،8،9 الفئران التي تلقت عقاقير مضادة للاكتئاب سوف تنفق أقل كثيرا من الوقت متحرك مقارنة مع الضوابط غير المعالجة. تم تصميم اختبار السلوكي آخر، الاختبار الميداني المفتوحة (OFT) لتقييم الحركة في الفئران، وبالإضافة إلى ذلك يمكن استخدامها لتحليل النمط الظاهري حريصة في الفئران. 5،6 يقوم هذا الاختبار على أساس أن الفئران يشعرون أكثر أمانا عندما تكون قريبة على الحائط في حقل مفتوح الرواية. سوف الفئران نوع البرية استكشاف في النهاية بيئة جديدة، كما أنها حيوانات غريبة. ومع ذلك، تنفق وقتا أقل في وسط الميدان يدل على القلق في الماوس، والماوس سوف لن تكون قادرة على التغلب على initiaل الخوف يأتي نتيجة للبيئة جديدة. القلق من الفأرة، وكمية من مقدار الوقت الذي يقضيه في وسط حقل مفتوح، يمكن مقارنة القلق السريرية في البشر، والتي هي موجودة في العديد من الاضطرابات النفسية.
الجمع بين الحقن المجسم مع النماذج السلوكية هو وسيلة جديدة لتغيير التعبير عن جين معين في منطقة الدماغ المستهدفة. ومن ثم يمكن تحديد أثر هذان التعبير الجيني على السلوكيات الماوس. وعلى النقيض من خروج المغلوب الدماغ كله، وهذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لأنها تستهدف مناطق محددة في الدماغ فقط. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما يتم إجراء حقن المجسم في الكبار النوع البري الماوس، لذلك، وقد تم الحفاظ على الذاتية التعبير الجيني في جميع أنحاء مراحل النمو. هذه الطريقة سوف تجنب تأثير الخلط إذا كنت بحاجة الجينات من أجل البقاء خلال المرحلة الجنينية أو بعد الولادة للتنمية. أحد أوجه القصور الرئيسية هو أن فئران التجارب تحتاج إلى اجتيازهاح عملية جراحية الغازية، التي جماجم من الفئران لا بد من فتح. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد درجة التشكيل الجيني من عيار وكفاءة الفيروس. يحتاج الفيروس ليتم حقنه في المنطقة الصحيحة باستخدام الإحداثيات المجسم، الأمر الذي يتطلب أدوات خاصة. التحقق من موقع الحقن الصحيح لا يمكن إلا أن تكتمل بعد الوفاة.
تم عرض هذه الطريقة تستخدم سابقا لاختبار إشراك جين معين في مختلف الأمراض العصبية. على سبيل المثال، فيروسية بوساطة رني استهداف الجين ث (الذي يسمح الدوبامين أن يتم تصنيعها) تم حقنها في المكتنزة المادة السوداء، وأجريت تحليل السلوك الحركي. استخدمت 10 دراسة أخرى حقن المجسم لإسكات DISC1 الفيروسة البطيئة لتقييم سلوك الماوس في العلاقة إلى الفصام. ضربة قاضية من DISC1 أدى إلى زيادة الحركة ردا على الجدة (التشابه الأعراض الإيجابية في انفصام الشخصية)، وزيادة الجمود فيFST. 11 وبالمثل، وجدت دراسة إضافية 5-HT 1B overexpression أدى إلى زيادة السلوك الاستكشافي في التجارة المشروعة، بما يتفق مع النمط الظاهري المضادة للقلق باستخدام هذا الأسلوب. يمكن 12 حقن المجسم تقديم فيروس لجنة المساواة العرقية للحث على إعادة التركيب في لجنة المساواة العرقية loxp الفئران . وقد استخدم هذا الأسلوب لحذف انتقائي مستقبلات Y2 في اللوزة ونواة السرير من الانتهائي السطور. بناء على التحليل السلوكي، وقد وجدت هذه الفئران إلى النمط الظاهري المضادة للاكتئاب عندما تم حذف هذا الجين في اللوزة المركزية، ولكن لا النمط الظاهري عندما تم حذف هذا الجين في اللوزة basolateral أو نواة السرير من الانتهائي السطور. 13 وهكذا، هذه التقنية يوفر أداة فريدة من نوعها لدراسة تأثير الجينات على سلوكيات الحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم اتباع جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة ولاية بنسلفانيا، IACUC # 44057
1. الفيروسة البطيئة الإنتاج
ملاحظة: قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، ينبغي أن يكون LentiX-293 الخلايا في 80٪ confluency.
- شطف الخلايا مع DMEM قبل ترنسفكأيشن واحتضان في 10 مل من DMEM / 10٪ FBS مع البنسلين (100 وحدة دولية / مل)، وستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق على RT.
- تمييع DNA وPolyethylenimine (PEI) (1 ملغ / مل) في 1: 3 نسبة (1 ميكروغرام من الحمض النووي: 3 ميكرولتر من PEI) في 1 مل من DMEM ودوامة لمدة 1 دقيقة. وأضاف أن حجم DNA تعتمد على تركيز الحمض النووي. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
- على سبيل المثال، استخدم 20 ميكروغرام من البلازميد الحمض النووي، وتتألف من 10 ميكروغرام من ناقلات البلازميد، 5 ميكروغرام من psPax2 14 البلازميد، 5 ميكروغرام من حويصلي فيروس التهاب الفم (VSV) مع 60 ميكرولتر من PEI لكل طبق.
- إضافة 1/10 من إجمالي حجم مستنبت من DMEM (أي 1 مل 10 مل مستنبت في صحن 100 ملم). إضافة 1 مل من الحمض النووي PEI قطرة قطرة الخليط في طبق ودوامة الطبق حولها حتى إلى مستنبت غير مختلطة بشكل جيد مع DNA.
- احتضان لمدة 6 ساعات في RT وإزالة طاف. إضافة 5 مل من مستنبت.
- 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وجمع طاف الفيروسية وتدور في 627 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية في أنبوب 50 مل. تصفية 30 مل من طاف الفيروسي من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون في أنبوب نابذة فائقة السرعة.
- إضافة الماء المعقم لتحقيق التوازن في أنابيب، وتغطية الأنابيب مع قطعة صغيرة من parafilm. أنابيب تدور في 11249 x ج لمدة 120 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة السائل باستخدام طرف فراغ.
- إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة الأنبوب. صخرة بلطف الأنبوب عند 4 درجة CO / N.
- للعودة لوقف الفيروس، ماصة روأضاف PBS في الخطوة 1.8 على بيليه 10 مرات، والحرص على عدم لمس بيليه مع طرف. بيليه لن يتم إعادة معلقة حتى اكتمال هذا.
- قسامة الفيروس في 10-20 ميكرولتر في الأنبوب، ومضة للتجمد في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 ° C.
2. حقن المجسم
2.1) إعداد الصكوك
- وضع زوج من مقص، ملقط كليلة النهاية، حامل الإبرة، مشرط، ومسحات القطن، وقطعة قماش في حزمة مختومة مع مؤشر التعقيم، والأوتوكلاف قبل الجراحة. بالإضافة إلى ذلك، الحصول على 10٪ اليود البوفيدون، و 70٪ الكحول الإيثيلي، الغرز للامتصاص، وسادة التدفئة، والدموع الاصطناعية، وكوب حبة تعقيم، الحفر، مثقاب، 2 المحاقن، حقنة الحقن، والحلاقة الكهربائية، مسكن (كيتوبروفين)، مخدر (آفيرتين)، والقفازات، وجهاز المجسم مع مضخة الحقن.
- جعل 1.25٪ حل آفيرتين الطازجة ذلك اليوم، فلتر في غطاء العقيمة باستخدام 0.2 &# 181؛ م معقم مرشح حقنة، ووضع في قارورة المصل معقمة. خلط 2.5 غرام من 2،2،2-tribromoethyl الكحول في 5 مل من ثلاثي الأميل الكحول، ثم تذوب في 200 مل من الماء. الحفاظ على درجة الحموضة أقل من 5. 15
2.2) إعداد ماوس
- إدارة آفيرتين على أساس الوزن من الفأرة (375 ملغ / كلغ). 15 حقن الفأر مع آفيرتين عن طريق الحقن (IP) وداخل الصفاق، وبعد ذلك وضعت مرة أخرى إلى قفصه حتى تخدير كامل.
- إعطاء مسكن عن طريق الحقن IP (ketaprofen، 5 ملغ / كلغ)، ومكان الدموع الاصطناعية على العيون من الفأرة لمنع جفاف.
- تأكد من أن الفأر هو نائم بالكامل من قبل معسر أقدامهم. إذا يستجيب الماوس إلى قرصة القدم، ثم إعطاء المزيد من مخدر (في جرعة من 50 ميكرولتر). حلق الرأس من الفأرة باستخدام الحلاقة الكهربائية. حلاقة المنطقة التي سيتم تشغيلها على (عادة من خلف الأذنين وعلى الجزء العلوي من الخطم)، والمنطقة المحيطة بها.
- ضع الماوس طn لجهاز المجسم. تحط الأسنان الأمامية على المشبك الأمامي، وخفض المشبك وتشديد بحيث الفك آمن تماما.
- إدراج أشرطة الأذن في قناة الأذن لتحقيق الاستقرار الكامل للرئيس. يجب الحرص على عدم إدراج أشرطة الأذن في غاية الآن، والتي يمكن أن تضر الأذن الداخلية. وبمجرد الانتهاء، يجب أن يكون الجسم من الفأرة قادرة على أن تحرك حركة طفيفة دون تعطيل الموقف من الرأس.
- وضع وسادة التدفئة تحت الماوس من أجل تنظيم درجة حرارة الجسم الماوس، في جميع أنحاء الداخلي.
- تنظيف المنطقة الجراحية بدقة. باستخدام قطعة من القطن، وفرك 10٪ البوفيدون اليود في حركة دائرية، بدءا من منتصف موقع الجراحة ونقل إلى الخارج. ثم، استخدم قطعة من القطن لفرك 70٪ الكحول الإيثيلي على موقع الجراحية في نفس الشكل. كرر مرتين.
2.3) شق الأولى
- بمجرد هيأهم الماوس، فتح حقيبة معدات معقمة. تغيير القفازات قبل touchiنانوغرام الصكوك. إخراج قطعة قماش معقمة ووضع الأدوات على القماش. إذا أي صك يلمس سطح الامم المتحدة معقمة، واستخدام الزجاج حبة تعقيم لمدة 15 ثانية لتعقيمها.
- أخذ مشرط في ملقط اليد وحادة في نهاية المهيمنة في اليد غير المسيطرة. استخدام الملقط حادة في نهاية بلطف قبضة الجلد من الفأرة، وإجراء شق باستخدام مشرط. بدء شق حوالي 1.5 سم فوق الأذنين (نحو الأنف) وتمتد إلى حوالي 0.5 سم تحت الأذنين. تمديد شق عموديا إلى أسفل منتصف الرأس الماوس، لفضح bregma (الشكل 1).
- بمجرد تصور bregma، واتخاذ غيض من القطن المعقم لإزالة بلطف أي دم تغطي سطح الجمجمة. استخدام اثنين من نصائح القطن لدفع الجلد نحو الجانب من الرأس.
2.4) إعداد المعدات
- بعد إزالة أي دم من سطح الجمجمة، وتصور bregma بشكل واضح، وإعداد حقنة (يخدعوحدانية التركيز من 10 8 TU / مل، وحجم 1 ميكرولتر). في غطاء الدخان، وملء المحاقن مع الفيروس ليتم حقنه. ضمان عدم وجود فقاعات في الداخل. وضع الحقنة في جهاز المجسم، والتأكد من أن يتم تأمينها بشكل كامل.
- انخفاض ببطء الحقنة حتى يصبح الحق فوق سطح الجمجمة، بحيث يتم تعيين غيض من إبرة حقنة معقمة لتقاطع bregma والخط interaural. تعيين هذه النقطة الصفر، وتحديد إحداثيات من هذه النقطة.
- اعتمادا على المنطقة الدماغ من الفائدة، تختلف الإحداثيات المجسم. تحديد هذه الإحداثيات من خلال الاستفادة من أطلس الدماغ 4. مرة واحدة يتم تحديد الإحداثيات، نقل إبرة حقنة لتتطابق مع تلك الإحداثيات. استهداف التلفيف المسنن باستخدام الإحداثيات: M / L = +/- 1 مم، A / P = -1.82 مم. خفض الإبرة إلى اليمين فوق الجمجمة لتصور حيث يحتاج إلى حفر حفرة.
- رفع حقنة قليلا، واتخاذ الحفر ووضع ثنائية الحفرر الحق فوق موقع الحفر الهدف في حوالي 45 درجة زاوية في الجمجمة. بدء أعمال الحفر، والحفاظ على الحفر حتى يعطي الجمجمة الطريق. عندما يعطي الجمجمة الطريقة، يمكن الكشف عن انخفاض في المقاومة. يجب الحرص على عدم الحفر في الدماغ، وذلك لمنع وقوع أضرار القشرية.
- أخذ معلومات القطن المعقم ويمحو أي دم من الفتحة.
- خفض الحقنة بحيث غيض يجلس الحق على سطح الدماغ (وليس الجمجمة). تعيين D / V تنسيق (عمق) إلى 0. السفلى المحقنة إلى العمق المطلوب، بناء على إحداثيات أطلس الدماغ. للوصول إلى التلفيف المسنن، تعيين D / V ل-1.79 مم.
- بدء حقن بمعدل 0.2 ميكرولتر / دقيقة. مشاهدة لضمان أن الحقنة لا تنزلق أقل من العمق المطلوب. إذا حدث هذا، ورفع بلطف المحقنة إلى العمق المطلوب مرة أخرى.
- بعد الانتهاء من الحقن، والانتظار حوالي 2 دقيقة للتأكد من أن أي فيروس المخلفات قد تم استيعابها. رفع ببطء الحقنة واستخدام غيض من القطن لإزالة أي لىمضغة من موقع الحقن.
- تكرار لنصف الكرة الأرضية الأخرى.
2.5) خياطة
- إزالة خياطة معقمة وإبرة من التعبئة والتغليف، وقبضة الإبرة باستخدام أصحاب الإبرة. مواجهة حافة مدببة من الإبرة بعيدا عن حامل الإبرة. عقد ملقط كليلة نهاية في اليد غير المسيطرة، واستخدامه لقبضة الجلد على الماوس. تبدأ مع اليد المهيمنة.
- دفع برفق الخيط من خلال الجلد واستخدام الملقط حادة نهاية للاستيلاء على الجلد في الجانب الآخر من الشق. سحب مواد خياطة الجروح من خلال حتى تبقى حوالي 0.75 بوصة.
- ترك الإبرة، واستخدام الملقط حادة في نهاية التفاف خياطة في وقت قريب حامل إبرة واحدة، ثم، والاستيلاء على 0.75 بوصة المتبقية خياطة مع حامل الإبرة، وسحب الخيط من خلال ذلك أن حامل الإبرة والإبرة في نهاية المطاف على الجانب المعاكس الرأس إلى ما كانوا في الأصل. هذا ينبغي أن تشكل عقدة.
- كرر هذه الخطوةثلاث مرات أكثر، بالتناوب الجانب من الرأس حامل إبرة ينتهي في كل مرة.
- قطع الخيط وكرر الخطوات 2.5.1-2.5.3 حتى يتم إغلاق الجرح.
2.6) العناية بعد العملية
- بلطف إزالة أشرطة الأذن من الماوس، وإزالة الفك من المشبك الأمامي.
- الحفاظ على الماوس على لوحة التسخين حتى يستيقظ ويتحرك حول من تلقاء نفسها. مراقبة الماوس يوميا، والحفاظ على والعين لعلامات الألم، مثل عدم الاستمالة، وتناول الطعام أو الشرب. إعطاء مسكن إضافي عند الضرورة.
3. فتح الاختبار العملي
3.1) إعداد
- الحصول على مربع فارغ، الساحة البلاستيكية التي تحتوي على أبعاد 50 سم × 50 سم، 50 سم مع جدران عالية (ولكن يمكن أن يكون أكبر قليلا). تنظيف الساحة مع 70٪ الكحول الإيثيلي قبل بداية التجربة. تأكد من الكحول الإيثيلي قد جفت تماما قبل وضع الماوس في الساحة.
- وضع الساحة علىالأرض، ومحاولة للتأكد من تعيين الإضاءة لتقليل الظلال والوهج.
- في حالة استخدام برنامج تتبع، ضع الكاميرا مباشرة فوق الحقل المفتوح، ما يقرب من 1.5 قدم فوق المجال مفتوحا (بعيدا بما فيه الكفاية ليشمل كامل الساحة كلها، ولكنه قريب بما فيه الكفاية ليكون لها رؤية واضحة للالماوس).
- اقامة منطقة في وسط مربع (حوالي مساحة 30 سم × 30 سم). 16 لضبط المنطقة، انقر فوق علامة التبويب المنطقة 1 في لوحة جانبية.
- حدد الخطوط العريضة الشكل في اللوحة العليا، وتحديد محيط منطقة المركز. حدد إضافة منطقة، ثم انقر على الجزء الداخلي من منطقة المركز. باستخدام برنامج المطالبات، اسم منطقة (وهذا سوف يكون يشار إلى 'مركز' لهذا الإجراء). إذا كان سيتم سجل الاختبار السلوكي من جهة، وتأكد من وينقسم الجزء السفلي من الحقل إلى 10 سم × 10 سم الساحات، تميزت باستخدام الشريط.
- إعداد البرنامج بحيث الإعدادات صحيحة، والفار بسهولة VISIبليه على الشاشة. إنجاز ذلك عن طريق ضبط إعدادات الكشف على الجهاز لتكون متوافقة مع الساحة اختبار (إضاءة)، واللون الماوس.
ملاحظة: عندما تكون الإعدادات صحيحة، ينبغي للنظام تتبع الماوس فقط، وليس أي الظلال أو البول / البراز. تعتمد إعدادات برامج معينة على الإضاءة من الساحة، وهذا اللون من الفأرة.
3.2) التأقلم واختبار
- نقل فئران التجارب إلى السلوكية الغرفة 1 ساعة قبل الاختبار من أجل تأقلم لهم محيطهم. ترك الفئران في قفص من أجل التأقلم.
- تشغيل الكاميرا على شريط المهام السلوكية ووضع الماوس نحو الجبهة الوسطى في الساحة بحيث الماوس يواجه الحائط.
- تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 5 دقائق، والابتعاد عن الساحة. إذا كان ذلك ممكنا، وترك الغرفة حتى لا تؤثر بطريق الخطأ الماوس.
- مرة واحدة 5 دقائق ما يصل، وإزالة الماوس ووضعها في قفص.
- استخدام 70٪ ايثيل الكحول لتنظيف شاملة من الحقل قبل الشروع في الماوس المقبل. تأكد من الكحول الإيثيلي قد جفت تماما.
3.3) التهديف
- النظر في الماوس كما يجري في وسط الميدان عندما تكون جميع الكفوف الأربعة هي داخل الوسط 30 سم × 30 سم.
- تحديد مقدار الوقت الماوس تنفق في المركز. بدلا من ذلك، تحديد هذه المرة باستخدام تتبع البرامج (مثل Noldus ethovison).
- للقيام بذلك، انتقل إلى علامة التبويب والتحليل، وانقر على "الحركة" في إطار التشكيلات التحليل. حذف الفئات المعينة حاليا، ثم حدد "في منطقة" تحت علامة التبويب موقع. حدد منطقة المركز. بعد ذلك، حدد "إخراج التحليل" (ضمن علامة التبويب النتائج) لعرض النتائج. A جدول يسرد الوقت الذي يقضيه حركة ليجب أن تظهر كل محاكمة.
- خلاف ذلك، يسجل OFT باليد. يجب أن يكون المجال مفتوحا الساحات 25 10 سم × 10 سم المبين في الجزء السفلي من مكتب مستشار رئيس الوزراءمجال ن (كما هو موضح في الخطوة 3.1.3). تحديد مقدار الوقت الماوس تنفق في المركز، بالإضافة إلى عدد الإدخالات في وسط الساحة. 16
ويعتبر مركز 30 سم × 30 سم منطقة وسط حقل مفتوح: ملاحظة. ويعتبر فأر كما تسكن منطقة وسط إذا كان كل الكفوف الأربعة داخل منطقة 30 سم × 30.
4. القسري السباحة اختبار
ملاحظة: اسمحوا ما لا يقل عن خمسة أيام بين المهام السلوكية.
4.1) إعداد
- الحصول على دلو 2 L واضح، وملء مع 22 ° C المياه. وضع دلو على الطاولة، ومحاولة للتأكد من ضبط الإضاءة لتقليل الظلال والوهج.
- في حالة استخدام برنامج تتبع، ضع الكاميرا مباشرة فوق من دلو.
- إعداد البرنامج بحيث الماوس مرئيا بسهولة على الشاشة.
4.2) التأقلم واختبار
- نقل فئران التجارب إلى ريال عماني السلوكيام 1 ساعة قبل الاختبار حتى يتأقلم المناطق المحيطة بها. ترك الفئران في قفص من أجل التأقلم.
- تشغيل الكاميرا على شريط المهام السلوكية. بلطف، ضع الماوس في وسط دلو من الماء. تأكد من عدم إسقاط الماوس في. انخفاض ببطء الماوس، حتى قدميها الأمامية تلمس الماء أولا. الحرص على منع رؤوسهم من غمر.
- تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 6 دقائق، والابتعاد عن المنطقة السلوكية.
- مرة واحدة 6 دقائق ما يصل، وإزالة الماوس من دلو، وتخلص من الماء الزائد قبل وضع الماوس مرة أخرى في قفص.
4.3) التهديف
- في حالة استخدام تتبع البرامج، تعيين في المئة الجمود إلى 11٪، كما اقترح Noldus (يجب أن يكون هذا الإعداد الافتراضي)، لتحديد الوقت عائمة مقابل السباحة.
- لقياس باستخدام نظام التتبع، انتقل إلى علامة التبويب والتحليل، وانقر على الحركة تحت التشكيلات التحليل. حذف الفئات المعينة حاليا، ومن ثم تحديد حالة التنقل، وعلىلوحة الجانب الأيسر (تحت السلوك الفردي). وضع الجمود إلى 11٪.
- اختيار المسار التصور، ضمن علامة التبويب النتائج. اختر خرج تحليل (ضمن علامة التبويب النتائج) لعرض النتائج. A جدول يسرد الوقت الذي يقضيه حركة ليجب أن تظهر كل محاكمة.
- إذا ناحية التهديف، وقياس الوقت الماوس تنفق السباحة أو تسلق الجبال، ومقدار الوقت الذي يقضيه الماوس متحرك. وبالإضافة إلى ذلك، وقياس زمن الوصول لأول مرة متحرك. انظر الشكل 2 في القسم نتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حقن المجسم دقيق يعتمد بشكل كبير على تحديد الإحداثيات الصحيحة. يجب تعيين رأس الإبرة المستخدمة لحقن الفيروس مباشرة على تقاطع bregma والخط interaural (الشكل 1). فمن المفيد استخدام stereomicroscope للتأكد ما إذا كان أو لم يتم وضع الإبرة بشكل صحيح. عند النظر من خلال المجهر، وينبغي وضع الإبرة بحيث إذا تم حقن الفيروس، فإنه سيهبط مباشرة على تقاطع bregma والخط interaural. وهذا هو، ينبغي أن توضع في فتحة في إبرة حقنة مباشرة فوق التقاطع. في هذه الدراسة، والفيروسة البطيئة معربا عن shRNA ضد RBM8a، وهو العامل الرئيسي في مجمع اكسون مفترق طرق، وحقنه في التلفيف المسنن. يعبر عن الفيروسة البطيئة أيضا RFP لتسمية الخلايا العصبية المصابة الشكل 2 يدل على أن الفيروس تم حقنه في المنطقة الصحيحة كما يدل على ذلك إشارة حمراء (الشكل 3).
_content "> ولتحقيق أهمية في المهام السلوكية، وينبغي أن حجم العينة تتراوح 12-15 الفئران في المجموعة. ويمكن إجراء المهام السلوكية بعد أسبوعين من الحقن المجسم. وفي التجارة المشروعة، النمط الظاهري حريصة غير موجودة إذا الفئران يقضون وقتا أقل بكثير في وسط حقل مفتوح مقارنة مع مجموعة التحكم. وتشير النتائج إلى أن ضربة قاضية من RBM8a في التلفيف المسنن من فئران بالغة يؤدي إلى السلوكيات حريصة (p <0.05، الشكل 4). وفي FST، لم يكن هناك اختلاف يمكن ملاحظتها في الجمود بين السيطرة وفئران التجارب، مما يوحي بأن RBM8a ضربة قاضية في التلفيف المسنن لا يؤثر على السلوك الاكتئابي (الشكل 5). التحليل الإحصائي يتألف من أداء الذيل اثنين، واثنين من عينة غير المتكافئ التباين اختبار (ت).
الشكل 1: تقاطع Bregma والاتحاد البرلماني الدوليالخط أذني. لحقن المجسم، يجب أن تكون مبطنة إبرة حقنة مع تقاطع bregma والخط interaural. يتم تعيين هذه النقطة الصفر.
الشكل 2: توضيح تخطيطي الجدول الزمني للتجربة برمتها.
الرقم 3: شريحة الدماغ التمثيلية التي توضح نجاح الحقن من الفيروس في التلفيف المسنن شريط النطاق = 100 ميكرون.
الرقم 4: مقدار الوقت الذي تحكم والفئران التجريبية للبقاء في مركز لتوسيع حقل الرواية فئران التجارب تنفق signif.وقت أقل icantly في وسط الساحة، مما يشير إلى أن النمط الظاهري حريصة (N = 9-11، *، T 18 = -2.72، p <0.05، يعني SEM)
الرقم 5: مقدار الوقت الذي تحكم وفئران التجارب غير قادرة على الحركة في FST الفئران التجريبية لا تختلف عن الضوابط في الوقت الذي يقضيه متحرك (N = 9-11، T 18 = 1.25، P> 0.05، يعني SEM)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حقن المجسم الناجحة تعتمد على ثلاثة عوامل هي: الحفاظ على الماوس على قيد الحياة، وتحديد نقطة الصفر الصحيحة للإحداثيات (رأس الإبرة على تقاطع bregma والخط interaural)، وتحديد عمق المناسب لنقطة الصفر (رأس الإبرة مجرد لمس السطح الخارجي للأنسجة المخ). الجدوى من الفئران هو المهم. البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية يمكن بمساعدة من خلال التأكد من أن الفأر هو تخدير بشكل صحيح ويتلقى مسكن ملائم. ومن المعروف الألم أن تكون سببا رئيسيا من الفقراء الانتعاش بعد الجراحة. ضمان أن الفأر هو تخدير كامل في جميع أنحاء الجراحة (يجب أن لا يستجيب لالقرصات القدم)، وإعطاء الجرعة الصحيحة من مسكن (بناء على وزن الماوس)، من شأنه أن يساعد البقاء على قيد الحياة. 17 بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تبقى الماوس على وسادة التدفئة طوال عملية جراحية حتى يستيقظ من التخدير. الفئران لا يمكن تنظيم درجة حرارة الجسم عندما يتم تخدير فيها. على المزاج الجسمسوف ature إسقاط بشكل ملحوظ خلال عملية جراحية. على الرغم من أن طول عملية جراحية المجسم قصيرة نسبيا، يمكن أن انخفاض درجة حرارة الجسم بصورة خطيرة بقاء الماوس. تقنية خياطة المناسبة هي أيضا دور فعال في إجراء عملية جراحية ناجحة. سوف الفئران في محاولة للاختيار في الغرز، لذلك فإنه من المهم للتأكد من أن الغرز ضيقة بما يكفي لمنع الإزالة، ولكن ليس ضيق جدا لوضع الكثير من التوتر على الجرح. يجب أربعة عقدة في كل غرزة ضمان أن الماوس غير قادر على إزالة خياطة. خياطة المناسبة لا يقل أهمية عن جرح مفتوح سيزيد من التعرض للعدوى، والتي من شأنها أن تؤثر سلبا على أي التجارب السلوكية.
وOFT هو النموذج السلوكي يهدف إلى تقييم الحركة والنمط الظاهري حريصة في الفئران. عند اختبار سلوك الماوس، فمن المهم أن نكون حذرين جدا عند التعامل مع الفئران ووضع على الساحة. في التجارة المشروعة، تم تصميم نموذج لإقران القبض الماوس، عرجن وضعها في بيئة جديدة، مع الفضول الطبيعي وترغب في استكشاف الجدة. وهناك نوع الماوس البرية تكون في البداية مترددة في الدخول في وسط الميدان مفتوحا، حيث أنها أكثر ضعفا، ولكنها ستفعل ذلك في نهاية المطاف، وذلك بسبب الفضول الفطري لها. في الماوس قلقا، فإن الخوف من عبور الفضاء أكثر عرضة (وسط الميدان) تكون أكبر من فضولهم الطبيعي والرغبة في استكشاف، الأمر الذي سيؤدي في وقت أقل بكثير قضى في المركز. للتأكد من أن النموذج يعمل بشكل صحيح، فمن المهم لتقليل الإجهاد المرتبطة عوامل أخرى غير المجال مفتوحا. الإجهاد يمكن التقليل من خلال السماح الماوس ليتأقلم إلى غرفة السلوكية (حتى البيئة الخارجية غير ممكن متغير التباس)، وتنظيف الميدان بين الفئران، لضمان أن جميع الروائح المرتبطة الماوس السابق قد أزيلت. 18 هذه الخطوات التي ينبغي أن تساعد في القضاء على أي اختلافات التي تنتج عن غير صحيح handliالفئران نانوغرام. في هذه الدراسة، أنفقت RBM8a الفئران ضربة قاضية وقتا أقل بكثير في وسط حقل مفتوح الرواية، مقارنة بالمجموعة الضابطة. هذا يدل على النمط الظاهري قلق، لأن الفئران هي أكثر ترددا للدخول إلى وسط الميدان مفتوح الرواية، حيث أنهم أكثر ضعفا، مقارنة بالمجموعة الضابطة.
يسعى FST للتحقيق في النمط الظاهري المضادة للاكتئاب في الفئران. عندما وضعت في دلو من الماء، تعتبر الفئران التي تنفق وقتا أقل بكثير العائمة مقابل السباحة لديك النمط الظاهري المضادة للاكتئاب. يتم تفسير الجمود في اختبار السباحة القسري كما اليأس السلوكية (مثل التخلي). التحقق من صحة هذا النموذج عن طريق العلاج المضادة للاكتئاب. 7،8،9 الفئران التي تتلقى الأدوية المضادة للاكتئاب سوف يقضون وقتا أقل بكثير العائمة مقارنة مع الضوابط، مما يدل على النمط الظاهري المضادة للاكتئاب. في هذه الدراسة، لم RBM8a الفئران ضربة قاضية لا تختلف كثيرا عن السيطرة على الفئران في الوقت الذي يقضيه متحرك. ثيالصورة يشير إلى أن RBM8a ضربة قاضية في التلفيف المسنن من فئران بالغة إذا لم يثر النمط الظاهري الاكتئاب، أو مضادة للاكتئاب. في دراستنا السابقة، RBM8a overexpression في التلفيف المسنن من الفئران الكبار يقلل كثيرا من الوقت متحرك مقارنة مع الضوابط، مما يشير إلى تأثير مضاد للاكتئاب. 16
واستهدفت الحقن المجسم المستخدمة في التمثيل في هذه الورقة إلى التلفيف المسنن. وقد تم اختيار التلفيف المسنن كموقع الهدف، لأن الجينات في المصالح ويعبر عن درجة عالية من هناك في الماوس الكبار. بالإضافة إلى ذلك، ارتبط التلفيف المسنن مع الاكتئاب والقلق. على سبيل المثال، استخدمت إحدى الدراسات الفئران POMC-Chr2 لتفعيل انتقائي الخلايا الحبيبية إما في ظهري أو التلفيف المسنن بطني. تفعيل كل من ظهري وبطني المسنن التلفيف أدى إلى زيادة استكشاف بيئة جديدة، مما يشير إلى الدور المحتمل للالتلفيف المسنن في القلق. 19 دراسة مختلفةوجد أن الفئران قد يعانون من ضعف تكوين الخلايا العصبية زادت الجمود في FST، مما يدل على النمط الظاهري الاكتئاب. 20 وعلاوة على ذلك، وتفعيل ا ف ب الزراعة العضوية 1 في الدماغ الأمامي يؤدي إلى تأثير مضاد للاكتئاب في FST، التغذية قمع الجدة، واختبار استهلاك السكروز. عندما كان VEGF طرقت إلى أسفل في التلفيف المسنن من أب الزراعة العضوية 1، وخسر هذا النمط الظاهري المضادة للاكتئاب. وتشير هذه البيانات إلى أن 21 التلفيف المسنن له دور في الفيزيولوجيا المرضية من القلق والاكتئاب، وأشارت إلى أن التلفيف المسنن قد يكون منطقة جيدة لاستهداف لدينا التشكيل الجيني والتجارب السلوكية. تم استخدام الفيروسة البطيئة على وجه التحديد، بحيث أن يصاب جميع الخلايا في التلفيف المسنن، بدلا من تقسيم الخلايا فقط (الارتجاعي).
مزيج من هذه التصاميم التجريبية الثلاث (بالإضافة إلى المهام السلوكية الأخرى) هو وسيلة جديدة لتقييم الظواهر السلوكية في الفئران، لأن الفيروس يمكن أن تحقن في specifمنطقة الدماغ جيم في بعض الأحيان إنمائية محددة. عن طريق الحقن المجسم من الفيروسة البطيئة يقترن المهام السلوكية يستغرق سوى بضعة أشهر لاستكمال ويسمح للباحثين لجمع بيانات أولية عن الآثار السلوكية في التعبير الجيني في منطقة محددة في الدماغ. في المقابل، الفئران خروج المغلوب الشرطية غالبا ما يستغرق سنوات لتوليد. وعلاوة على ذلك، نوع من الخلايا تفضيل الفيروسات يمكن أن تستخدم لزيادة الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، يمكن أن الفيروسات تصيب فقط تقسيم الخلايا (مثل الخلايا الجذعية العصبية في التلفيف المسنن) في حين أن الفيروسة البطيئة يصيب جميع أنواع الخلايا. 22،23 وهكذا، جنبا إلى جنب مع زملاء الحقن، وتوفر هذه البروتوكولات التجريبية تستخدم على نطاق واسع والتحقق من صحتها بشكل فردي سريع ولكن بطريقة شاملة لاختبار دور جين معين في منطقة الدماغ المستهدفة، على السلوكيات الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
References
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in sterotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A.
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
