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Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

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DOI:

10.3791/52685

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17 de abril de 2015

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.

Resumen

La secuenciación de próxima generación de muestras ambientales puede ser un desafío debido a la cantidad y calidad variables de ADN en estas muestras. Se necesitan bibliotecas de ADN de alta calidad para obtener resultados óptimos de la secuenciación de próxima generación. Las muestras ambientales, como el agua, pueden tener baja calidad y cantidades de ADN, así como contaminantes que coprecipitan con el ADN. Los procesos mecánicos y enzimáticos involucrados en la extracción y la preparación de la biblioteca pueden dañar aún más el ADN. La selección del tamaño del gel permite la purificación y recuperación de fragmentos de ADN de un tamaño definido para aplicaciones de secuenciación. Sin embargo, esta tarea es uno de los pasos que más tiempo consume en el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca de ADN. El protocolo descrito aquí permite la automatización completa de la carga de gel de agarosa, el análisis electroforético y la recuperación de fragmentos de ADN específicos.

En este estudio, describimos un enfoque de alto rendimiento para preparar bibliotecas de ADN de alta calidad a partir de muestras de agua dulce que se pueden aplicar también a otras muestras ambientales. Utilizamos un enfoque indirecto para concentrar células bacterianas a partir de muestras ambientales de agua dulce; El ADN se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN disponible en el mercado, y las bibliotecas de ADN se prepararon utilizando un protocolo comercial basado en transposones. Los fragmentos de ADN de 500 a 800 pb se seleccionaron utilizando Ranger Technology, una estación de trabajo de electroforesis automatizada. La secuenciación de las bibliotecas de ADN seleccionadas por tamaño demostró mejoras significativas en la longitud de lectura y la calidad de las lecturas de secuenciación.

Introducción

La metagenómica implica la secuenciación de todo el material genético de una muestra para caracterizar las comunidades microbianas presentes. Se trata de un proceso complejo y costoso que implica la conversión de los ácidos nucleicos extraídos en bibliotecas de ADN, seguida de la secuenciación de próxima generación. Las bibliotecas de alta calidad son esenciales para obtener la máxima producción de datos y un análisis metagenómico preciso. Las muestras ambientales, como las muestras de agua, a menudo plantean desafíos significativos para generar bibliotecas de alta calidad, debido a las bajas cantidades de ADN que también pueden degradarse1-3 y la presencia de inhibidores de PCR4-6.

Las bibliotecas de alta calidad idealmente consisten en segmentos más largos de ADN dentro de un estrecho rango de longitudes. Con el fin de maximizar la cantidad de datos útiles generados por ciclo de secuenciación, la longitud del ADN en la biblioteca debe ser al menos tan larga como la longitud máxima de lectura del método de secuenciación que se utiliza. Cuando se utiliza una tecnología de secuenciación por síntesis como la Illumina MiSeq, el tamaño de los fragmentos de ADN afecta a la eficiencia con la que se generan los grupos en la celda de flujo. Por ejemplo, cuando una biblioteca contiene fragmentos de ADN más cortos y más largos, los más cortos estarán sobrerrepresentados en los datos de secuenciación7,8. Por el contrario, una biblioteca con fragmentos de ADN de tamaño similar se representará proporcionalmente en los datos de secuenciación. Muchos kits de preparación de bibliotecas utilizan métodos basados en la ligadura para agregar adaptadores a los fragmentos de ADN y la selección del tamaño es necesaria para eliminar los dímeros adaptadores que no contienen un inserto9,10. Existen numerosos métodos11,12 para lograr esto, pero la técnica que proporciona los resultados más consistentes es la separación electroforética del ADN, seguida de la recuperación de las longitudes deseadas de ADN13,14. Este proceso se puede realizar manualmente para un pequeño número de muestras, pero cuando se enfrenta al procesamiento de cientos de muestras, se requieren soluciones automatizadas. Las plataformas disponibles actualmente para la selección automatizada del tamaño del gel son de bajo rendimiento y se necesitan nuevas plataformas para procesar grandes cantidades de muestras para la secuenciación. La tecnología Ranger puede integrarse con las estaciones de trabajo de manipulación de líquidos existentes para permitir el uso de la electroforesis en gel de agarosa para la selección de tamaños y con fines analíticos a una escala que satisface el entorno actual de alto rendimiento.

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Protocolo

1. Recolección de Agua y Filtración

  1. Recoger muestras de agua dulce de varios sitios (Figura 1). Pase muestras a través de una serie de filtros: 1 micras filtro, filtro de 0,2 micras, y 30 kDa de corte del filtro de flujo tangencial a sistemáticamente eucariota separado, partículas de tamaño bacterianas y virales, respectivamente.
    Nota: Sólo la purificación y análisis del material recuperado en las 0,2 micras filtros (bacterias de vida libre) se describe en este informe, pero enfoques similares se puede utilizar para las otras partículas recuperadas de los filtros.

2. Concentración bacteriana, ADN Extracción y Purificación

  1. Retire el filtro de membrana de 0,2 micras (s) del sistema de filtración de agua (diagrama esquemático, figura 2). Doble el filtro de 0,2 micras disco en medio y lo coloca en un tubo de 50 ml con el lado abierto hacia arriba. Añadir 5 ml de solución tamponada con fosfato (PBS 1x) y 0,01% de Tween, pH 7,4 enel tubo. Si se utiliza más de un filtro durante el proceso de emplear un tubo diferente por filtro. Tubo (s) tienda con filtro a 4 ° C hasta su transformación. De lo contrario, continúe con el paso 2.2.
  2. Retire el filtro de 0,2 micras membrana desde el tubo de 50 ml con una pinza estéril. Place filtro (s) en una placa de Petri (dejar el tampón PBS en el tubo).
    1. Con pinzas estériles y tijeras estériles, cortar el filtro en tiras pequeñas (1 cm x 1 cm). Desinfectar pinzas y tijeras por inmersión en el 70% de isopropanol, limpiando con un descontaminante superficie ADN y enjuagar con agua ultrapura de tipo 1 entre las diferentes muestras.
  3. Coloque el filtro de corte en tiras de nuevo en el mismo tubo de 50 ml. Añadir 10 ml de 1x PBS y 0,01% de Tween, pH 7,4 para el filtro por lo que hay un total de 15 ml de tampón en el tubo de 50 ml.
  4. Añadir 6 perlas de tungsteno limpias (3 mm de diámetro) a cada tubo 50 ml, cubrir el tubo con Parafilm, y agitar vigorosamente durante 20 min (50 ml adaptador de utilizar tubos de vórtice). Si multIPLE filtros se procesan de una muestra, la transferencia y la piscina todo el homogeneizado en un tubo de 50 ml limpio. Centrifugar los tubos a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C.
  5. Resuspender las células bacterianas de pellets y alícuotas (~ 1 ml alícuotas) en 1,7 ml tubos de microcentrífuga. Tenga en cuenta que habrá 5 tubos de microcentrífuga por muestra.
  6. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 10.000 xg durante 10 min, y eliminar la mayor parte del sobrenadante hasta ~ 200 marca l.
  7. Almacenar las muestras a -80 ° C, o proceder a extraer el ADN bacteriano mediante el uso de un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante. Durante el uso de extracción de ADN bacteriano o bien PBS o agua como control negativo de extracción, y E. coli como un control positivo de extracción.
  8. Debido a que el ADN de múltiples tubos se extraen, piscina sub-paralelas alícuotas de la misma muestra en un tubo de 2 ml. A continuación, llevar a cabo una / N precipitación O mediante el uso de una solución compuesta de 0,1volúmenes de acetato de sodio 3 M, 2 volúmenes de etanol 100%, y 5 l de 5 mg / l de acrilamida lineal. Mezclar bien y guarde las muestras a -80 ° C.
  9. Centrifugar a velocidad máxima (17.000 xg) durante 30 min a 4 ° C. Lavar la pella con 1 ml de etanol al 70% enfriado con hielo, secar al aire en una cabina de bioseguridad por no más de 5 min y resuspender el pellet de ADN en 34 l de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
    Nota: acrilamida lineal ayudará a visualizar sedimento de ADN después de la O / N precipitación.
  10. Determinar la cantidad de ADN y la calidad utilizando una alta sensibilidad del ensayo de cuantificación de ácidos nucleicos fluorescente y un espectrofotómetro microvolumen, respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante (Ver Tabla de Materiales).
    Nota: Si múltiples muestras se preparan en el momento, un ensayo ultrasensible de ácido nucleico fluorescente para la cuantificación de ADN de doble cadena y con base de placa fluorómetro / espectrofotómetro se puede utilizar en su lugar.

3. Preparación de ADN Biblioteca

  1. Normalizar ADN bacteriano genómico extraído de muestras de agua a una concentración de ~ 0,2 ng / l.
  2. Enzimáticamente fragmento de un nanogramo de ADN bacteriano utilizando un método basado en transposón (tagmentation). Añadir adaptadores e índice secuencias en el ADN fragmentado siguiendo las instrucciones del fabricante. Asunto tagmented muestras a 12 ciclos de PCR como se indica en las instrucciones del fabricante, momento en el que se incorporan los índices de secuenciación.

4. Gel Automatizado Tamaño Selección

  1. Saltar paso estándar de limpieza post-PCR se describe en las instrucciones del fabricante (Ver Tabla de Materiales). Tamaño selectas muestras post-PCR directamente utilizando una plataforma de selección de tamaño a base de gel automatizado.
    1. Añadir 3,5 l de tampón de carga a cada muestra.
    2. Siguiendo el protocolo del fabricante, cargar las muestras en la estación de trabajo de la electroforesis, especificando un objetivo de selección de tamaño de 500-800 pb, en un extracto de 300 lvolumen de iones, usando un casete de agarosa prefabricado 1,5%.
    3. Se concentra el material de salida en bruto (300 l) a 25 l mediante precipitación con etanol.
      Nota: También puede utilizar la estación de trabajo de electroforesis para automatizar la concentración de un mayor número de muestras a través de la placa de filtro y colector de vacío.
      1. Precipitar el volumen de elución en bruto utilizando 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, 2 volúmenes de etanol 100% y 5 l de 5 mg / l de acrilamida lineal. Mezclar bien, colocar las muestras a -80 ° CO / N. Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 30 min.
      2. Desechar los sobrenadantes y proceder a lavar sedimento de ADN con 1 ml de etanol al 70% enfriado con hielo.
      3. Centrifugar las muestras de nuevo a 17.000 xg durante 30 min, descartar los sobrenadantes, secar al aire, y finalmente se resuspenden sedimento de ADN en 25 l de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Opcional) Utilice 1 l de tamaño bibliotecas de ADN seleccionado con la plataforma de selección del tamaño de gel automatizado para hacer un cincodilución -fold utilizando solución tampón Tris-EDTA, pH 8,0. Analizar las bibliotecas utilizando un instrumento de electroforesis capilar a base de chip para analizar la calidad de dsDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Biblioteca Normalización y secuenciación

  1. Proceda a normalizar las muestras usando perlas de normalización de la biblioteca (incluidas en el kit de preparación de biblioteca basado en transposón) como se describe en la guía de preparación del fabricante.
    1. Alternativamente, las bibliotecas dsDNA medir usando un ensayo de cuantificación fluorescente de ácido nucleico de alta sensibilidad, seguido por la puesta en común en relaciones equimolares para llegar a una concentración final de 2 nM dsDNA. Proceder para desnaturalizar las bibliotecas utilizando 10 l de bibliotecas agrupadas y 10 l de 0,2 N NaOH, incubar durante 5 min a TA. Diluir bibliotecas desnaturalizados utilizando tampón de hibridación (incluido con el kit de preparación basado en transposón) a un volumen final de 1 ml y la concentración de 23:05.
  2. Cargue la muestras en una plataforma de secuenciación de próxima generación siguiendo protocolos de secuenciación estándar del fabricante.

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Resultados

Concentración de ADN, y la Evaluación de la Calidad

Las concentraciones de ADN bacteriano oscilaron 0,01 a 0,11 ng ​​/ ml por muestra de agua de los diferentes sitios de la cuenca (Tabla 1). ADN aislado de la fracción bacteriana tenía A 260/280 y 260/230 A proporciones de 01/04 a 01/08 y de 0,3 a 1,6, respectivamente. Aunque algunos de los A 260/230 proporciones eran relativamente bajos, ninguna inhibición aparente se observó...

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Discusión

La presencia de dímeros de adaptador y la agrupación de pequeños tamaños de inserción preferentemente ser secuenciados en las plataformas actuales representan una disminución en los rendimientos utilizables y subutilización de la capacidad del equipo 15. El uso de métodos de batido de talón combinado con un enfoque basado en transposón para preparar bibliotecas puede resultar en más de cizallamiento ADN en comparación con otros métodos de extracción de 4,5. Sin embargo, todos los métodos de extracc...

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Divulgaciones

Jared R. Slobodan y Matthew J. Nesbitt tanto tienen acciones de Coastal Genomics, una corporación British Columbia privada que ofrece la tecnología de Ranger.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por Genome BC, Genome Canada y Coastal Genomics. Los autores agradecen a Kirby Cronin y Michael Chan por su ayuda en la recolección y procesamiento de muestras. También nos gustaría agradecer a Thea Van Rossum y a la Dra. Fiona Brinkman por su ayuda en bioinformática.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bomba peristáltica Masterflex P/S 1400 SeriesThermo Scientific 1400-1620
0,2 y micro; m Membrana SuporVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Perlas de carburo de tungsteno 3 mm (200)Qiagen69997
Alcohol isopropílico 70%Jedmon Products825751Healthcare Plus
DNA away VWR7010Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Sistema de purificación de agua Milli-QFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Este sistema ha sido descontinuado.
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher chemicals
Adaptador de vórtice para 2 (50  ml) tubosVWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (Modelo G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Centrífuga BeckmanRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModelo J-6B
PowerLyzer Powersoil Kit de aislamiento de ADNVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
Adaptador de vórtice para tubos de 24 (1,5-2 ml)VWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Centrífuga Microfuge 18Beckman Coulter367160
Nimbus Select estación de trabajo con Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Incluye la estación de trabajo de manejo de líquidos y Ranger Tech integrado (hardware de electroforesis)
Kit de reactivos RangerCoastal GenomicsCG-10600-150-12-21Incluye tampón de carga y casetes
Alcohol etílico (anhidro)Alcoholes comercialesP016EAANEtanol Greenfield
Acetato de sodioSigma-AldrichS2889-250G
Acrilamida lineal (5  mg/ml)Life TechnologiesAM9520Ambion
Centrífuga refrigerada EppendorfRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Tampón EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 EspectrofotómetroThermo ScientificND-1000
QubitLife TechnologiesQ32857Invitrogen. Este producto ha sido descontinuado.
Kit de ensayo Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32854Invitrogen
Reactivo de ADN de alta sensibilidadAgilent Technologies5067-4626
Chips de ADN de alta sensibilidadAgilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT Kit de preparación de muestras de ADNIlluminaFC-131-1024
Kit de índice Nextera XTIlluminaFC-131-1001
Kit de reactivos MiSeq v2 (500 ciclos)IlluminaMS-102-2003
Sistema MiseqIlluminaSY-410-1003

Referencias

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