Las células madre mesenquimales generalmente se obtienen de la médula ósea y requieren cultivo de expansión. Cuando las muestras se coagulan antes del procesamiento, se puede aplicar un protocolo que utiliza el fármaco trombolítico uroquinasa (enzimático) para degradar el coágulo. De este modo, las células se liberan y están disponibles para el cultivo en expansión. Este protocolo proporciona una alternativa rápida y económica al remuestreo.
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Artículo de método
Un método enzimático para rescatar a las células madre mesenquimales de médula ósea Las muestras Clotted
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Resumen
Resumen
Las células madre mesenquimales (MSC), generalmente obtenidas de la médula ósea, a menudo requieren cultivo de expansión. Nuestro protocolo utiliza uroquinasa de grado clínico para degradar los coágulos en la médula ósea y liberar MSC para su uso posterior. Este protocolo proporciona una alternativa rápida y económica al remuestreo de médula ósea. La médula ósea es una fuente importante de MSC, que son interesantes para la ingeniería de tejidos y las terapias con células madre autólogas. Tras la retirada, la médula ósea puede coagularse, ya que comprende todo el sistema hematopoyético. Los coágulos resultantes también contienen MSC que se pierden para el cultivo en expansión o la terapia directa con células madre. Experimentamos que el 74% de las muestras de médula ósea canina contenían coágulos y produjeron menos de la mitad del número de células madre esperado de las muestras sin coagular. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo para la digestión enzimática de esos coágulos para evitar el remuestreo de médula ósea costoso y laborioso. La uroquinasa, un fármaco trombolítico clínicamente aprobado y fácilmente disponible, elimina los coágulos de la médula ósea casi por completo. Como consecuencia, los aspirados de médula ósea tratados producen un número similar de MSC que las muestras no coaguladas. Además, después del tratamiento con uroquinasa, las células mantuvieron su actividad metabólica y la capacidad de diferenciarse en linajes condrogénicos, osteogénicos y adipogénicos. Nuestro protocolo rescata muestras de sangre y médula ósea coaguladas sin afectar la calidad de las células. Esto deja obsoleto el remuestreo, reduce considerablemente los costos de muestreo y permite el uso de muestras coaguladas para investigación o terapia.
Introducción
Las células madre mesenquimales (MSCs) juegan un papel importante en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. Ellos pueden migrar, diferenciarse en diversos tipos de células 1 y injertarse, lo que les hace candidatos ideales para las terapias autólogas 2,3. Últimamente, los ensayos clínicos con MSC para la reparación de hueso y cartílago, se lanzaron enfermedad injerto contra huésped o enfermedad cardíaca 4. Estos MSCs se pueden cosechar a partir del tejido del cordón umbilical o tejido adiposo pero los resultados más prometedores se obtuvieron a partir de la médula ósea células madre derivadas 5.
La cresta ilíaca permite recoger una cantidad considerable de médula ósea y por lo tanto sirve como sitio principal de la aspiración 6. Sin embargo, la calidad del aspirado disminuye con el aumento de volumen de la médula ósea retirada. Mientras que los primeros 5 ml de aspirado de médula ósea contienen MSCs de alta calidad, la retirada de volúmenes más grandes conduce a la dilución de la sangre periférica con aspirado de fesde el hueso altamente vascularizado 7. Debido a los presentes megacariocitos y plaquetas, aspirado de médula ósea son propensos a la coagulación, a menos que se utilizan anticoagulantes. Pero incluso con anticoagulantes, se pueden producir coágulos.
En la médula ósea, MSCs representar sólo una pequeña proporción de la piscina total de células 8 y tienen que ser expandida en cultivo durante más de ingeniería de tejidos o aplicaciones terapéuticas 4. La calidad de una cultura de este tipo depende en gran medida de la piscina célula inicial, es decir., La diversidad y un alto número de partida 9. Los números bajos de las MSC de retiros pueden explicarse en parte por la variabilidad de los donantes. Por otro lado, las MSC de muestras de baja calidad requieren más tiempo en la cultura y pases extendido para alcanzar el número deseado de células. En cualquier caso, los pases extendida es una fuente de la senescencia celular y puede conducir a la pérdida de la diferenciación potencial 10. Por lo tanto, los protocolos que pueden maximizar celular y optimizadoield y prevenir los efectos perjudiciales tienen que desarrollarse 11,12.
Cuando empezamos a trabajar con las MSC caninos, nos quedamos asombrados al ver que alrededor de tres de cada cuatro muestras de médula ósea canina contenían coágulos, mientras que las muestras humanas afortunadamente coagulada (uno de cada diez) fueron menos frecuentes. Por otra parte no fue una sorpresa, que observamos rendimientos mucho más bajos de las MSC de muestras coaguladas. Para resolver el problema recurrente de muestras coaguladas, hemos desarrollado el protocolo mediante el uroquinasa fármaco trombolítico en lugar de remuestreo.
Terapias trombolíticos pueden contrarrestar situaciones que amenazan la vida tales como la oclusión de los vasos sanguíneos que causan ataques cardiacos, derrames cerebrales o embolias debido a la coagulación no deseada. Trabajan por la degradación de los coágulos a través de la escisión enzimática de la fibrina por la plasmina y de plasminógeno enzimática activadores. A pesar de la amplia utilización para el tratamiento de los pacientes, sólo existen muy pocas publicaciones que las actividades trombolíticos utilizadospara aplicaciones de laboratorio para rescatar muestras coaguladas, centrándose sobre todo en los linfocitos. En 1987, Niku et al. describe el uso de estreptoquinasa para disolver los coágulos de sangre que resulta en linfocitos funcionales 13 y cuatro años más tarde, De Vis et al. extendido el uso de estreptoquinasa para aislar las células leucémicas de la sangre y la médula ósea para aplicaciones de citometría de flujo 14. Una publicación más reciente sugiere el uso de alteplasa para el diagnóstico del cáncer 15. Mientras utiliza el mismo enfoque enzimática, nuestro protocolo se centra en el aislamiento de multipotentes MSC forma médula ósea para proporcionar una herramienta para los investigadores en el campo de las células madre.
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Protocolo
NOTA: aspirados de médula ósea humana de la cresta ilíaca se obtuvieron de consentir los donantes con la aprobación del comité de ética del cantón de Lucerna. Aspirados de médula ósea canina de la cresta ilíaca se recogieron con consent.Human del dueño del perro (aprox. 20 ml) y canina (aprox. 10 ml) aspirados de médula ósea eran anti-coagulado mediante la adición de 15 ml de 3,8% de citrato de sodio inmediatamente después de la retirada en el teatro de operaciones. Las muestras se transfirieron al medio ambiente de laboratorio para el procesamiento de la misma día como retirada.
1. Preparación de uroquinasa (Antes del 1 st Uso)
- Reconstituir la uroquinasa usando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante: Añadir 10 ml de PBS al matraz-septum de entrada utilizando una jeringa de 10 ml. Disolver la sustancia seca por agitación para obtener 50.000 unidades de inyección (U) por ml.
- Preparar alícuotas de 500 mu l (25.000 U) en cada stubos terile. Alícuotas Tienda -20 ° C y usarlo cuando sea necesario durante al menos 6 meses.
2. Preparativos Pasos (Antes de cada hueso Tratamiento Ósea)
- Descongelar una alícuota de la uroquinasa (25.000 U) por aspirado de médula ósea coagulada (volúmenes aspirado hasta 25 ml han sido tratados con éxito utilizando una única alícuota de 25.000 U).
- Precaliente un baño de agua o incubadora de agitación a 37 ° C.
3. digestión enzimática del Clot
- Realizar todo el trabajo en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar para evitar la contaminación microbiana de las muestras de médula ósea durante el procesamiento. Cuando se trabaja con material humano potencialmente infecciosos, se recomienda el uso de guantes de protección, así como un manejo cuidadoso.
- Colocación de un filtro 100 micras de células en la parte superior de un tubo de 50 ml estéril. Vierta cuidadosamente el aspirado de médula ósea a través del filtro de células, inclinando el colador o en movimiento alrededor del material de coágulo. Utilice una punta de pipeta estéril paramejor flujo a través de la malla del filtro.
NOTA: Evite cualquier dilución del coágulo, por ejemplo, lavando el coágulo con PBS. Urokinase actúa indirectamente y requiere componentes del suero (es decir., Plasminógeno) de la biopsia de efectivo resumen. Mientras continúa el procedimiento con el material de coágulo, el filtrado se puede mantener a temperatura ambiente hasta su uso posterior en el paso 3.6. - Transferir el material de coágulo de médula ósea en una placa de cultivo celular vacía utilizando pinzas estériles. Cortar los escombros en trozos pequeños de aproximadamente 2 mm 3 utilizando un bisturí estéril.
- Transferencia de las pequeñas piezas de coágulo en un tubo de reacción de 50 ml utilizando las pinzas estériles. Asegúrese de que el coágulo picada tiene una apariencia húmeda. Si parece estar seca, use algo del filtrado desde el paso 3.1 para humedecer.
- Se tritura el coágulo pipeteando arriba y hacia abajo para 5 veces usando una pipeta de 5 ml de microtitulación. Añadir 1 alícuota de uroquinasa a la muestra. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C, ya sea en un baño de agua o enun (suavemente) incubador con agitación.
- Se tritura pipeteando arriba y hacia abajo para 5 veces usando una pipeta de 5 ml. Realice este paso en un gabinete de bioseguridad. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. Después de la incubación, se tritura de nuevo 5 veces usando una pipeta de 5 ml. Pasad una fresca filtro celular 100 micras para poner en común con el filtrado del paso 3.2.
- Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en medios de comunicación como se describe a continuación o de acuerdo con el procedimiento estándar de su laboratorio para el cultivo de expansión MSC.
4. Siembra de Cultura de expansión de células y placas UFC
- Resuspender las células (que consta de eritrocitos y células mononucleares) en 50 ml de medio basal: Alpha-MEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2,5 mg / ml de anfotericina B . Contar las células 1:10 diluido en solución de azul de tripano usando un chambe Neubauerr.
- Placa de las células en matraces de cultivo celular en la densidad de 5 x 10 7 células / cm 2 y se incuban en un incubador humidificado a 37 ° C. Si está disponible, utilice hipóxicas (5% oxígeno). Para el control de ensayo CFU, placa 10 9 células en una placa de cultivo celular de 10 cm de diámetro.
- Después de 3 días de cultivo, las células madre mesenquimales están unidos a la placa de cultivo celular mientras que otras células permanecen en suspensión. Cambiar los medios de comunicación con medio basal suplementado con 5 ng / ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Para el control de ensayo CFU, tratar la placa de cultivo celular de igual manera.
- Continuar el cultivo de células para un total de 2 semanas, el intercambio de los medios de comunicación tres veces a la semana. Si las células superan el 80% de confluencia, dividido por tripsinización. Para el control de ensayo CFU, intercambiar los medios de comunicación del mismo modo, pero no dividir las células durante el transcurso de las dos semanas.
5. Giemsa para ensayo CFU
- Preparar 10 ml de solución de Giemsa-por plato: dilUTE La solución madre (7,6 g / l Giemsa en glicerol: metanol) 1:10 en agua estéril (siempre preparar una dilución de trabajo fresco).
- Retire el papel de la placa de cultivo celular y se lavan las células con PBS. Sea muy precavido al aplicar el líquido a la placa de Petri y evitar el lavado de las células.
- Fijar las células en metanol puro durante 5 min a RT. Deseche el metanol. Añadir la solución de Giemsa y se incuba durante 60 minutos en un incubador humidificado a 37 ° C.
- Lavar dos veces con PBS. Deje secar al aire la cabeza primera placa sobre una toalla de papel. Contar las colonias manualmente. Esto se logra mejor utilizando un rotulador en la parte posterior de la placa.
6. MSC Diferenciación
- MSC caninos diferenciación
NOTA: MSCs caninos se diferenciaron en condrogénica, osteogénica y linajes adipogénicas por estimulación con el sustrato adecuado durante cuatro semanas. - Para Diferenciación Adipogénico, MSC cultura en monocapa a 4 x 10 5 ceLLS / cm 2 alternando dos condiciones de cultivo diferentes como sigue;
- Cultivo en medios de mantenimiento adipogénesis que contiene DMEM + GlutaMAX, 3% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B y la insulina 170 mM.
- Cultura en la adipogénesis medios de inducir con medio de mantenimiento suplementado con 3% de FBS, 5% de suero de conejo, dexametasona 1 mM, 500 mM 3-isobutil-1-metilxantina, 33 mM biotina, 5 mM rosiglitazona y 17 mM pantotenato 16.
- Revel las gotas de lípidos mediante tinción con rojo aceite-O. En pocas palabras, fijar las células con formaldehído al 10%, lavar con PBS y manchar con 0,35% de aceite rojo O en isopropanol.
- Para el cultivo de la diferenciación osteogénica MSCs en monocapa a 7 x 10 3 células / cm 2 y estimular en el siguiente:
- Advanced DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B, 501; M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 10 mM ß-glicerofosfato y 100 nM de dexametasona.
- Identificar los depósitos de mineralización por tinción Von Kossa (5% AgNO3). Brevemente, fijar las células con 10% de formaldehído, se lava con PBS y se mancha con 5% AgNO 3 en agua destilada.
- Diferenciación condrogénica
- Cubos de corte (3 mm por lado) de un dispositivo médico en forma de esponja, constituidas a partir de liofilizado de colágeno de tipo I, y se utilizan como material de soporte para apoyar las células 17.
- MSCs semilla en la parte superior de los cubos a la concentración de 4 x 10 6 células / ml (~ 70.000 células / cubo).
- Antes de la adición de medios de comunicación, permiten que las células se adhieran a los cubos de 30 min.
- Mantener construcciones-MSC colágeno en medios condrogénica que consisten en DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 mg / ml de anfotericina B, 40 ng / ml de dexametasona, 50 g / ml ascórbico ácido 2-fosfato,50 mg / ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-selenio X, y 10 ng / ml factor de crecimiento transformante-β1.
- Utilice la tinción con azul Alcian para visualizar la acumulación de proteoglicanos en construcciones secciones. En pocas palabras, manchar las secciones O / N con 0,4% de azul alcián disuelto en 0,01% de H 2 SO 4 y 0,5 M hidrocloruro de guanidina. A continuación, lavar las secciones se lavaron durante 30 minutos en el 40% de DMSO y 0,05 M de MgCl2. Las células fueron counterstained con rojo nuclear.
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Resultados
Los hechos que el 74% de las muestras de médula ósea caninas (n = 54) contenía coágulos cuando llegaron a nuestro laboratorio (Figura 1 A) junto con la disminución de los rendimientos de MSC partir de estas muestras, nos hizo creer que un número considerable de las MSC estaba atrapado dentro de los coágulos . De hecho, un simple DAPI-mancha del material de coágulo seccionada confirma la presencia de células nucleadas en alta densidad (Figura 1B). Da lugar a un bajo número de MSC disponi...
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Discusión
Rutinariamente muestra de médula ósea, mientras que el paciente está sometido a cirugía (en nuestro caso la cirugía, principalmente la columna vertebral), con la ventaja de que sólo poco trabajo adicional tiene que ser llevada a cabo por el personal de la sala de operaciones. A pesar de que las muestras se mezclan con citrato de sodio inmediatamente después de la retirada, muchas muestras fueron parcialmente coagulada cuando llegaron en el laboratorio para su procesamiento. En esta etapa, el remuestreo para reemplazar m...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza Subvención CR3I3_140717/1 y la Fundación Suiza para Parapléjicos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| del medio basal | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| FGF-básico humano | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha con nucleósido, con glutamina estable | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS | Amimed | 2-01F36-I | |
| Anfotericina B | Applichem | A1907 | |
| medio adipogénico | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| Suero de conejo | Gibco | 16120099 | |
| Dexametasona | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma | I5879 | |
| Biotina | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazona | Sigma | R2408 | |
| Pantotenato | Sigma | P5155 | |
| Aceite Red-O | Sigma | O0625 | |
| Componentes del medio osteogénico Ácido | |||
| L-ascórbico 2-fosfato | Sigma | A8960 | |
| ß-glicerofosfato | Sigma | G9422 | |
| Nitrato de plata (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Componentes | |||
| Biopad - dispositivo médico en forma de esponja | Euroresearch | ||
| L-prolina | Sigma | P5607 | |
| Insulina-Transferrina-Selenio X | Gibco | 51500056 | |
| Factor de crecimiento transformador humano-β 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Azul Alcián 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear rojo rápido | Sigma | N8002 | |
| Genérico | |||
| Citrato trisódico dihidratado | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Uroquinasa | Medac | 1976826 | |
| 0,5% Tripsina-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Tinción de Giemsa | Liquem | A0885 | |
| Formaldehído | Liquem | A0877 | |
| Ácido sulfúrico (H2SO4) | Liquem | A0655 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Apliquem | A1584 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Apliquem | A3618 | |
| Clorhidrato de guanidina | Applichem | A1499 | |
| Consumibles | |||
| 50 ml tubo de reacción | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| Jeringa de 10 ml | Braun | 4606108V | |
| Aguja estéril (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1,7 ml Microtubos | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μ M filtro de células | Falcon | 6.05935 | |
| pinza estéril | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| bisturí estéril | Braun | 5518059 | |
| Primaria plato de curtura celular | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Mejorado | Bioswisstech | 505050 | |
| - Matraz T300 | TPP | 90301 | |
| Equipamiento | |||
| Cabina de bioseguridad microbiológica clase II | Skan | 82011500 | |
| baño de agua | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Pipeta serológica 5ml | Microscopio Corning | 4487-200ea | |
| Olympus | CKX41 | ||
| incubadora humidificada Heracells 240 | Thermo 51026331 | ||
| científico Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
