Artículo de método

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

DOI:

10.3791/52655

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6 de mayo de 2015

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1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

En este artículo

Resumen

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A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

Resumen

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Adenovirus de serotipo 5 (Ad5) ha sido ampliamente modificado con métodos tradicionales de transgén para el desarrollo de vacunas. Las eficacias reducidas de estos vectores Ad5 tradicionalmente modificados en los ensayos clínicos podrían ser correlacionados principalmente con Ad5 inmunidad pre-existente (PEI) entre la mayoría de la población. Promover el desarrollo de vacunas Ad5-vectored resolviendo la preocupación de Ad5 PEI, la innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha empleado. Por mérito de esta estrategia, Ad5 vectored-que primero construyó el transbordador hexón plásmido HVR1-Sus Kwas-HVR5-6 / pH5S subclonando la región hipervariable (HVR) 1 de hexón en un plásmido lanzadera previamente construido HVR5-His 6 / pH5S, que tenía Su etiqueta 6 incorporado en el HVR5. Se sintetizó Este fragmento de ADN que contiene un epítopo de HVR1 ELDKWAS VIH. 6 / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5-Fue entonces linealizado y co-transformada con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL),para la recombinación homóloga. Este plásmido recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His se transfectó en células para generar el vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His. Este vector fue validado para tener la aptitud cualitativa indica viral título física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) y la correspondiente relación / IP VP. Tanto el epítopo VIH y His 6 estaban en la cápside Ad5 expuesto en la superficie, y retenidos antigenicidad epítopo específico de los suyos. Un ensayo de neutralización indica la capacidad de este vector divalente para eludir la neutralización por sueros Ad5-positivo in vitro. Inmunización ratones demostró la generación de robusta inmunidad humoral específica al epítopo de VIH y su 6. Este estudio de prueba de principio sugirió que el protocolo asociado con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser factible utilizar para la generación de vacunas vectorizadas-Ad5 mediante la modificación de diferentes proteínas de la cápside. Este protocolo podría incluso ser fás modificado para la generación de vacunas de adenovirus-vectorizada raras serotipo.

Introducción

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Adenovirus humano (Ad) es un virus de tamaño medio sin envoltura con una nucleocápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN de cadena doble. Ad pertenece a la familia Adenoviridae, con una clasificación en siete grupos (A a G). Cada grupo contiene virus de diferentes serotipos. De los cuales, adenovirus serotipo 5 (Ad5) del grupo C ha sido el más estudiado y el que más se aplica para los enfoques vectored como la terapia génica y vacunas.

La estrategia transgén tradicional ha sido desarrollado y aplicado para las modificaciones de Ad5, que se caracteriza por el desplazamiento de los genes tempranos de virus con un gen de interés, y la expresión del gen de centrado de intereses en un huésped. Ejemplos de ello son la construcción de pENV9 / Ad5hrΔE3 mediante la sustitución de gen temprano 3 (E3) con el gen rev de Simian Virus de Inmunodeficiencia 1, la construcción de AdCMVGag mediante la sustitución de gen temprano 1 (E1) con el gen gag de la Inmunodeficiencia HumanaVirus (HIV) 2, y la construcción de Ad lac Z mediante la sustitución de E1 con lac Z gen 3. La amplia aplicación de la estrategia tradicional transgén en Ad5 depende de los siguientes méritos: la amplia gama de anfitriones para Ad5, la factible ingeniería gen en el virus y la propagación de virus, la gran alojamiento de inserto de gen extraño y la seguridad de Ad5 4,5. Sin embargo, los reducidos eficacias de terapias clínicas vectored-Ad5 por el uso de esta estrategia ha sido un importante cuello de botella, que ha sido asignada para ser asociado principalmente con Ad5 PEI, ya Ad5 es tan frecuente entre la mayoría de los niños y los adultos 4,6.

Para superar el principal cuello de botella de Ad5, el objetivo principal es el desarrollo de una estrategia alternativa eludir Ad5 PEI. La inmunidad innata 7, la inmunidad adaptativa, tales como anticuerpos neutralizantes (NABS), 8-10 y T CD8 + respuestas de las células 10 contra Ad5 se ha demostrado que contribute al Ad5 PEI, con Ad5 NAbs apareciendo a desempeñar el papel dominante en las contribuciones al Ad5 PEI 10,11. Por otra parte, Ad5 Nabs epítopos objetivo situadas en proteínas de la cápside, incluidos el principal hexón proteínas, fibra y base de pentón. De los cuales, hexón es el objetivo principal de Ad5 NAbs 8,11-13. Basándose en estos hallazgos, una innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha introducido. Esta nueva estrategia destaca la sustitución o incorporación de proteínas de intereses en las proteínas de la cápside Ad5, que desplaza o máscaras de los epítopos neutralizantes Ad5, que conduce a la disminución de reconocimiento por parte de las administraciones y NAbs vector Ad5 eficientes. Es de destacar que esta estrategia es competitivo ya que también puede ayudar a hosts provocar inmunidad humoral y la inmunidad celular robusto potente mediante la presentación de antígenos directamente-de-interés para el sistema inmune 4,14,15. Basado en esta estrategia, la clonación molecular y rescate Ad vector viral recombinante se pueden dividir estructuralmenteen cuatro pasos principales: (a) la preparación de fragmento de gen de interés ya sea por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o síntesis; (B) la ligación de fragmento de gen en un plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de interés y los brazos homólogas a una cadena principal de adenovirus; (C) la recombinación homóloga por la co-transformación del plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de intereses con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) la transfección de plásmido linealizado adenoviral recombinante para rescatar el vector Ad recombinante constituida con antígenos de intereses.

Nuestro grupo y algunos otros han extendido esta estrategia de incorporación de anuncio alternativo para Ad desarrollo de la vacuna vectorizada contra diferentes agentes patógenos infecciosos. Nos informó la generación de un vector recombinante Ad Ad-HVR1-LGS-Su 6 -V3 incorporando un Su-etiquetados VIH-1 antígeno V3 en la configuración regional HVR1 de Ad5 hexón (hexon5). Este vector generado desencadena strong respuesta inmune humoral específica para el epítopo V3 4. También informó el desarrollo de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 incorporando el VIH-1 membrana región ectodominio proximal (MPER) en la configuración regional HVR2 de hexon5 2. Además, el grupo del Dr. Zhou ha utilizado los beneficios de esta estrategia de incorporación Ad desarrollar Ad serotipo 3 (Ad3) vacunas vectorizadas, es decir., La generación de vectores R1SP70A3 viral mediante la incorporación de un SP70 epítopo neutralizante de Enterovirus 71 en el HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 generado NAbs fuertes y la producción de IFN-γ específicas para el epítopo SP70, que conducen a la alta tasa de protección contra Enterovirus 71 15 desafío.

A los efectos de referencia técnica, nuestro estudio se aprovechó de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación cualitativa para centrarse en la generación de un vector Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la incorporación de un antígeno del VIH-1 en HVR1 unda His en HVR5 de hexon5. El vector viral también fue generada inmunológicamente evaluado. La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser utilizado para el desarrollo de enfoques de vacunación vectored-Ad5 contra diferentes enfermedades infecciosas.

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Protocolo

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La Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Animal Uso y Cuidado Comité aprobó el uso de ratones como se describe en el presente documento con el número de protocolo aprobado 101.109.272.

1. Genética Construcción de un plásmido modificado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 con la Estrategia de la cápside-Incorporación Antígeno

  1. La construcción del plásmido lanzadera 6 / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5-
    1. Pedido un plásmido que contiene la secuencia de ADN sintetizada HVR1-Kwas entre los sitios de enzimas de restricción AgeI a AccI del gen hexon5.
    2. Digerir 6 mu g del fragmento sintetizado (HVR1-Kwas) con las enzimas de AgeI (6 unidades) y AccI (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C. Resolver el fragmento digerido en un gel de agarosa al 2% por electroforesis, y purificar el fragmento con un kit de extracción en gel de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    3. Basado en la relación molar de inserto al vector en 3: 1, usar el ADN ligasa de T4 ligasa y bUffer para ligar 12 ng del fragmento (HVR1-Kwas) en 100 ng de un plásmido lanzadera previamente construido HVR5-His 6 / pH5S 17 en un volumen de 10 l a TA durante 2 h, a través de los sitios de AgeI y AccI.
    4. Transformar 1 l de cada 10 l de el producto de ligación en 50 l de células DH5 electrocompetentes en un electroporador (a 1.800 V). Añadir 950 l de medio SOC a las células DH5a transformado y se incuba la mezcla durante 1 hora a 37 ° C, con 300 rpm. Spread 100-200 l de la mezcla de 1 ml sobre el agar Luria-Bertani (LB) que contiene kanamicina y se incuba O / N a 37 ° C.
      1. A la pantalla ~ 10 colonias por PCR dirigidos al fragmento HVR1-Kwas, mezclar el cebador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT), cebador inverso (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) y una sola colonia DH5a en una solución de mezcla maestra de PCR (de acuerdo con el protocolo del fabricante). Ejecutar las muestras en un termociclador refiriéndose al manual proporcionado con la solución mezcla maestra de PCR.
      2. Utilice el cebador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para secuenciar el fragmento HVR1-Kwas en los clones seleccionados en la sección 1.1.4.1.
  2. Construcción del plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6
    1. Recopilación de 6 g de HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 / pH5S con las enzimas EcoRI (6 unidades) y PmeI (6 unidades) durante 3 horas a 37 ° C, y purificar el fragmento que contiene los brazos de recombinación homóloga y el gen modificado hexon5 dual, como se indica en el paso 1.1.2. Linealizar el plásmido columna vertebral pAd5 / ΔH5 (GL) 16 con SwaI.
    2. Co-transformada de 100 ng del fragmento diana del plásmido lanzadera y 100 ng de la estructura linealizado pAd5 / ΔH5 (GL) en 50 l de células BJ5183 electrocompetentes para la recombinación homóloga en un electroporador (a 1.800 V). Añadir 950 l de medio SOC a las células transformadas y se incuba la mezcla durante 1 hora a 37 ° C, 300 rpm. Corre 100-200 l de la mezcla de 1 mlen el agar LB que contiene kanamicina (final de 50 mg / ml) para O / N de incubación a 37 ° C.
      1. Escoja ~ 10 pequeñas colonias en 3 ml de LB líquido que contiene kanamicina (final de 50 mg / ml) de O / N de incubación en un agitador (250 rpm, 37 ° C). Extracto de plásmidos de la cultura. Utilice el análisis de PCR para detectar las 10 colonias por la orientación del fragmento de HVR1-Kwas, como se ilustra en el paso 1.1.4.1.
      2. A la pantalla los mismos colonias mediante análisis por PCR dirigida al fragmento pIX del genoma columna vertebral, mezclar el cebador directo (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), cebador inverso (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) y una sola colonia BJ5183 en una solución de mezcla maestra de PCR (de acuerdo con el protocolo del fabricante). Ejecutar las muestras en un termociclador refiriéndose al manual proporcionado con la solución de mezcla maestra de PCR.
      3. Designar las colonias de doble positivos de PCR como pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6.
    3. Transformar 100 ng del plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 ena células DH5a como se ilustra en el paso 1.1.4.
      1. Utilice el análisis de PCR para detectar ~ 10 colonias por la orientación del fragmento de HVR1-Kwas, como se ilustra en el paso 1.1.4.1.
      2. Utilice el análisis de PCR para detectar las mismas colonias por la orientación del fragmento pIX del genoma columna vertebral, como se ilustra en el paso 1.2.2.2.
      3. Utilice el cebador directo (TATGTGTGTCATGTATGCGT) para secuenciar el fragmento HVR1-Kwas en pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6.

2. Preparación de Modificado Ad5 Viral vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6

  1. Constituyen el medio completo mediante la adición de FBS (10% final), ácidos no esenciales 100X Amino (final de 0,1 mM), 200 mM L-glutamina (final 2 mM) y penicilina / estreptomicina solución (final de 1%) en DMEM con alta glucosa . Mantener las células humanas de riñón embrionario (HEK293) en medio completo en una incubadora de cultivo (37 ° C y 5% de CO2 bajo condiciones de humedad del 85%).
  2. Rescate de cinco viralctor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6
    1. Seed 3,0 x 10 6 de las células HEK293 en una T-25 matraz que contenía 5 ml de medio completo y cultivo O / N para lograr una monocapa con 80% de confluencia.
    2. Linealizar 15 g de pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His en un volumen de 100 l con enzima de restricción PacI (15 unidades) a 37 ° C durante 3 hrs.
      1. Extraer linealizado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 por centrifugación de la reacción dos veces (10.000 xg durante 1 min) con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (relación en 25: 24: 1) en una campana de humos , y por centrifugación secuencial (10.000 xg durante 10 min) con una solución mixta (300 l de etanol 100% y 10 l de acetato de sodio) y 700 l de etanol al 70%. Desechar el sobrenadante en cada etapa de centrifugación.
    3. Resuspender el plásmido purificado en ~ 40 l de agua destilada o Tris-EDTA (TE) tampón. Cuantificar el ADN plásmido mediante la medición de la óptica density (DO) a 260 nm.
    4. Transfectar 3 g del plásmido linealizado con reactivo comercial transfección liposomal en el matraz T-25, de acuerdo con el manual del fabricante. Cambie el medio de transfección con medio completo a 6 horas después de la transfección y la posterior incubación en la incubadora de cultivo. Mantener las células transfectadas mediante la sustitución de medio completo cada dos o tres días, hasta formar placas virales individuales.
    5. Cuando las placas se desarrollan a efecto citopático completo (CPE), raspar las células restantes fuera el matraz en una campana estéril, y lisado celular cosecha por centrifugación medio a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suspender el sedimento de células en ~ 1 ml de medio que contiene 2% de FBS, y romper las células por congelación-descongelación cuatro veces. Recoger el sobrenadante que contiene virus rescatado después de la centrifugación del lisado a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  3. Propagación a gran escala del vector viral de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6
    1. Propagar ªe virus en un matraz T-75 que contiene células HEK293 en la campana estéril mediante la infección con un tercio a la plena lisado del matraz T-25. Permita CPE completo para desarrollar dentro de dos o tres días en la incubadora de cultivo. Recoger el sobrenadante lisado como se indica en el paso 2.2.5.
    2. Propagar el virus en una a tres matraces T-175 en la campana estéril mediante la infección con medio completo a lisado del matraz T-75, dependiendo de las condiciones de propagación de virus. Permita CPE completo para desarrollar dentro de dos o tres días en la incubadora de cultivo. Recoger el sobrenadante lisado como se indica en el paso 2.2.5.
    3. Propagar el virus en una docena o más de matraces T-175 en la campana estéril mediante la infección con medio completo a lisado de la anterior matraz T-175 (s). Determinar la cantidad de uso matraz basado en las condiciones de propagación de virus y la cantidad de virus en necesidad. Recoger el sobrenadante lisado como se indica en el paso 2.2.5 cuando CPE completo se produce en dos o tres días en la incubadora de cultivo.
  4. Purificación de Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 de cloruro de cesio
    1. Preparar dos densidades de soluciones de CsCl en 5 mM HEPES: 1,33 g / ml y 1,45 g / ml, mientras que evitando el contacto con CsCl.
    2. Cargar 4 ml de CsCl (1,33 g / ml) en un tubo de ultracentrífuga estéril, y la carga suavemente 4 ml de CsCl (1,45 g / ml) contra la parte inferior del tubo. Cargar 4 ml de sobrenadante de lisado lentamente en la parte superior de los gradientes en la campana estéril.
    3. Centrifugar el tubo a 110.000 xg durante 3 horas a 4 ° C para separar la banda de virus maduro / inferior de la banda de virus defectuoso / superior. Recoger la banda inferior usando una jeringa de 3 ml armado con una aguja de 33 G y diluir la banda con 5 mM HEPES a un volumen de 4 ml en la campana estéril.
    4. Cargar otro tubo con dos densidades de soluciones de CsCl y la banda diluida de virus como se describe en el paso 2.4.2. Centrifugar el tubo a 110.000 xg O / N a 4 ° C. Recoger la banda viral como se describe en el paso 2.4.3.
    5. Inyectar la solución de virus recogido en un dialyses casete por una jeringa de 3 ml armado con una aguja de 33 G en la campana estéril.
    6. Coloque el casete en 700 ml de tampón de diálisis 1x (1 L receta: 100 ml de PBS 10x, 100 ml de 100% de glicerol y 800 ml de agua destilada; filtrar el tampón a través de un filtro de 0,22 micras) y reemplazar el tampón de diálisis cada 3 hrs para 4 veces. Aspirar a cabo solución de virus dializado utilizando una jeringa con aguja.

3. Validación del vector viral rescatado

  1. Las titulaciones virales del vector
    1. Para el título físico virus, diluir tanto virus y tampón de diálisis (control de fondo) a 1: 10 y 1: 20 en tampón de lisis virus (10% de SDS en Tris-EDTA) en pequeños tubos, e incubar todos los tubos a 56 ° C durante 10 minutos.
    2. Encienda una BioPhotometer y establecer el modo de absorbancia a OD 260 nm. Utilice el tampón de diálisis diluido (1: 10) para equilibrar la señal de fondo haciendo clic en la parte inferior "en blanco". Tipo "10 + 90" en el scr BioPhotometereen, y leer la señal del virus diluido (1: 10).
    3. Leer la señal del virus diluido (1: 20), siguiendo el método en el paso 3.1.2, pero en su lugar, escriba "5 + 95" en la pantalla BioPhotometer. Multiplicar los dos números de lectura virus por 1.1x10 12 y calcular el título medio con una unidad como VP / ml, basado en los dos títulos individuales de las dos diluciones.
    4. Para el título infeccioso del virus (IP / ml), utilizar el método de Karber 50 TCID estadística 14 para determinar la profundidad de la infección en células HEK293 después de la infección 10 días (dpi)
  2. Evaluación de la pantalla de exposición antigénica en el vector viral
    1. Escudo del vector viral en una placa de ELISA y continúe con el resto de pasos en un método ELISA estándar 14. Use anticuerpo humano anti-gp41 (2F5) monoclonal (mAb) y el ratón anti-His tag mAb para la detección de antígenos incorporados correspondiente 14.
    2. Resolver el vector viral en un denatuelectroforesis en gel de proteína roja (SDS-PAGE) y continúe con el resto de pasos en un método Western-blot estándar 14. Use anticuerpo humano anti-gp41 (2F5) monoclonal (mAb) y el ratón anti-His tag mAb para la detección de antígenos incorporados correspondiente 14.
  3. Evaluación in vitro del vector en la capacidad de eludir sueros Ad5-positve
    1. Mantener las células HeLa en medio completo en la incubadora de cultivo (37 ° C y 5% de CO 2 bajo condiciones de humedad del 85%). Constituyen el medio completo mediante la adición de FBS (10% final), 200 mM L-glutamina (final de 2 mM) y solución de penicilina / estreptomicina (final de 1%) en medio esencial mínimo de Eagle (MEME).
    2. Semilla células HeLa en placas de 6 pocillos a 1x10 6 células / pocillo, y se incuban las placas en la incubadora de cultivo (37 ° C y 5% de CO 2 bajo condiciones de humedad del 85%) durante 2 horas. Incubar los sueros Ad5-positivo (0,1 l 0 o l) con 5 IP / célula de vector viral (Ad5 o Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6) en la incubadora de cultivo durante 1 hora antes de añadir las mezclas sobre las placas de 6 pocillos que contienen células.
    3. A las 24 horas después de la infección (hpi), enjuagar las células una vez con PBS y se lisan las células en 0,5 ml de tampón de lisis. Centrifugar a 15.000 xg durante 5 min y se recoge el sobrenadante. Mezclar 20 l del sobrenadante con 100 l de sustrato de luciferasa para la lectura de la señal de la luciferasa, ya que los virus contienen el gen de la luciferasa.

4. Evaluación inmunológica del vector viral rescatado

  1. Prepare dos grupos de inmunización: Ad5 y Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6.
    1. Inyectar ratones (n = 8 / grupo) por vía intramuscular con virus en 1x10 10 VP / ratón, en un "primer impulso" régimen de inmunización homóloga, con un intervalo de 2 semanas.
    2. A las 2 semanas después de cada inyección, sangrar ratones sin anestesia por la mejilla sangrado con lancetas animales (5 mm de longitud de punta) arecoger la sangre en tubos de 1,5 ml.
  2. Mezclar la sangre en los tubos por inversión arriba y abajo, y se incuba la sangre a temperatura ambiente durante 30 min. Haga girar los tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C y los sueros de transferencia (capa superior) para nuevos tubos de 1,5 ml.
    1. Haga girar los nuevos tubos a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C y la transferencia de los sueros de recién marcados tubos de 1,5 ml para el almacenamiento a -80 ° C.
  3. Evaluación de la inmunidad humoral específica de antígeno por ELISA basado sueros-
    1. Diluir Su péptido (acciones a 1 mM) y el VIH-1 péptido (acciones a 1 mM) por separado en 100.
    2. tampón de carbonato mM (pH 9,5) para lograr la concentración de recubrimiento péptido a 10 mM. Recubrir las placas de ELISA con los péptidos diluidos por separado mediante la adición de 100 l por pocillo e incubando las placas de O / N a 4 ° C.
    3. Lavar las placas con PBST durante cuatro veces a 200 l / pocillo y el bloque durante 1 h en 5% de BSA en PBST. Aplicar sueros de ratones a las placas a 1: 100 dilución en el buf bloqueafer, 100 l / pocillo. Incubar durante 2 horas de incubación a temperatura ambiente.
    4. Lavar las placas con PBST durante cuatro veces. Bloquear las placas por incubación a TA durante 30 min en el tampón de bloqueo a 100 l / pocillo.
    5. Aplicar de cabra anti-IgG de ratón-HRP (1: 5.000 en el tampón de bloqueo) a 100 l / pocillo tanto a las placas recubiertas con Su péptido y el VIH-1 péptido individualmente. Incubar durante 2 horas a RT. Lavar las placas con PBST.
    6. Leer las placas a OD450 nm después de la incubación con sustrato de HRP durante 30 min.

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Resultados

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La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (Figura 1A) se utilizó para generar el vector viral divalente Ad5 Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His. En primer lugar, el servicio de transporte plásmido HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 / pH5S se construyó subclonando fragmento HVR1-Kwas en el anterior plásmido lanzadera construida HVR5-Su 6 / pH5S 17. En segundo lugar, el plásmido pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 fue construido por una recombinación ...

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Discusión

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La aplicación de la estrategia tradicional transgén en la modificación de Ad5 para el desarrollo de vacunas se ha disminuido debido principalmente al cuello de botella asociado con el Ad5 PEI 4,6. Este cuello de botella puede ser parcialmente disminuido por la aplicación de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (Figura 1A) alternativo, ya que esta estrategia puede evadir la neutralización por Ad5 NAbs reemplazando neutralizantes epítopos de Ad5 con antígenos de intereses, y fa...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta obra fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud otorga 5T32AI7493-20 y 5R01AI089337-03. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01para división de células 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02para la preparación del tampón de diálisis
glicerolSIGMAG5516-1Lpara la preparación del tampón de diálisis
SDSBIO-RAD161-0301para la preparación del tampón de lisis
viral Suero fetal bovino (FBS)Thermo ScientificSH30910.03componente del medio de cultivo
100x aminoácidos no esenciales& nbsp;Thermo ScientificSH30238.01componente del medio de cultivo
200 mM L-glutaminaCellgro25-005-CIcomponente del medio de cultivo
solución de penicilina/estreptomicina Cellgro30-002-CIcomponente del medio de cultivo
DMEM con alta glucosaThermo ScientificSH30081.01para el cultivo celular HEK293
Medio esencial mínimo EagleSIGMAM5650para el cultivo celular HeLa
fenol: cloroformo: alcohol isoamílico  SIGMAP3803-100MLpara purificación de ADN de gran tamaño cloruro de
cesio  Corporación Internacional de Productos de Investigación.C68050para purificación de virus
HEPESCellgro25-060-CIpara la preparación de soluciones de CsCl
HEK293ATCC51-0036para el rescate de virus y el refinado
HeLaATCCCCL-2neutralización
Matraz T-25Thermo Scientific156367para cultivo celular 
Matraz T-75CORNING 430641para cultivo celular 
matraz T-175Thermo Scientific159910para cultivo celular 
UltracentrífugaBECKMANNApara la purificación de virus
Tubo de ultracentrífugaBECKMAN344059para la purificación de virus
casete de diális Thermo Scientific66380para diálisis viral
Placa ELISAThermo Scientific442404para ELISA
humano anti-gp41 (2F5) mAbNIH Programa de reactivos contra el SIDA1475para ensayos inmunológicos
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medio SOCCORNING46-003-CRpara transformación
Solución de mezcla maestra para PCRQIAGEN201445para PCR
Lanceta animal (longitud de punta de 5 mm)MEDIpointpara hemorragia en ratones 
BiofotómetroEppendorfpara la valoración física de los títulos de virus
para ensayo de

Referencias

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