Aquí se presenta un protocolo que describe ex situ oxigenada máquina de perfusión de los injertos de hígado de donantes. Este artículo contiene un paso a paso el protocolo para adquirir y preparar el injerto hepático para la máquina de perfusión, preparar el líquido de perfusión, cebar la máquina de perfusión y realizar oxigenada máquina de perfusión normotérmica del injerto hepático.
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Artículo de método
Ex Situ Normotérmica máquina de perfusión de hígados de donantes
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Resumen
Resumen
En contraste con la conservación en frío estática convencional (0-4 ° C), ex máquina de perfusión in situ puede proporcionar una mejor conservación de los hígados de donantes. La perfusión continua de órganos ofrece la oportunidad de mejorar la calidad del órgano y permite ex situ evaluación de la viabilidad de hígados de donantes antes del trasplante. Este artículo de vídeo proporciona un paso a paso para protocolo ex situ máquina de perfusión normotérmica (37 ° C) de hígados de donantes humanos utilizando un dispositivo que proporciona una presión y temperatura controlada pulsátil de perfusión de la arteria hepática y la perfusión continua de la vena portal. El fluido de perfusión se oxigena por dos oxigenadores de membrana de fibra hueca y la temperatura se puede regular entre 10 ° C y 37 ° C. Durante la perfusión, la actividad metabólica del hígado, así como el grado de lesión pueden ser evaluados por análisis bioquímico de muestras tomadas del líquido de perfusión. Perfusión Machine es una herramienta muy prometedorapara aumentar el número de hígados que son adecuados para el trasplante.
Introducción
El método actual de preservación de órganos en el trasplante de hígado es enjuagar con y posterior almacenamiento de los hígados de donantes en frío (0-4 ° C) de líquido de conservación (como Universidad de Wisconsin solución o la solución de histidina-triptófano-cetoglutarato). Este método se conoce como almacenamiento en frío estático (SCS). Aunque la tasa metabólica de los hígados a 0-4 ° C es muy baja, todavía existe la demanda de 0,27 mol de oxígeno / min / g de tejido de hígado, que no puede ser proporcionado durante 1 SCS. El método convencional de SCS, por lo tanto, resulta en cierto grado de lesión (adicional) de hígados de donantes. Si bien esta cantidad de lesiones conservación no es un problema en los hígados de donantes de buena calidad, puede convertirse en un factor crítico y limitante en hígados subóptimos que ya han sufrido algún grado de lesión en el donante. Por esta razón, los hígados con una calidad subóptima o llamados criterios extendida donantes (ECD) hígados se rechazan con frecuencia para el trasplante como la o riesgof fracaso del injerto temprano se considera que es demasiado alto. Los altos índices de función retardada del injerto, no función primaria, y las estenosis biliares no anastomóticas (NAS) se han descrito en los receptores de hígados de donación después de la muerte circulatorio (DCD), los donantes de mayor edad o receptores de injertos esteatósicos 2. NAS son una causa importante de morbilidad y mortalidad después del trasplante hepático. NAS puede ocurrir tanto en los conductos biliares donante extra e intra y puede ser acompañado de barro biliar intraductal y la formación de yeso 3,4. Aunque la etiología de la NAS se cree que es multifactorial, la lesión por isquemia / reperfusión de los conductos biliares durante la conservación de injerto y el trasplante ha sido identificado como un importante mecanismo de 2,5 subyacente. Trasplante de un injerto DCD ha sido identificado como uno de los mayores factores de riesgo para el desarrollo de NAS. La combinación de un periodo de isquemia caliente en un donante DCD, isquemia fría durante la preservación de órganos, y la posterior reperfusiónlesiones en el receptor se cree que es responsable de la lesión irreversible de las vías biliares, que, en combinación con una pobre capacidad de regeneración de los conductos biliares, da lugar a cicatrices fibróticas y el estrechamiento de los conductos biliares después del trasplante hepático 2,5. NAS se han reportado hasta en el 30% de los pacientes que recibieron un hígado DCD 6-8. Ha quedado claro que el método actual de SCS de injertos de hígado para el trasplante es insuficiente para hígados ECD preinjured como los de donantes DCD. Se necesitan métodos alternativos para aumentar y optimizar el uso de hígados de DIT para el trasplante.
Máquina de perfusión (MP) es un método de preservación de órganos que pueden proporcionar una mejor preservación de órganos de donantes, en comparación con SCS. MP podría ser especialmente relevante para la preservación de los injertos de ECD. Una ventaja importante de MP es la posibilidad de proporcionar oxígeno para el injerto durante el periodo de preservación. MP se puede realizar a diversas temperaturas,que han sido clasificados como hipotermia (0-10 ° C), subnormothermic (10-36 ° C) y normotérmica (36-37 ° C) MP (NMP). Dependiendo de la temperatura utilizada para MP, el tipo de fluido de perfusión tiene que ser ajustado y con el aumento de temperatura más oxígeno debe ser suministrado. La primera aplicación clínica de la MP en el trasplante de hígado humano se basó en perfusión hipotérmica sin oxigenación activa del 9,10 fluido de perfusión. En modelos animales, MP oxigenada hipotermia (0-10 ° C) se ha demostrado que tiene efectos protectores contra la isquemia / reperfusión del hígado injerta 11 y proporcionar una mejor conservación del plexo vascular peribiliary de los conductos biliares 12. Subnormothermic oxigenada MP a 20 ° C o 30 ° C también se ha estudiado en modelos animales y se demostró para proporcionar la recuperación anterior de la función del injerto de hígados DCD, en comparación con SCS 13,14. La viabilidad de MP subnormothermic oxigenada de hígados humanos fue rectemente reportado en una serie de siete hígados de donantes humanos desechados 15. NMP (37 ° C) permite la evaluación de la viabilidad del injerto y la funcionalidad antes del trasplante 16,17. Además, MP permite recalentamiento gradual del injerto hepático antes del trasplante, que ha sido demostrado para facilitar la recuperación y reanimación del injerto 18.
El dispositivo de perfusión utilizada en el protocolo actual de la máquina de perfusión hepática permite dual de perfusión (a través de la vena porta y la arteria hepática) usando dos bombas centrífugas, que proporcionan un flujo portal continuo y un flujo arterial pulsátil. El sistema es controlado por presión, lo que permite auto-regulación del flujo a través del hígado, dependiendo de la resistencia intrahepática. Dos oxigenadores de membrana de fibra hueca permiten la oxigenación del injerto hepático, así como para la eliminación de CO 2. La temperatura se puede ajustar en función del tipo previsto de MP (temperat mínimo ure de 10 ° C). Flujo, presión y temperatura se visualizan en el dispositivo en tiempo real, lo que permite un control continuo del proceso de perfusión. Un nuevo equipo desechable estéril de tubos, depósito y oxigenadores está disponible para la perfusión de cada injerto (Figura 1).
El objetivo de este artículo de vídeo es proporcionar un paso a paso para el protocolo ex situ máquina de perfusión normotérmica de hígados de donantes humanos usando esta máquina de perfusión hepática de nuevo desarrollo.
Figura 1: (A) Un dibujo esquemático, (B) una foto de la máquina de perfusión, (C) una vista más cercana del oxigenador, y (D) de la bomba centrífuga utilizada para la perfusión normotérmica de hígados de donantes humanos.conseguir = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocolo
Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Ético Médico (Medisch ethische Toetsingscommissie) del Centro Médico Universitario de Groningen, Holanda.
1. Preparación del líquido de perfusión
Nota: El volumen total del fluido de perfusión preparado para máquina de perfusión normotérmica de acuerdo con este protocolo es 2233 ml y la osmolaridad dirigida del líquido de perfusión es 302 mOsmol / L.
- De los componentes del fluido de perfusión se describe en la Tabla 1, mantener las células rojas de la sangre humanas lleno, plasma fresco congelado y albúmina humana separada. Mezclar el resto de los componentes de una manera estéril y almacenar la solución en una bolsa estéril para el transporte a la sala de operaciones (OR). Haga esto en un ambiente estéril (lo ideal sería un buen centro de prácticas de fabricación) o en una cabina de flujo laminar en un cuarto de cultivo.
| Componentes | Cantidad |
| Repleto de glóbulos rojos (hematocrito 60%) | 840 ml |
| El plasma fresco congelado | 930 ml |
| La albúmina humana 200 g / L (Albuman, Sanquin) | 100 ml |
| Nutrición parenteral Modificado (Clinimix N17G35E, Baxter International Inc.) | 7,35 ml |
| Las multivitaminas para infusión (Cernevit, Baxter International Inc.) | 7 l |
| Oligoelementos concentrados para infusión (Nutritrace, B. Braun Melsungen AG) | 7,35 ml |
| Metronidazol para la administración iv (5 mg / ml) (Flagyl, Sanofi-Aventis) | 40 ml |
| Cefazolin 1000 mg frasco de polvo 5 ml para la administración iv (Servazolin, Sandoz) | 2 ml |
| Insulina de acción rápida (100 UI / ml) (Actrapid, Novo Nordisk) | 20 ml |
| Glubionato de calcio, solución intravenosa 10%, 137,5 mg / ml (Sandoz) | 40 ml |
| H2O estéril | 51,3 ml |
| NaCl solución 0,9% | 160 ml |
| El bicarbonato de sodio solución 8,4% | 31 ml |
| La heparina 5.000 IE / ml para la administración intravenosa | 4 ml |
| Total | 2.233 ml |
Tabla 1: Componenct de la perfusión de fluidos 16.
- Transferencia de las células rojas de la sangre (840 ml) humano lleno, plasma fresco congelado (930 ml), albúmina de 200 g / L humana (100 ml) y la solución preparada en la etapa 1.1 a la O para ser administrados al dispositivo de perfusión.
2. Cebado del dispositivo de perfusión
- Añadir los componentes del fluido de perfusión, incluyendo los glóbulos rojos humanos embalado, plasma fresco congelado, albúmina humana y la solución preparada en el paso 1.1 a la máquina a través del conector en la parte superior de los oxigenadores y eliminar todas las burbujas de aire de la tubería.
- Encienda la bomba venosa y siga las instrucciones del fabricante en la pantalla. A continuación, encienda la bomba arterial y siga las instrucciones del fabricante en la pantalla.
- Null los medidores de presión en contra de la presión atmosférica, siguiendo las instrucciones de la pantalla. Esto asegura que la presión medida durante los perfusion es la presión real en el nivel de la vena porta y la arteria hepática.
- Iniciar la oxigenación usando carbógeno (95% O 2 + 5% de CO 2) a una velocidad de flujo de 4 L / min. El flujo de aire se dividirá entre los dos oxigenadores (2 l / min por oxigenador) y esto debe dar lugar a una PO 2 de alrededor de 60 kPa (o 450 mmHg) en el líquido de perfusión. Para perfusiones más largos, es aconsejable usar fuentes separadas de oxígeno y dióxido de carbono. Esto permite pequeños ajustes en la relación O2 / CO 2, que se pueden utilizar para ajustar el pH y pCO 2 del fluido de perfusión.
- Tomar una muestra de perfusión para la medición de gases en sangre 15-20 min después de que el dispositivo ha sido cebado y controlar el pH y los electrolitos en consecuencia.
NOTA: Asegúrese de desechar unos 3 ml de líquido de perfusión antes de tomar las muestras, ya que este líquido se encuentra en el tubo periférico y no representa el líquido de perfusión en el sistema. Añadir un 8,4% de bicarbonato de sodio slución de la capacidad amortiguadora, apuntando a un pH fisiológico (7,35-7,45). Por ejemplo, agregue 25-35 ml de una solución de bicarbonato de sodio 8,4% y comprobar los niveles de pH y bicarbonato en el líquido de perfusión mediante la toma de muestras para la medición de gases en sangre a intervalos regulares.
3. Adquisiciones y Preparación de hígados de donantes
Nota: Procurar el órgano utilizando la técnica estándar de refrigeración en situ y enjuagar con líquido de conservación en frío (0-4 ° C) 19. Para facilitar la canulación de la arteria, dejar un segmento de la aorta supratruncal unido a la arteria hepática (Figura 2A).
- Lave los conductos biliares con el líquido de conservación (es decir, de la Universidad de la solución de Wisconsin). Ligar el conducto cístico con una sutura quirúrgica.
- Embale y almacene el órgano en una bolsa órgano donado estéril estándar y caja con hielo triturado para su posterior transporte hasta el centro de MP.
- Comienzoel procedimiento mesa del fondo inmediatamente después de la llegada del hígado del donante en el quirófano.
- Tomar una muestra de al menos 10 ml del líquido de preservación para las pruebas microbiológicas.
- Quitar los archivos adjuntos diafragmáticas a la zona desnuda del hígado, así como cualquier músculo cardíaco restante desde el manguito superior de la vena cava con tijeras quirúrgicas.
- Diseccionar la arteria y la vena porta con unas tijeras de disección y ligar las ramas laterales utilizando suturas quirúrgicas o hemoclips.
- Cierre el extremo distal del segmento de aorta supratruncal usando una sutura no absorbible monofilamento (por ejemplo, 3-0 Prolene). Inserte la cánula arterial en el extremo proximal de la aorta supratruncal y seguro con suturas (Figura 2). Utilice la cánula proporcionado en el paquete desechable tal como se suministra por el fabricante del dispositivo de perfusión.
- Inserte la cánula venosa en la vena porta y seguro con suturas. Utilice la cánula proporcionada en los dispospaquete de poder. La vena hepática sigue siendo uncannulated.
- Lave el conducto biliar con la solución de conservación. Inserte un catéter de silicio en el conducto biliar y seguro con suturas.
NOTA: No inserte el catéter demasiado profundamente en el conducto biliar, ya que puede causar lesiones en el epitelio biliar. - Lave el hígado con una solución de NaCl al 0,9% a través de la cánula de la vena porta de la siguiente manera:
- Si el injerto se ha conservado en la Universidad de Wisconsin solución como la solución de preservación, enjuagar el hígado con 2.000 ml de frío (C 0-4 °) solución de NaCl al 0,9%, seguido de 500 ml de agua tibia (37 ° C) 0,9% de NaCl solución.
- Si el injerto se ha conservado en una solución de histidina-triptófano-cetoglutarato como la solución de preservación, enjuagar el hígado con 1.000 ml de frío (C 0-4 °) solución de NaCl al 0,9%, seguido de 500 ml de agua tibia (37 ° C) 0,9 solución de NaCl%. El propósito de la descarga caliente es para evitar una caída significativa en la temperatura de lafluido de perfusión.
- Realizar el rubor caliente inmediatamente antes de conectar el hígado al dispositivo de perfusión.
NOTA: Siempre mantenga la duración entre rubor cálido y comienzo de NMP menos de 1-2 min.
| Características del donante (n = 12) | Número (%) o mediana (IQR) |
| Años de edad) | 61 (50-64) |
| Género masculino) | 8 (67%) |
| Tipo de donantes DCD, Maastricht tipo III DBD | 10 (83%) 2 (17%) |
| Índice de masa corporal (IMC) | 27 (25-35) |
| Motivo de rechazo Edad DCD +> 60 años DCD + IMC alto DCD + diversas razones * Esteatosis grave | 5 (41%) 3 (25%) 2 (17%) /> 2 (17%) |
| Solución de preservación Solución UW Solución HTK | 6 (50%) 6 (50%) |
| Donantes tiempo de isquemia caliente en DCD (min) | 14 (17-20) |
| Tiempo de isquemia fría (min) | 389 (458-585) |
| Índice de riesgo de los donantes (DRI) | 2,35 (2,01-2,54) |
Tabla 2: Donantes características * la historia de los donantes del consumo de drogas por vía intravenosa durante un injerto y donantes prolongada sO 2 <30% después de la retirada del soporte vital para otro injerto.. Abreviaturas: DCD, donación después de la muerte circulatoria; DBD, donación después de la muerte cerebral; UW, Universidad de Wisconsin; HTK, histidina-triptófano-cetoglutarato
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Figura 2: (A) Imágenes de un injerto de donante humano que se ha preparado en la mesa del fondo y (B - D) fue posteriormente perfundido normothermically. (A) La cánula arterial se inserta en la aorta surpratruncal y la cánula venosa se inserta en la vena portal. El conducto biliar se canula con un catéter biliar silicio. (B) El hígado se coloca en la cámara de órganos con su superficie anterior orientada hacia abajo y cánulas están conectadas a los tubos del dispositivo de perfusión. (C) 30 min después del inicio de la perfusión normotérmica máquina. (D) 6 hr después del inicio de la perfusión normotérmica máquina. Durante el funcionamiento de la cámara de órganos está cubierto por una cubierta transparente para mantener un ambiente húmedo estéril para el hígado (no se muestra en estas fotos)."> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Máquina Normotérmica perfusión
- Coloque el hígado en la cámara de órgano con la superficie anterior hacia abajo. Inmediatamente conectar el hígado al dispositivo de perfusión imprimado mediante la conexión de la cánula de la vena portal para el tubo de portal de entrada del dispositivo de perfusión y la cánula arterial al tubo de flujo de entrada arterial del dispositivo.
- Iniciar la perfusión en ambos lados del portal y arterial, siguiendo las instrucciones del fabricante en la pantalla. Ajuste la presión arterial media en 70 mmHg y la presión venosa portal media en 11 mmHg.
- Tomar muestras de líquido de perfusión cada 30 minutos para el análisis inmediato de los parámetros de gases en sangre (PO 2, PCO 2, SO 2, HCO 2 - y pH) y los parámetros bioquímicos (glucosa, calcio, lactato, potasio y sodio), utilizando un analizador de gases en sangre convencional . Asegúrese de desechar unos 3 ml de la perfusiónlíquido antes de tomar las muestras, ya que este fluido es en el tubo periférico y no representa el fluido de perfusión en el sistema.
- Para tomar estas muestras aspirar el líquido de perfusión con una jeringa de 1 ml de los conectores de toma de muestras que forman parte del conjunto de tubos desechable del dispositivo de perfusión. Para cada muestra utilice una nueva jeringa e inmediatamente eliminar las burbujas de aire de la jeringa en la aspiración del líquido de perfusión. A continuación, inserte la jeringa en el analizador de gases en sangre y siga las instrucciones del fabricante en el manual del analizador.
- Recoger plasma del líquido de perfusión, congelar y almacenar a -80 ° C para la determinación de la fosfatasa alcalina (AlkP), gamma-glutamil transferasa (gamma-GT), alanina aminotransferasa (ALT), urea y bilirrubina total. Recoger plasma después de 5 min de centrifugación del fluido de perfusión a 1500 xg y 4 ° C.
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Resultados
12 hígados humanos que se negaron a trasplantes debido a diversas razones se utilizaron después de obtener el consentimiento informado para la investigación de las familias de los donantes. Características de los donantes se describen en la Tabla 2. Los hígados de donantes humanos fueron perfundidos normothermically durante 6 horas utilizando el protocolo descrito en este documento. La calidad de los injertos de hígado se evaluó mediante el control de la homogeneidad macroscópica de la perfusión del híg...
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Discusión
Este video ofrece un paso a paso para el protocolo máquina de perfusión normotérmica de hígados de donantes humanos usando un dispositivo que permite controlar la presión de doble perfusión a través de la vena porta hepática y la arteria. Al seguir este protocolo, fallas técnicas de la máquina de perfusión no ocurrieron y todos los injertos estaban bien perfundido y bien oxigenada. Los hígados perfundidos in situ ex tenían la hemodinámica estable y eran metabólicamente activa, según la definición de la producci...
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Divulgaciones
Los autores de este manuscrito no tienen ningún conflicto de intereses a revelar.
Agradecimientos
Este trabajo de investigación fue financiada por donaciones otorgados por Innovatief Actieprogramma Groningen (IAG-3), Jan de Cock Kornelis Stichting y Tekke Huizingafonds, todo en los Países Bajos. Estamos agradecidos a todos los coordinadores de trasplante holandeses para la identificación de los posibles descartados hígados y obtener el consentimiento informado.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Asistencia hepática | Asistencia de órganos | OA. Li.Li.140 | Dispositivo de perfusión |
| Liver Assist, paquete desechable, | Organ Assist | OA. Li.DP.540 | Juego y cánulas desechables |
| Meredith No.8 | Vygon Nederlands B.V. | 1362082 | Cánula de vías biliares |
| Albúmina humana 200 g/L / ALBUMÁN | Sanquin | 15522598 | 100 ml |
| Nutrición parenteral modificada | Baxter Nederland B.V. | N14G30E | 7,35 ml |
| Multivitamínicos para infusión / CERNEVIT | Baxter International Inc. | 9800927 | 7 μ l |
| Oligoelementos concentrados para perfusión / NUTRITRACE | B. Braun Melsungen AG | 14811332 | 7,35 ml |
| Metronidazol 5 mg/ml | Baxter Nederland B.V. | 98181882 | 40 ml |
| Cefazolina / SERVAZOLINA | Sandoz B.V. | 15611337 | 2 ml |
| Insulina de acción rápida | varios proveedores | 20 ml | |
| Glubionato de calcio, solución intravenosa 10%, 137,5 mg/ml | Sandoz | 97038695 | 40 ml |
| H2O estéril | Fresenius Kabi Nederland B.V. | 98084453 | 51,3 ml |
| NaCl 0,9% | Baxter Nederland B.V. | 15262510 | 160 ml |
| Heparina 5.000 IE/ml para administración intravenosa | LEO Pharma B.V. | 98026178 | 4 ml |
| Bicarbonato de sodio 8,4% | B. Braun Melsungen AG | 97973874 | La cantidad depende del pH |
| Glóbulos rojos empaquetados (en SAGM) | Banco de sangre (Sanquin) | N0012000 | 750 ml |
| Plasma fresco congelado | Banco de sangre (Sanquin) | N04030A0/N04030B0 | 900 ml |
Referencias
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