Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.
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Artículo de método
Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente
En este artículo
Resumen
Resumen
La secuenciación de próxima generación de muestras ambientales puede ser un desafío debido a la cantidad y calidad variables de ADN en estas muestras. Se necesitan bibliotecas de ADN de alta calidad para obtener resultados óptimos de la secuenciación de próxima generación. Las muestras ambientales, como el agua, pueden tener baja calidad y cantidades de ADN, así como contaminantes que coprecipitan con el ADN. Los procesos mecánicos y enzimáticos involucrados en la extracción y la preparación de la biblioteca pueden dañar aún más el ADN. La selección del tamaño del gel permite la purificación y recuperación de fragmentos de ADN de un tamaño definido para aplicaciones de secuenciación. Sin embargo, esta tarea es uno de los pasos que más tiempo consume en el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca de ADN. El protocolo descrito aquí permite la automatización completa de la carga de gel de agarosa, el análisis electroforético y la recuperación de fragmentos de ADN específicos.
En este estudio, describimos un enfoque de alto rendimiento para preparar bibliotecas de ADN de alta calidad a partir de muestras de agua dulce que se pueden aplicar también a otras muestras ambientales. Utilizamos un enfoque indirecto para concentrar células bacterianas a partir de muestras ambientales de agua dulce; El ADN se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN disponible en el mercado, y las bibliotecas de ADN se prepararon utilizando un protocolo comercial basado en transposones. Los fragmentos de ADN de 500 a 800 pb se seleccionaron utilizando Ranger Technology, una estación de trabajo de electroforesis automatizada. La secuenciación de las bibliotecas de ADN seleccionadas por tamaño demostró mejoras significativas en la longitud de lectura y la calidad de las lecturas de secuenciación.
Introducción
La metagenómica implica la secuenciación de todo el material genético de una muestra para caracterizar las comunidades microbianas presentes. Se trata de un proceso complejo y costoso que implica la conversión de los ácidos nucleicos extraídos en bibliotecas de ADN, seguida de la secuenciación de próxima generación. Las bibliotecas de alta calidad son esenciales para obtener la máxima producción de datos y un análisis metagenómico preciso. Las muestras ambientales, como las muestras de agua, a menudo plantean desafíos significativos para generar bibliotecas de alta calidad, debido a las bajas cantidades de ADN que también pueden degradarse1-3 y la presencia....
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Protocolo
1. Recolección de Agua y Filtración
- Recoger muestras de agua dulce de varios sitios (Figura 1). Pase muestras a través de una serie de filtros: 1 micras filtro, filtro de 0,2 micras, y 30 kDa de corte del filtro de flujo tangencial a sistemáticamente eucariota separado, partículas de tamaño bacterianas y virales, respectivamente.
Nota: Sólo la purificación y análisis del material recuperado en las 0,2 micras filtros (bacterias de vida libre) se describe en este informe, pero enfoques similares se puede utilizar para las otras partículas recuperadas de los filtros.
2. Concentración bacteriana, ADN Ext....
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Resultados
Concentración de ADN, y la Evaluación de la Calidad
Las concentraciones de ADN bacteriano oscilaron 0,01 a 0,11 ng / ml por muestra de agua de los diferentes sitios de la cuenca (Tabla 1). ADN aislado de la fracción bacteriana tenía A 260/280 y 260/230 A proporciones de 01/04 a 01/08 y de 0,3 a 1,6, respectivamente. Aunque algunos de los A 260/230 proporciones eran relativamente bajos, ninguna inhibición aparente se observó.......
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Discusión
La presencia de dímeros de adaptador y la agrupación de pequeños tamaños de inserción preferentemente ser secuenciados en las plataformas actuales representan una disminución en los rendimientos utilizables y subutilización de la capacidad del equipo 15. El uso de métodos de batido de talón combinado con un enfoque basado en transposón para preparar bibliotecas puede resultar en más de cizallamiento ADN en comparación con otros métodos de extracción de 4,5. Sin embargo, todos los métodos de extracc.......
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Divulgaciones
Jared R. Slobodan y Matthew J. Nesbitt tanto tienen acciones de Coastal Genomics, una corporación British Columbia privada que ofrece la tecnología de Ranger.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por Genome BC, Genome Canada y Coastal Genomics. Los autores agradecen a Kirby Cronin y Michael Chan por su ayuda en la recolección y procesamiento de muestras. También nos gustaría agradecer a Thea Van Rossum y a la Dra. Fiona Brinkman por su ayuda en bioinformática.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bomba peristáltica Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0,2 y micro; m Membrana Supor | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Perlas de carburo de tungsteno 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Alcohol isopropílico 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA | |
| Sistema de purificación de agua Milli-Q | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. Este sistema ha sido descontinuado. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Adaptador de vórtice para 2 (50 ml) tubos | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Modelo G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Centrífuga Beckman | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Modelo J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil Kit de aislamiento de ADN | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Adaptador de vórtice para tubos de 24 (1,5-2 ml) | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Centrífuga Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select estación de trabajo con Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Incluye la estación de trabajo de manejo de líquidos y Ranger Tech integrado (hardware de electroforesis) |
| Kit de reactivos Ranger | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Incluye tampón de carga y casetes |
| Alcohol etílico (anhidro) | Alcoholes comerciales | P016EAAN | Etanol Greenfield |
| Acetato de sodio | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Acrilamida lineal (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Centrífuga refrigerada Eppendorf | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Tampón EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Espectrofotómetro | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. Este producto ha sido descontinuado. |
| Kit de ensayo Qubit dsDNA HS | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| Reactivo de ADN de alta sensibilidad | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Chips de ADN de alta sensibilidad | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT Kit de preparación de muestras de ADN | Illumina | FC-131-1024 | |
| Kit de índice Nextera XT | Illumina | FC-131-1001 | |
| Kit de reactivos MiSeq v2 (500 ciclos) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Sistema Miseq | Illumina | SY-410-1003 |
Referencias
- Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
- Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from:
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Reimpresiones y permisos
