En el siguiente protocolo, se describe una manera muy simple para aislar las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) a partir de sangre humana entera utilizando reactivos fácilmente disponibles. A continuación, demostramos cómo las redes aisladas se pueden utilizar en un ensayo de adhesión in vitro con células cancerosas.
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Artículo de método
Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación
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Resumen
Resumen
Neutrófilos extracelular Trampas (TNE) se han identificado recientemente como parte del arsenal antimicrobiano de los neutrófilos. Aparte de su papel en la lucha contra las infecciones, la investigación reciente ha demostrado que pueden estar implicados en muchos otros procesos de enfermedad, incluyendo la progresión del cáncer. El aislamiento de los TNE purificadas es un elemento crucial para permitir el estudio de estas funciones.
En este vídeo, se demuestra un método simplificado de celda de aislamiento NET libre de sangre humana utilizando reactivos fácilmente disponibles. TNE aisladas se pueden utilizar para la tinción de inmunofluorescencia, secante o varios ensayos funcionales. Esto permite una evaluación de sus propiedades biológicas en ausencia de los posibles efectos de confusión de los propios neutrófilos.
Una técnica de separación por gradiente de densidad se emplea para aislar los neutrófilos de donante sano de sangre entera. Neutrófilos aislados se estimularon por forbol 12-myriState 13-acetato (PMA) para inducir NETosis. Los neutrófilos activados se descartan, y se obtiene una acción NET libre de células.
A continuación, demostramos cómo TNE aislado se puede utilizar en un ensayo de adhesión con células de cáncer de pulmón humano A549. El stock de NET se utiliza para recubrir los pocillos de una de 96 pocillos de cultivo celular placa de O / células A549 N, y después de asegurar la formación de una monocapa NET adecuada sobre el fondo de los pocillos, CFSE marcadas se añadidas. Las células adherentes se cuantificaron utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon TE300. En algunos pozos, 1000U Dnase1 se añade 10 min antes de contar para degradar los TNE
Introducción
Trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) han sido recientemente descubiertos elementos derivadas de neutrófilos compuestas de cadenas de ADN extracelular decorados por cientos de proteínas y las histonas. Ellos son secretadas por los neutrófilos en el contexto de la infección y la inflamación siguientes estímulos específicos y se registran inicialmente a formar parte de los mecanismos de defensa de los neutrófilos frente a las infecciones. Se les mostró primero en promover la captura de varios invasores microbianos incluyendo bacterias, virus y hongos 1-3. Atrapar del microbio entonces conducir a su destrucción, tanto directamente por las proteínas NET ....
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Protocolo
NOTA: Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices éticas institucionales locales.
Dibujo 1. Sangre
- A través venipucture antecubital, recoger 14 tubos de sangre de un voluntario sano en top verde tubos heparinizados () e invertir cada tubo antes de decidirse por el hielo. Recoger la sangre dentro de 10 - 15 minutos de experimento para garantizar un rendimiento óptimo de los neutrófilos.
2. Aislamiento de neutrófilos de sangre entera
- Lave cada tubo superior verde de la sangre con 5 ml de PBS sin Ca y Mg para diluir la sangre. En cada uno de 4 x 50 ml t....
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Resultados
Logro de un ensayo de adhesión estática con redes requiere recubrimiento adecuado de los pocillos con una monocapa de TNE antes de la adición de las células cancerosas (Figura 1). Todos los pasos posteriores deben hacerse con cuidado para no perturbar la capa. Cuando se forma una capa adecuada de los TNE, se espera para ver significativa la adhesión a las redes de células cancerosas como se ve en la Figura 2A y 2C. Este efecto es abrogada por la adición de Dnase1, que d.......
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Discusión
El protocolo de aislamiento de Trampa neutrófilos extracelular se demuestra en este vídeo combina diferentes técnicas utilizadas en la literatura para el aislamiento de neutrófilos y la formación de NET. Simplifica un proceso bastante complejo y variable y ofrece una forma muy fiable y reproducible para aislar los TNE libres de células purificadas con menos pasos que otros protocolos. Por otra parte, los reactivos fácilmente disponibles se emplean agregando a la simplicidad protocolos y reducir significativamente su cos.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Paul Kubes por su orientación y mentoría que fueron fundamentales en la construcción de este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS), modificada, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio | Wisent | 311-425-CL | |
| Medio de separación de linfocitos (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Clorhidrato de dextrano (polvo) | Spectrum | DE130 | al 6% se elabora complementando PBS con Ca y Mg con polvo de dextrano al 6% |
| RPMI-1640 Medio con L-glutamina | Wisent | La solución 350-000-CL | 3% RPMI se elabora complementando RPMI con 3% de suero fetal bovino |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Placa de cultivo de tejidos integridos con rejilla de 20 mm (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
Referencias
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al.
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Reimpresiones y permisos
