Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

Summary

Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal.

Abstract

La incidencia tanto de adenocarcinoma de esófago y su precursor, metaplasia de Barrett, están aumentando rápidamente en el mundo occidental. Además adenocarcinoma esofágico generalmente tiene un pronóstico pobre, con pocas mejoras en las tasas de supervivencia en los últimos años. Estas son las condiciones difíciles de estudiar y no ha habido una falta de plataformas experimentales adecuados para investigar los trastornos de la mucosa esofágica.

Un modelo de la mucosa esofágica humano ha sido desarrollado en el laboratorio MacNeil que, a diferencia de los sistemas de cultivo de células 2D convencionales, recapitula las interacciones célula-célula y célula-matriz presentes in vivo y produce un epitelio estratificado maduro similar a la de la humano normal esófago. Brevemente, el modelo utiliza células no transformadas normales fibroblastos humanos primarios esofágicas y epiteliales cultivadas dentro de un andamio acelular de esófago de origen porcino. Caracterización inmunohistoquímica de este modelopor CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción demuestra recapitulación apropiado de la histología de la mucosa esofágica humano normal.

Este modelo proporciona un modelo experimental robusto, biológicamente relevante de la mucosa esofágica humano. Puede ser fácilmente manipulado para investigar una serie de preguntas de investigación, incluyendo la eficacia de agentes farmacológicos y el impacto de la exposición a factores ambientales tales como el alcohol, las toxinas, alta temperatura o componentes el reflujo gastro-esofágico. El modelo también facilita períodos prolongados de cultivo no alcanzables con cultivo celular 2D convencional, lo que permite, entre otras cosas, el estudio del impacto de la exposición repetida de un epitelio maduro para el agente de interés para un máximo de 20 días. Además, una variedad de líneas celulares, tales como las derivadas de tumores de esófago o metaplasia de Barrett, se puede incorporar en el modelo para investigar procesos tales como la invasión tumoral y responsivene drogasss en un entorno más biológicamente relevante.

Introduction

La mucosa esofágica comprende un epitelio escamoso estratificado por encima de una capa de tejido conectivo, la lámina propia, y es uno de los primeros sitios para encontrar factores de estrés ambiental ingeridos. La exposición a las toxinas alimentarias está implicado en el desarrollo del carcinoma escamoso de esófago, mientras que el reflujo esofágico duodenogastro es un factor crítico en la patogénesis de la metaplasia de Barrett, que se asocia con un mayor riesgo de progresión a adenocarcinoma esofágico. Carcinomas esofágicos son la ^8ª tumor maligno más común en los hombres del Reino Unido y el adenocarcinoma de esófago está aumentando rápidamente en el mundo occidental ^1. Por otra parte, ha habido pocas mejoras en el pronóstico de la enfermedad, con una tasa de supervivencia global a 5 años de alrededor del 15%. En consecuencia, existe una necesidad de plataformas experimentales para investigar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en este epitelio esofágico y su potencial implicación en la Developo de metaplasia o neoplasia.

Aunque las líneas celulares inmortalizadas o tumorales permiten a los investigadores para estudiar la respuesta de las células epiteliales a estos factores de estrés in vitro, siguen siendo proliferativa y fallan a diferenciarse en las células epiteliales maduros que se encuentran en las capas superiores de la mucosa esofágica. Además, las líneas de células que ya han sido sometidos a la tumorigénesis pueden proporcionar información limitada sobre las respuestas iniciales de las células normales dentro del epitelio a factores ambientales; y esta es la etapa en la que el potencial para la intervención terapéutica puede ser más alto. Finalmente, los sistemas de cultivo de células convencionales no logran captar las interacciones potencialmente importantes entre células epiteliales y mesenquimales y entre estas células y la matriz circundante que ocurren dentro de los tejidos in vivo.

Los modelos animales proporcionan un microambiente más realista para el estudio de las respuestas de la epitheli esofágicoum y puede incorporar la inducción artificial de la enfermedad de reflujo gastro-esofágico ^2. Sin embargo, puede ser más difícil de manipular los factores de estrés ambientales en estos modelos y que puede no representar plenamente la respuesta dentro del esófago humano.

Otros modelos esofágicas humanos experimentales se han desarrollado que utilizan células primarias, células inmortalizadas o líneas de células tumorales en un colágeno, fibroblastos o combinado colágeno / Matrigel, andamio que contienen ^3,4. Es menos mano de obra para generar estos andamios que el andamio de esófago acelular descrito en este manuscrito, y estos modelos organotípicos proporcionan una herramienta útil, en particular en el estudio de la invasión tumoral ^5,6, donde la infiltración de células tumorales en el gel de colágeno puede ser fácilmente observado. Sin embargo, estos geles de colágeno tienen propiedades mecánicas no nativos y carecen de ciertas características del tejido original, incluyendo una membrana basal específico y el appropriattopografía de la superficie e. Esto puede influir en el comportamiento de las células resultantes en, por ejemplo, más pobre adhesión entre el epitelio y el andamio cuando se utiliza un andamio de gel de colágeno ^7. Como consecuencia de ello se desarrolló el andamio de esófago porcino acelular, con la ventaja de ser un andamio biológicamente más realista y por lo tanto más apropiado para su uso como una plataforma experimental. También se ha demostrado que es mejor para incorporar células primarias en las construcciones de esófago que inmortalizadas líneas de células epiteliales del esófago, tales como Het-1A, ya que estas células forman un epitelio multicapa, pero no para estratificar o diferenciar ^4,7,8 .

En consecuencia, este protocolo ha sido adaptado de un método ya en uso en el laboratorio MacNeil para la fabricación de tejidos de la piel y mucosa oral ingeniería ^9,10 e incorpora un andamio de esófago porcino-de cellularized combinado con células esofágicas humanas primarias epiteliales y fibroblastos. Thiprotocolo s produce un epitelio estratificado maduro, similar a la de la esófago humano normal como se demuestra por CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción. El modelo resultante proporciona una plataforma experimental para estudiar las respuestas a factores de estrés ambiental, y se ha utilizado eficazmente para investigar los cambios en la expresión génica en el epitelio esofágico en respuesta a el reflujo componentes ^11.

Protocol

Células esofágicas humanas se obtuvieron a partir de pacientes sometidos a cirugía gástrica o esofágica. Se obtuvo el consentimiento informado para que el tejido se puede utilizar con fines de investigación, y el tejido utilizado de forma anónima bajo las aprobaciones éticas adecuadas (SSREC 165/03, Tejido humano de investigación del Banco de licencia 12179).

1. Aislamiento de células humanas epiteliales del esófago

1. Trabajando en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, preparar el medio de cultivo epitelial mediante la mezcla de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y F12 de Ham en una relación 3: 1 (v: v). Añadir 10% (v / v) de FCS, 10 ng del factor de crecimiento epidérmico / ml, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 1,8 x 10 ^-4 M adenina, 5 g / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 2 x 10 ^-7 M triyodotironina, 1 x 10 ^-10 M toxina del cólera, 2 x 10 ^-3 M glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B.
2. El uso estándartécnicas estériles, pusieron 11 ml de DMEM, 10% FCS, 2 x 10 ^-3 M L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B en un matraz de cultivo de tejido T75. Añadir 1 x 10 ⁶ irradiados letalmente fibroblastos 3T3 de ratón ¹² en 1 ml del mismo medio y se incuba durante la noche a 37 ° C en un CO _2, ambiente humidificado 5%. Esto producirá una capa de alimentación para el posterior cultivo de células epiteliales.
3. Con un bisturí y siguiendo las recomendaciones de un anatomopatólogo, diseccionar una muestra de aproximadamente 2 cm ² de tejido de la región de fondo libre de enfermedad de la mucosa escamosa esofágica obtenidos de pacientes sometidos a cirugía gástrica o esofágica. El transporte al laboratorio en un recipiente de 50 ml de medio de transporte estéril (PBS 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,625 g / ml de anfotericina B) a temperatura ambiente.
4. En este punto, almacenar el tejido en el transportemedio para un máximo de 12 horas (durante la noche) a 4 ° C, por conveniencia; Sin embargo, no use los períodos de almacenamiento más largos que son fruto de la viabilidad celular reducida.
5. Trabajando en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, esterilizar una hoja de bisturí por inmersión en etanol al 70% durante 5 min. Enjuague en PBS estéril.
6. Coloque el tejido en una placa de Petri estéril y utilizar el bisturí para cortar en tiras de 0,5 cm. Añadir 5 ml de 0,1% (w / v) de tripsina en PBS a la placa de Petri, colocar la tapa sobre el plato y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
7. Añadir 5 ml de FCS al tejido en la placa de Petri para inhibir la tripsina. Sosteniendo la tira de tejido con pinzas estériles, raspar suavemente la superficie epitelial con la hoja del bisturí durante 1-2 min por tira para eliminar las células epiteliales en el medio circundante. Retire el tejido raspado y reservar. Repita el proceso para todas las tiras de tejido.
8. Recoger el medio que contiene las células epiteliales desprendidas en un tubo de centrífuga de 15 mly centrifugar (5 min, 200 xg). Verter el sobrenadante y resuspender el precipitado en 12 ml de medio epitelial (descrito en el paso 1.1).
9. Retirar y desechar el medio de la capa de células de alimentación en el matraz T75 preparado en la etapa 1.2. Usar una pipeta estéril para añadir la suspensión de células que contiene las células epiteliales recién aisladas al matraz y se incuba a 37 ° C en un 5% de CO _2, atmósfera humidificada.
10. Después de 24 horas verter y desechar el medio de cultivo, que también contendrá restos celulares, y reemplazar con 12 ml de medio epitelial fresco. Continuar la incubación a 37 ° C en un CO _2, ambiente humidificado 5%. Colonias comenzarán a aparecer durante el próximo de 24 a 48 horas y pueden ser vistos por colocar el frasco de cultivo bajo un microscopio óptico estándar. Retirar el medio de cultivo gastado y reemplazar con un volumen igual de medio fresco cada 2 a 3 días.
11. Una vez que el frasco se ha alcanzado el 80% de confluencia, el paso de las células ^13. Dividir la cells en una proporción de 1: 5 para aumentar el número de células para su uso en el modelo. Siga el paso 1.2 para establecer capas de alimentación de las células irradiadas 3T3 en cada matraz que recibirá las células epiteliales de las 24 horas anteriores a pases de las células.
    Nota: Utilice las células epiteliales en el modelo de esófago se describe a continuación entre los pasos 1 y sólo el 4.

2. Aislamiento de fibroblastos humanos esofágicas

1. Trabajando en una cabina de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, tome el tejido a un lado en el paso 1.7. Colocar en una placa de Petri estéril y picar finamente cortando con una hoja de bisturí estéril. Añadir 10 ml de 0,5% (w / v) Una solución de colagenasa y coloque la tapa en la caja de Petri y se incuba a 37 ° C durante la noche en una de CO _2, ambiente humidificado 5%.
2. Transferir el resumen a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar (10 min, 200 xg), cuidadosamente verter y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de cultivo de fibroblastos (DMEM 10% de FCS, 2 x 10 ^-3 M L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B).
3. Coloque la suspensión en un matraz T75 e incubar a 37 ° C en un CO _2, ambiente humidificado 5%. Después de 24 horas se vierte fuera el medio, que contendrá los escombros y reemplazar con 12 ml de medio de fibroblastos fresco. Reemplazar el medio de cultivo cada 2 a 3 días y las células de paso una vez que han alcanzado 80% de confluencia ^13, la división de las células en una proporción 1: 5 para aumentar el número de células.
   Nota: Utilice las células de fibroblastos en el modelo descrito a continuación entre los pasos 4 y sólo el 10.

3. Preparación de la cellularized-De esofágica Andamios

1. Obtener esófagos porcina intacta en un matadero de cerdos Landrace recién sacrificados que se utilizan para la producción de alimentos. Uno esófago única proporcionará andamios suficientes para aproximadamente 30 construcciones independientes.
   Nota: Debido a la extensa y hora consuming requiere protocolo de esterilización, normalmente es digno de obtención y procesamiento de un mínimo de 10 esófagos a la vez.
2. Colocar inmediatamente el esófago recién extirpado en una olla estéril 180 ml que contenía aproximadamente 150 ml de solución de povidona yodada 10% durante 5 min para reducir cualquier carga microbiana contaminante. Transferir el esófago a un segundo bote que contiene aproximadamente 100 ml de PBS estéril que contiene 200 IU / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B.
   1. Vuelva a colocar la tapa sobre el recipiente y transportar el esófagos al laboratorio a temperatura ambiente. Dos o tres esófagos pueden ser transportados en cada recipiente, dependiendo de su tamaño.
3. Una vez en el laboratorio, manipular el tejido en una campana de flujo laminar utilizando una técnica aséptica para minimizar la contaminación microbiana. Esterilizar pinzas, tijeras y hojas de bisturí por inmersión durante 5 min en etanol al 70%, y lavado en PBS estéril.
4. Manejar los esophagus con unas pinzas estériles. Usando las tijeras, corte abierta longitudinalmente el esófago. Enjuague el tejido colocando el esófago en un bote estéril 180 ml que contenía aproximadamente 100 ml de PBS estéril y agitando suavemente para eliminar los residuos.
5. Limpiar un tablero de corcho disección rociando etanol generosamente con 70% y dejar secar.
6. Retire el esófago del PBS, y el uso de agujas estériles, precisar el esófago en el tablero, más alta superficie de la mucosa. Sujete la superficie de la mucosa en un extremo del esófago con pinzas estériles y alejarse de la junta. Esto separará la mucosa de la submucosa subyacente.
   1. A continuación, utilice una hoja de bisturí estéril para diseccionar el esófago longitudinalmente a lo largo de la lámina propia, quitando los alfileres a medida que la disección avanza para permitir que la mucosa que se levante de distancia.
7. Conserve la mucosa diseccionado y deseche la submucosa subyacente.
8. Corte y deseche las más proximales y distales 2 cm de tél mucosa ya que hay un mayor número de glándulas submucosas y una lámina propia más gruesa en esas zonas, respectivamente ^7.
9. Utilice un bisturí para cortar el tejido restante en 5 cm ^2. Coloque todo el tejido cortado en una olla estéril 180 ml que contenía aproximadamente 150 ml de PBS estéril y agitar suavemente para enjuagar el tejido. Si el procesamiento de más de cinco esófagos a la vez puede ser necesario utilizar varias ollas de este y los tres pasos siguientes.
10. Utilizando pinzas estériles, transferir el tejido cortado en una olla de 180 ml que contiene 150 ml de estéril M NaCl 1, 200 UI / ml de penicilina, 200 mg / ml estreptomicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B. Incubar durante 72 horas a 37 ° C.
11. Coloque el tejido en un bote de 180 ml fresco que contiene 150 ml de PBS estéril. El epitelio se han comenzado a separar visiblemente del tejido subyacente. Pelar suavemente el epitelio separar desde el esófago cerdo usando pinzas estériles y deseche.
    1. Coloque el restante ttema en un 180 ml olla fresca y añadir 150 ml de PBS estéril. Agite suavemente durante 5 min para lavar. Vierta el PBS y repetir dos veces más con PBS fresco.
12. Colocar todo el tejido en una botella de vidrio de 500 ml que contiene 400 ml de estéril 80% (v / v) de solución de glicerol durante 24 horas a temperatura ambiente. Transferencia a 400 ml de estéril 90% (v / v) para una solución de glicerol 24 horas más.
13. Almacenar en 400 ml de solución de glicerol al 100% estéril a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 meses para deshidratar y esterilizar el tejido mientras que preserva la integridad de la membrana basal.

4. Producción de la Cultura de Medios

1. Preparar suero de ternero recién nacido quelado para su uso en el medio de cultivo.
   1. Verter 100 g de Chelex 100 en una botella de vidrio de 1 L y añadir agua de-ionizada. El volumen exacto no es crítico pero suficiente agua debe añadirse para cubrir el polvo Chelex. Añadir un agitador magnético y esterilizar en autoclave (121 ° C durante15 min).
   2. Permita que la botella se enfríe y el Chelex se asiente. En una cabina de flujo laminar verter el exceso de agua, añadir 500 ml de suero de ternero recién nacido (NCS) y dejar agitar durante la noche a 4 ° C.
   3. Deja de agitar y permitir que el Chelex para resolver, esto puede tardar hasta 30 minutos. En una cabina de flujo laminar se decanta el suero quelado con una pipeta estéril, teniendo cuidado de no perturbar el Chelex, y almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 ° C.
2. Prepare tres medios diferentes en una cabina de flujo laminar, comenzando con la pro-proliferativa y terminando con formulaciones pro-diferenciadores.
   1. Preparar Composite Medio I compuesto por DMEM y Hams F12 en una proporción 3: 1 (v: v), 4 x 10 ^-3 M de L-glutamina, 0,5 mg / ml de hidrocortisona, 1 x 10 ^-4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 ^-12 M triyodotironina, 1,8 x 10 ^-4 M adenina, 1,88 x 10 ^-3 M CaCl _2, 4 x 10 ^-12 M progesterona, 10 mg / ml eninsulina, 10 mg / ml de transferrina, 10 ng / ml de selenio, 1 x 10 ^-3 M etanolamina y 0,1% (v / v) quelado NCS.
   2. Preparar Compuesto II como Medium Medium Compuesto I, excepto reemplazar el suero quelado con 0,1% (v / v) no quelados NCS.
   3. Preparar Composite Medium III como compuesto Medium II excepto progesterona omitir y aumento de suero a 2% (v / v) no quelados NCS.

5. La producción de la mucosa esofágica Modelo Humano

1. Realizar todos los trabajos en una campana de flujo laminar, utilizando una técnica aséptica para mantener un ambiente estéril. Esterilizar todas las herramientas por inmersión en etanol al 70% durante 5 min, antes de enjuagar en PBS estéril.
2. El día antes de que sea necesario, a rehidratar el andamio esofágico porcina acelular. Se requiere un pedazo de andamio para construir cada uno para estar preparados.
   1. Para rehidratar el lugar del tejido pedazos suficientes de andamio porcina en una olla que contiene 100 ml de PBS estéril, agitar y remojo durante 10 min. Decant el PBS y reemplazar con PBS fresco. Repita el proceso de lavado cinco veces para asegurar la eliminación de todo rastro de glicerol.
3. Pruebe la esterilidad andamio incubando el tejido rehidratado durante la noche en 100 ml de DMEM a 37 ° C. Si no hay cambio en el color o turbidez del medio de cultivo al final del periodo de incubación el andamio se supone que es estéril. Una vez que se ha confirmado la esterilidad, coloque el 5 cm andamio ² acelular en una placa de 6 pocillos, con el lado superior de la submucosa.
4. Colocar un anillo de grado médico estéril de acero inoxidable (diámetro interno 10 mm, diámetro externo 20 mm) en el centro de cada andamio y presionar suavemente hacia abajo con pinzas estériles, para asegurar un sellado adecuado con el tejido.
5. Cosecha de los fibroblastos usando tripsina-EDTA ¹³ para producir una suspensión celular. Contar las células utilizando un hemocitómetro ^14. Centrifugar la suspensión de células (10 min, 200 xg). Resuspender el sedimento celular en una apropiaciónvolumen te de medio de fibroblastos para producir un recuento final de células de 2,5 x 10 ⁶ células por ml.
6. Añadir 0,2 ml de medio de fibroblastos, que contiene 5 x 10 ⁵ fibroblastos esofágicas humanos, dentro de cada anillo. Inundar el área alrededor de la parte exterior del anillo con aproximadamente 2 ml de medio de fibroblastos. Se incuba a 37 ° C en un CO _2, ambiente humidificado 5%.
7. Después de 24 hr eliminar el medio de anillos y de fibroblastos y añadir al menos 5 ml de medio de fibroblastos fresco a cada pocillo, asegurando que el andamio está totalmente sumergido en un medio. Cultura durante 1 semana, a 37 ° C en un 5% de CO _2, atmósfera húmeda reemplazando el medio cada 2 a 3 días.
8. Después de 1 semana quitar las placas de 6 pocillos que contienen los andamios a una campana de inundación laminar, retire el medio e invertir cada andamio usando pinzas estériles, la colocación de la superficie de la mucosa hacia arriba. Este punto de tiempo se conoce como Día 0.
9. Coloque los anillos de acero sobre la superficie de la mucosa en el centro deel tejido como en el paso 5.4.
10. Preparar los frascos T75 de células epiteliales de tripsinización ^13. Después de lavar el PBS y antes de la adición de solución de tripsina-EDTA, añadir 2 ml de solución estéril de 0,02% (w / v) solución de EDTA a cada matraz. Incubar durante 2 minutos a 37 ° C. Toque en el frasco suavemente para separar selectivamente la capa alimentadora i3T3 dejando las células epiteliales adjuntos.
    Nota: Por lo general, no es práctico o necesario a paciente coincide con las células epiteliales de los fibroblastos ya incorporadas en el modelo de la semana anterior.
11. Retirar la solución de EDTA que contiene la capa de alimentación y añadir solución de tripsina-EDTA para cosechar las células epiteliales ^13. Contar las células utilizando un hemocitómetro ^14. Centrifugar la suspensión de células (10 min, 200 xg). Resuspender el sedimento celular en un volumen apropiado de Composite Medium 1 para producir un recuento final de células de 5 x 10 ⁶ células por ml.
12. Añadir 0,2 ml de compuesto medio I, que contiene 1 x 10 ⁶ células epiteliales, dentro del anillo. Inundar el área alrededor de la parte exterior del anillo con aproximadamente 2 ml de compuesto medio I y colocar las construcciones en la incubadora a 37 ° C en un 5% de CO _2, atmósfera húmeda.
13. Después de 24 horas (día 1) quitar los anillos y medio y agregar al menos 5 ml de Compuesto fresca Medio I, asegurando los andamios están completamente sumergidos y volver a la incubadora. Después de un 24 horas más (Día 2) eliminar el medio y se sustituye con al menos 5 ml de Compuesto Medio II, asegurando de nuevo los andamios están totalmente sumergidas y regresan a la incubadora.
14. En el Día de grado médico estéril rejillas de malla de acero inoxidable 4 lugar (2 cm de ancho x 2 cm de largo x 0,5 cm de altura), en placas de 6 pocillos frescos, uno por cada constructo. Use pinzas estériles para transferir las construcciones en la parte superior de las rejillas de acero, superior superficie de la mucosa.
    1. Añadir suficiente Composite Medium III de manera que el líquido alcanza la parte inferior del compuesto, pero la superficie esexpuesta al aire, esto asegura que la muestra se mantiene a una interfase aire-líquido. El volumen exacto de medio requerida variará dependiendo del espesor del andamio, el volumen del pozo y la altura precisa de la rejilla de acero inoxidable.
15. Mantener los materiales compuestos en una interfase aire-líquido para entre 10 y 20 días (día 14 a día 24), dependiendo de los requisitos del experimento. Sustituya el medio compuesto III con medio fresco cada 2 a 3 días (Lunes, Miércoles, Viernes es un régimen de fácil uso).
    Nota: Después de 5 días en una interfaz aire-líquido (día 9) las construcciones tienen un epitelio esofágico suficientemente maduro como para ser utilizado en los experimentos sobre el impacto de los factores ambientales en el epitelio esofágico.
16. Al final del experimento, fijar los constructos para el análisis histológico y la tinción inmunohistoquímica ^7, o extracto de proteína o ARN ^{11,16 15} desde el epitelio para más analyses. Si es necesario, retener el medio de cultivo acondicionado para el análisis de moléculas de señalización extracelular ^17.

Results

Este manuscrito describe el proceso requerido, que se muestra en forma esquemática en la Figura 1, para cultivo de modelos 3D del epitelio esofágico humano con éxito. Para confirmar la idoneidad del modelo como una plataforma experimental histológico y estudios inmunohistoquímicos han llevado a cabo la comparación de los tejidos cultivados con mucosa escamosa esofágica humano normal.

Evaluación histológica del epitelio producido por el método descrito muestra una, de varias ...

Discussion

Este manuscrito describe la producción y caracterización de un modelo de la mucosa esofágica humana biológicamente relevante adecuado para uso como una plataforma experimental para estudiar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en el epitelio esofágico.

Los pasos más críticos para el éxito de la producción de un modelo de la mucosa esofágica humana son: asegurar que la mayoría de las células epiteliales permanecen proliferativa y no lo ha comenzado a diferenciar antes ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tripsina	BD Biosciences	215240	Prepare una solución al 0,1% p/v en PBS y esterilize por filtro. Cálido en 37  ° C Baño de agua antes de usar.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Cálido en 37  ° C baño de agua antes
de usar Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37  ° C baño de agua antes de usar
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Factor de Crecimiento Epidérmico R	+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µ g/ml de solución madre en 10 mM de ácido acético, 1% FCS
Hydorcortisona	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare la solución madre en PBS y filtre la esterilización antes de usar
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare la solución madre en PBS y filtre la esterilización antes de usar
Insulina	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml de solución en 0.01  M HCl, diluir 1:10 en agua destilada y filtrar esterilizar antes de usar
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare la solución madre en agua destilada y filtre la esterilización antes de usar
Triyodotironina	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare la solución madre en agua destilada y filtre la esterilización antes de usar
Toxina del cólera	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare la solución madre en agua
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P0781
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Marca Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Disolver 1 tableta en 100  ml de agua y autoclave para esterilizar
la colagenasa A	Roche	10103578001
solución de povidona yodada	Ecolab	10830E	Marca Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Suero para terneros recién nacidos	Gibco	26010074
Progesterona	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare la solución madre en DMEM y filtre la esterilización antes de usar
la etanolamina	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare la solución madre en DMEM y filtre la esterilización antes de usar
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare la solución madre en DMEM y filtre la esterilización antes de usar use
O-fosforiletanolamina	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare la solución madre en DMEM y filtre la esterilización antes de usar
ITS (insulina, transferrina, selenio)	Lonza	17-838Z	Se utiliza para la preparación de medios compuestos
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37  ° C baño de agua antes de usar
EDTA 0.02% solución	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37  ° C Baño de agua antes de usar
T75 matraz de cultivo VWR		734-2313
Tubo de centrífuga de 50 ml	Fisher	11819650
tubo universal de 15 ml	SLS	SLS7504
bote de 180 ml	VWR	216-2603
Placa de Petri	SLS	150350
Placa de 6 pocillos	VWR	734-2323
anillos de			Fabricado internamente: acero inoxidable de grado médico, diámetro interno 10 mm, diámetro externo 20 mm
rejillas de malla de			Fabricado internamente: las láminas tienen orificios de 0,3 cm de diámetro, dobladas para producir rejilla 2  cm (w) x 2 cm (d) x 0,5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clon MM1. Úselo a 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Clon 6B10. Úselo a 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clon LL002. Úselo a 1:200.
Involucrin	Novocastra	INV	Clon SY5. Úselo a 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Ratón 3T3 fibroblastos	ATCC-LGC	CRL-1658	detenido, crecimiento por irradiación (60 Gy)