Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como<em&gt; In Vitro</em&gt; La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica

Resumen

La lesión por isquemia-reperfusión (IR) se asocia con una alta tasa de morbilidad y mortalidad. El objetivo del modelo in vitro de privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa (OGD-R) descrito aquí es evaluar los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión en una variedad de células, particularmente en las células endoteliales de la barrera hematoencefálica (BBB).

Resumen

La isquemia-reperfusión (IR) lesión se sabe que contribuyen significativamente a la morbilidad y la mortalidad asociadas con accidentes cerebrovasculares isquémicos. Accidentes cerebrovasculares isquémicos representan el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares. Una causa común de lesión IR es el rápido flujo de entrada de fluidos después de una oclusión crónica / aguda de sangre, nutrientes, oxígeno al tejido desencadenar la formación de radicales libres.

El ictus isquémico es seguido por la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y la disfunción edema cerebral vasogénico. Estructuralmente, las uniones estrechas (TJS) entre las células endoteliales juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB). IR lesión es una lesión secundaria temprana que conduce a una respuesta no específica, inflamatoria. Oxidativo y estrés metabólico después de la inflamación desencadena el daño cerebral secundario que incluye la acreditación de la permeabilidad y la interrupción de uniones estrechas (TJ) integridad.

Nuestro protocolo presenta in vitro </ Em> ejemplo de la privación de oxígeno y glucosa reoxigenación (OGD-R) en las células endoteliales de cerebro de rata integridad TJ y la formación de fibras de estrés. Actualmente, varios experimental en modelos in vivo se utilizan para estudiar los efectos de la lesión IR; sin embargo, tienen varias limitaciones, como los desafíos técnicos en la realización de cirugías, gen influencias moleculares dependientes y dificultad en el estudio de las relaciones mecanicistas. Sin embargo, los modelos in vitro puede ayudar a superar muchas de esas limitaciones. El protocolo presentado puede ser usado para estudiar los diversos mecanismos moleculares y relaciones mecanicistas para proporcionar estrategias terapéuticas potenciales. Sin embargo, los resultados de los estudios in vitro pueden diferir de serie en estudios in vivo y deben ser interpretados con cautela.

Introducción

-Isquemia-reperfusión (IR) lesión se encuentra que es la causa frecuente de diversas complicaciones debilitantes y muertes asociadas con el accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, trauma, enfermedad vascular periférica y lesión cerebral traumática ^1,2. IR lesión en los vasos cerebrales es una lesión secundaria temprana conduce a la inflamación y el edema ^3. Una de las complicaciones graves que se produce como resultado de estrés oxidativo y metabólica después de la inflamación es la pérdida de equilibrio homeostático conduce a la formación de radicales libres, alteraciones en la barrera hematoencefálica (BBB) ​​uniones estrechas (TJs) y....

Protocolo

1. Siembra de las células endoteliales

1. Obtener cultivos primarios de RBMEC de de ratas Sprague Dawley adultas (u obtener comercialmente).
2. Cultivar RBMECs en 100 cm fibronectina (50 mg / ml) placas de Petri recubiertas utilizando el medio de crecimiento de células endoteliales de cerebro de rata. Cambiar el medio cada dos días, hasta que se alcanza la confluencia.
3. Al llegar a 80-90% de confluencia, lavar suavemente las células en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por agitación. Las células se separaron entonces al exponerlos a 1 ml de solución caliente 0,25% tripsina ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), equilibrada a....

Resultados

Las células cultivadas en portaobjetos prerrevestidas fibronectina cámara Nunc II fueron sometidos a OGD-R mediante la colocación en un modelo de cámara de 110 Biospherix ProOx. Después de someter las células a OGD-R, que se procesaron para ZO-1 tinción de unión utilizando la técnica de inmunofluorescencia como se muestra en la Figura 2 y el conjunto de citoesqueleto que indica la formación de fibras de estrés de actina F usando etiqueta mancha faloidina rodamina como se muestra en la Figura 3.<.......

Discusión

OGD-R como un modelo in vitro para la lesión por isquemia-reperfusión ha sido bien establecido para el estudio de las neuronas ^10,11. También hay estudios que muestran el efecto de la OGD en las células endoteliales cerebrales y alteraciones en la permeabilidad y TJ integridad ^9. Sin embargo, nuestro estudio muestra el efecto de OGD, así como la reoxigenación, que es una representación más cercana de la lesión por reperfusión isquémica en condiciones in vivo que se producen despué.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Proox modelo 110	Biospherix	modelo 110
DMEM, sin glucosa	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Anticuerpo policlonal de conejo	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8  bien estéril, de vidrio  diapositivas	Thermo scientific	177402
anticuerpo secundario anti-conejo marcado con FITC	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Se puede utilizar cualquier otro PBS disponible