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Artículo de método

Dispositivos basados ​​en papel para aislamiento y caracterización de extracelular vesículas

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DOI:

10.3791/52722

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3 de abril de 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla un método para aislar vesículas extracelulares (SVE), pequeñas partículas membranosas liberadas de las células, a partir de tan poco como 10 muestras de suero l. Este enfoque evita la necesidad de ultracentrifugación, requiere sólo unos pocos minutos de tiempo de ensayo, y permite el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de muestras de volúmenes limitados.

Resumen

Vesículas extracelulares (EVs), partículas membranosas liberados de varios tipos de células, tienen un gran potencial para aplicaciones clínicas. Contienen ácido nucleico y proteínas de carga y se reconoce cada vez más como un medio de comunicación intercelular utilizado tanto por eucariota y células procariotas. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, los protocolos actuales para el aislamiento de los vehículos eléctricos son a menudo consume mucho tiempo, engorroso, y requieren grandes volúmenes de muestras y equipos caros, tales como una ultracentrífuga. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado una plataforma de inmunoafinidad en papel para separar subgrupos de vehículos eléctricos que es fácil, eficiente y requiere volúmenes de muestra tan bajas como 10 l. Las muestras biológicas pueden ser pipetearon directamente sobre zonas de ensayo de papel que han sido modificados químicamente con moléculas de captura que tienen alta afinidad a los marcadores específicos de la superficie EV. Immunosorben ligado a enzimas Validamos el ensayo mediante el uso de microscopía electrónica de barrido (SEM), en papelensayos t (P-ELISA), y el análisis del transcriptoma. Estos dispositivos basados ​​en papel permitirán el estudio de los vehículos eléctricos en la clínica y el marco de la investigación para ayudar a avanzar nuestra comprensión de las funciones de EV en la salud y la enfermedad.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EVs) son partículas membranosas heterogéneas que varían en tamaño desde 40 nm hasta 5.000 nm y son liberadas activamente por muchos tipos de células a través de diferentes rutas de biogénesis1-9. Contienen subconjuntos únicos y seleccionados de ADN, ARN, proteínas y marcadores de superficie de las células parentales. Su participación en una variedad de procesos celulares, como la comunicación intercelular10, la modulación de la inmunidad11, la angiogénesis12, la metástasis12, la quimiorresistencia13 y el desarrollo de enfermedades oculares9, es cada vez más reconocida y ha estimulado un gran interés en su utilidad en aplicaciones diagnósticas, pronósticas, terapéuticas y de biología básica.

EVs se pueden clasificar clásicamente como exosomas, microvesículas, cuerpos apoptóticos, oncosomas, ectosomas, micropartículas, telerosomas, prostatosomas, cardiosomas y vexosomas, etc., en función de su biogénesis u origen celular. Por ejemplo, los exosomas se forman en cuerpos multivesiculares, mientras que las microvesículas se generan por gemación directamente de la membrana plasmática y las vesículas apoptóticas son de células apoptóticas o necróticas. Sin embargo, la nomenclatura aún está poco refinada, en parte debido a la falta de comprensión y caracterización exhaustivas de los vehículos eléctricos. Se han desarrollado varios métodos para purificar los vehículos eléctricos, incluida la ultracentrifugación14, la ultrafiltración15, las perlas magnéticas16, la precipitación polimérica17-19 y las técnicas microfluídicas20-22. El procedimiento más común para purificar los VE implica una serie de centrifugaciones y/o filtración para eliminar desechos grandes y otros contaminantes celulares, seguidas de una ultracentrifugación final de alta velocidad, un proceso costoso, tedioso e inespecífico14,23,24. Desafortunadamente, aún no se satisface la necesidad tecnológica de un aislamiento rápido y confiable de los vehículos eléctricos con una pureza y eficiencia satisfactorias.

Hemos desarrollado un dispositivo de inmunoafinidad basado en papel que proporciona una forma sencilla, que ahorra tiempo y costes, pero es eficiente, de aislar y caracterizar subgrupos de EVs22. El papel de celulosa cortado en una forma definida se puede disponer y laminar con dos láminas de plástico con orificios pasantes registrados. En contraste con la estrategia general de definir el límite del fluido en los dispositivos basados en papel mediante la impresión de cera hidrofóbica o polímeros25-27, estos patrones de papel laminado son resistentes a muchos líquidos orgánicos, incluido el etanol. Las zonas de prueba de papel se modifican químicamente para proporcionar una cobertura estable y densa de las moléculas de captura (por ejemplo, anticuerpos específicos de la diana) que tienen una alta afinidad con marcadores de superficie específicos en los subgrupos de EV. Las muestras biológicas se pueden pipetear directamente en las zonas de prueba de papel, y los VE purificados se conservan después de los pasos de enjuague. La caracterización de las VE aisladas se puede realizar mediante SEM, ELISA y análisis transcriptómico.

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Protocolo

Un esquema general del procedimiento de operación se presenta en la Figura 1. El uso de prácticas éticas, se recogieron muestras de sangre de sujetos sanos, y se obtuvieron muestras de humor acuoso de los pacientes a través del Hospital General de Veteranos Taichung (TCVGH), Taichung, Taiwán bajo IRB aprobó protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. La fabricación de dispositivos de papel

  1. Cortar papel de cromatografía en círculos de 5 mm de diámetro para proporcionar el mismo diseño que una placa de microtitulación de 96 pocillos. Sandwich estas piezas de papel con dos láminas de poliestireno con domicilio orificios pasantes y laminado.
  2. Modificar los dispositivos de papel utilizando el método de conjugación química se describe en los pasos 28 de la siguiente.
    1. Tratar dispositivos de papel con plasma de oxígeno (100 mW, 1% de oxígeno, 30 sec) en una cámara de plasma.
      PRECAUCIÓN: Se debe tener especial cuidado cuando se trabaja con trimetoxisilano 3-mercaptopropil y N--γ maleimidobutiriloxi succinimidaéster (GMBS), ya que ambos son sensibles a la humedad y tóxico. Use guantes de protección y evitar la inhalación o el contacto con la piel y los ojos. Mantenga la botella stock bien cerrado y deje que se equilibre a temperatura ambiente antes de abrir para evitar la condensación de agua. Alternativamente, abra la botella stock dentro de una bolsa de guantes llena de nitrógeno o caja. Alícuota en pequeños frascos para evitar la apertura frecuente de la botella stock.
    2. Inmediatamente incubado tratada dispositivos de papel en un (v / v) solución al 4% de 3-mercaptopropil trimetoxisilano en etanol (200 prueba) durante 30 min.
    3. Enjuague dispositivos de papel con etanol y se incuba con GMBS / ml 0.01 mu mol en etanol durante 15 min.
    4. Enjuague con etanol (200 prueba) e incubar dispositivos de papel con 10 mg / ml solución de avidina en tampón fosfato salino (PBS) durante 1 hora a 4 ° C. Almacenar a 4 ° C si es necesario, y utilizar un plazo de 4 semanas.
  3. Mojar cada zonas de ensayo de papel con 10 l de PBS que contiene 1% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) Durante 3 x 10 min antes de la detección de 10 l biotinilados moléculas de captura para 3 × 10 min. Utilizar Anti-CD63 anticuerpo (20 g / ml en PBS que contenía 1% (w / v) de BSA y 0,09% (w / v) de azida de sodio) o anexina V (01:20, v / v en tampón de unión de anexina V) como moléculas de captura.
  4. Enjuague anticuerpo o anexina V moléculas anti-CD63 no unidas utilizando 10 l correspondiente PBS que contenía 1% (w / v) BSA o anexina V vinculante soluciones tampón durante 3 x 1 min, respectivamente.

2. El suero y el humor acuoso Recolección y Procesamiento

  1. Recogida de suero.
    1. Recoger 10 ml de sangre periférica por punción venosa en tubos de separación de suero y de invertir suavemente el tubo de cinco veces. Ajuste el tubo en posición vertical y esperar 30 min.
    2. Centrifugar a 1200 × g durante 15 min. Transferir el suero de la capa superior a un tubo limpio, y se centrifuga de nuevo a 3000 × g durante 30 min.
    3. Pasar el sobrenadante a través de un fil 0,8 micraster. Mantenga la muestra a -80 ° C hasta su uso.
  2. Acuosa colección humor: recoger muestras del humor acuoso de pacientes diagnosticados por un oftalmólogo directamente a través de procedimientos y almacenar muestras invasiva a -80 ° C hasta su uso.

3. Aislamiento de vesículas extracelular

  1. Las muestras puntuales en cada zona de prueba de papel a una velocidad de 5 l / min.
  2. Enjuague EVs no unidos con 10 l correspondientes PBS que contiene 1% (w / v) BSA o anexina V vinculante soluciones tampón durante 3 x 1 min para los dispositivos de papel funcionalizados con anti-CD63 de anticuerpos o moléculas de anexina V, respectivamente. Lleve a cabo los siguientes ensayos posteriores.

4. Downstream Ensayo Ejemplo 1: Electromicrographs de exploración

  1. Fijar EVs capturados en funcionalizado zona de prueba de papel utilizando 10 l 0,5 × fijador de Karnovsky durante 10 min.
  2. Enjuague las muestras con amplia PBS durante 2 × 5 min.
  3. Deshidratar elmuestras con etanol posterior 35% durante 10 min, etanol al 50% durante 2 x 10 min, etanol al 70% durante 2 x 10 min, etanol al 95% durante 2 x 10 min, y etanol 100% para 4 × 10 min.
  4. Crítico seco y pulverización catódica recubrir las muestras con paladio / oro, y examinar utilizando un microscopio electrónico de barrido operado a baja tensión de aceleración de electrones (~ 5 kV).

5. Aguas abajo el Ejemplo de Ensayo 2: ELISA basado en Papel

  1. Añadir una solución de 5 l que contiene anti-CD9 anticuerpo primario a 1: 1.000 dilución en PBS a cada zona de ensayo que contiene EVs capturados. Espere 1 min.
  2. Enjuagar las muestras con 30 ml de PBS agitó a 100 rpm durante 30 seg.
  3. Añadir a 5 l solución que contiene peroxidasa de rábano (HRP) -vinculada anticuerpo secundario a 1: 1000 dilución en PBS y esperar 1 min.
  4. Enjuagar las muestras con 30 ml de PBS agitó a 100 rpm durante 30 seg.
  5. Añadir un sustrato colorimétrico 5 l que contiene 1: 1 relación de volumen de peróxido de hidrógeno unad 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) y escanear con un escáner de escritorio.

6. Ejemplo Ensayo de Downstream 3: Aislamiento de ARN

  1. Sumergir las muestras en 35 l de ayuda ARN aislamiento a base de polivinilpirrolidona y 265 l de lisis / tampón de unión para la lisis de los vehículos eléctricos capturados. Vortex vigorosamente.
  2. Añadir 30 l de homogeneizado proporcionado en el kit de aislamiento al lisado. Vortex vigorosamente y se puso en hielo durante 10 min.
  3. Extraer el ARN usando ácido separación de fenol-cloroformo descrito en los pasos siguientes.
    1. Tomar 330 l de fenol-cloroformo de la capa de fondo de la botella y añadir a la homogenado / lisado. Vortex vigorosamente.
    2. Centrifugar a 10.000 xg durante 5 min. Pasar la fase acuosa (superior) a un tubo limpio y tenga en cuenta el volumen extraído.
  4. Precipitar el ARN total con etanol al 100% del volumen que es 1,25 veces el volumen de la fase acuosa eliminado en el paso anterior y collect el ARN en la solución de elución precalentado a 95 ° C.
  5. Concentrar y purificar aún más el ARN usando un kit de ARN de limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.

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Resultados

La capacidad del dispositivo de papel para aislar subgrupos de los vehículos eléctricos se basa de manera eficiente a partir de su reconocimiento sensible y específica de los marcadores de superficie EV. La modificación estable de fibras de papel con moléculas de captura se logra mediante el uso de la química de avidina-biotina como se describe en otra parte 28-30. La eficacia de la conjugación química y la del método de fisisorción se evalúa utilizando lecturas basadas en fluorescencia. Las zonas de ensayo d...

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Discusión

Los pasos más críticos para el éxito en el aislamiento de los subgrupos de vesículas extracelulares son: 1) una buena opción de papel; 2) la cobertura estable y alto de moléculas de captura en la superficie de las fibras de papel; 3) el manejo adecuado de las muestras; y 4) las prácticas de higiene general de laboratorio.

Los materiales porosos se han utilizado en muchos ensayos baratas y equipo libre. Pueden tener el tamaño de poro sintonizable, funcionalidad versátil, de bajo coste y alta ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Esta obra fue financiada en parte por el Consejo de Seguridad Nacional 99-2320-B-007-005-MY2 el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán grants- (CC) y NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), y el General de Veteranos Hospitales y Sistema Universitario del Programa Común de Investigación de Taiwán (CC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Papel de cromatografíaGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Papel de celulosa de grado 1
(3-Mercaptopropyl) trimetoxisilanoSigma Aldrich175617Este producto químico reacciona con el agua y la humedad y debe aplicarse dentro de una bolsa de guantes llena de nitrógeno. Evite el contacto con los ojos y la piel. No respire humos ni inhale vapores.
EtanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, grado de biología molecular
Albúmina sérica bovina (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001A menudo denominada fracción V de Cohn.
N-γ-maleimidobutiriloxy éster de sucinimida (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS es un reticulante de amina a sulfhidrilo. GMBS es sensible a la humedad.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin tiene 4 sitios de unión para la biotina y su valor pI es 6.3, que es más neutro que la avidina nativa
Ratón biotinilado anti-humano anti-CD63Ancell215-030AHN16.1/46-4-5
anexina V biotiniladaBiosciences556418 Annxin V tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina (PS)
Primario anti-CD9 y secundario anticuerpoSystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1El anticuerpo secundario es tubos de separación de suero conjugados con peróxido de rábano picante
BD Biosciences367991Activador de coágulos y gel para la separación de suero
Tampón de unión a anexina VBD Biosciences556454 10x; diluir a 1x antes de usar.
Set de reactivos de sustrato TMBBD Biosciences555214El set contiene peróxido de hidrógeno y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)
[header]kit de
aislamiento de ARNLife TechnologiesAM1560MirVana Kit de aislamiento de ARN
basado en polivinilpirrolidona LifeTechnologiesAM9690El coadyuvante de aislamiento de ARN vegetal contiene polivinilpirrolidona (PVP) que se une a los polisacáridos.
kit de limpieza de ARNQiagen Inc.Elkit de limpieza de ARN MinElute 74004 está diseñado para la purificación de hasta 45  μ g ARN.
Cámara de plasmaMarch InstrumentsPX-250
Microscopio electrónico de barridoHitachi Ltd.S-4300
Escáner de sobremesaHewlett-Packard CompanyPhotosmart B110Se capturaron imágenes en color de 8 bits. También se pueden utilizar cámaras y teléfonos inteligentes.
Sistema de registro de imágenesJ& SeGeneSys G:BOX Chemi-XX8. También se pueden utilizar microscopios de fluroscencia.
clon de BD capturaron imágenes de fluroscencia de 16 bits de H Technology Co

Referencias

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