Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumen

C. elegans es un modelo útil para estudiar los efectos del etanol en el comportamiento. Presentamos un ensayo de comportamiento que cuantifica los efectos del etanol en la velocidad de locomoción de los gusanos rastreros; tanto la sensibilidad inicial como el desarrollo de tolerancia funcional aguda al etanol pueden medirse con este ensayo.

Resumen

Los trastornos por consumo de alcohol son una preocupación significativa para la salud pública, para la cual existen pocas estrategias de tratamiento efectivas. Una dificultad que ha retrasado el desarrollo de tratamientos más efectivos es la relativa falta de comprensión de los fundamentos moleculares de los efectos del etanol en el comportamiento. El nematodo, Caenorhabditis elegans (C. elegans), proporciona un modelo útil para generar y probar hipótesis sobre los efectos moleculares del etanol. Aquí, describimos un ensayo que se ha desarrollado y utilizado para examinar los roles de genes particulares y factores ambientales en las respuestas conductuales al etanol, en las que la locomoción es la salida conductual. El etanol, de manera dependiente de la dosis, causa una depresión aguda del arrastre sobre una superficie de agar. Los efectos son dinámicos; los animales expuestos a una alta concentración demuestran una depresión inicial fuerte del arrastre, referida aquí como sensibilidad inicial, y luego recuperan parcialmente la velocidad de locomoción a pesar de la presencia continua de la droga. Esta plasticidad conductual inducida por etanol se refiere aquí como el desarrollo de tolerancia funcional aguda. Este ensayo se ha utilizado para demostrar que estos dos fenotipos son distintos y genéticamente separables. El ensayo de locomoción sencillo descrito aquí es adecuado para examinar los efectos de manipulaciones tanto genéticas como ambientales en estas respuestas conductuales agudas al etanol en C. elegans.

Introducción

Los trastornos por consumo de alcohol (AUD) son generalizados y producen serios problemas de salud, sociales y económicos. En humanos, la susceptibilidad a desarrollar un AUD está fuertemente influenciada tanto por la genética como por el entorno^1,2. Un fuerte predictor fisiológico de la probabilidad de abuso es el nivel inicial de respuesta (LR) al alcohol (etanol) que exhiben los bebedores novatos^3-5. Este fenotipo de LR está influenciado por componentes genéticos y no genéticos⁶. Determinar los mecanismos moleculares que influyen en la LR al etanol es un objetivo importante del estudio de los comportamientos de respuesta al etanol.<....

Protocolo

1. Pasos para realizar en el día antes del ensayo

1. Recogida L4 etapa gusanos a medio de crecimiento fresco nematodo placas (NGM) sembradas con un césped de OP50 E. coli, y la cultura de ellos a 20 CO / N. Cada condición de ensayo requiere 10 gusanos; recoger un exceso de gusanos para permitir la O / N pérdida de gusanos.
   1. Sólo los animales de ensayo que son los adultos de primer día; muchos mutantes crecen a una velocidad más lenta que la de tipo salvaje. Ajuste el tiempo de la cosecha para las cepas que tienen retrasos en el desarrollo a fin de que todos los animales analizados adultos de primer día.

Resultados

Los datos representativos (Figura 1) de varios genotipos diferentes y sus controles emparejados se presentan ^8,24; datos fueron escogidos específicamente que las diferencias de relieve en los animales ensayados. El grado de efecto en 10 minutos de exposición se considera la sensibilidad inicial de una cepa, que se muestra en los ejes izquierda en la figura 1B-G. Las cepas mutantes con una velocidad relativa más grande que el control en 10 min se considera que son resistentes .......

Discusión

La neurobiología simple y herramientas genéticas disponibles en C. elegans hacer el gusano un excelente modelo en el que el estudio de las bases moleculares de los efectos del etanol sobre el comportamiento. Aquí se describe un ensayo que se ha utilizado para identificar varios mediadores moleculares y ambientales de la respuesta de comportamiento aguda a etanol ^{8,10,20,24,25.} Este método permite la diferenciación y el examen simultáneo de dos fenotipos comportamiento de respuesta etanol diferentes, .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml en etanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		Para secar agar
Digital balance	Various		Para determinar el peso de las placas y el volumen de agar
Anillos de cobre	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	Anillos de cobre de 1,6 cm de diámetro interno y 1,8 cm de diámetro externo
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	Esta cámara tiene un amplio campo de visión.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Modelo discontinuado, M60 es el equivalente actual.
Light source	Schott	A08923	Retroiluminación de 3”x3”  para una iluminación uniforme en todo el campo de visión
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Las versiones más recientes del software tienen funciones de seguimiento.