Dispositivos basados ​​en papel para aislamiento y caracterización de extracelular vesículas

Summary

Este protocolo detalla un método para aislar vesículas extracelulares (SVE), pequeñas partículas membranosas liberadas de las células, a partir de tan poco como 10 muestras de suero l. Este enfoque evita la necesidad de ultracentrifugación, requiere sólo unos pocos minutos de tiempo de ensayo, y permite el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de muestras de volúmenes limitados.

Abstract

Vesículas extracelulares (EVs), partículas membranosas liberados de varios tipos de células, tienen un gran potencial para aplicaciones clínicas. Contienen ácido nucleico y proteínas de carga y se reconoce cada vez más como un medio de comunicación intercelular utilizado tanto por eucariota y células procariotas. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, los protocolos actuales para el aislamiento de los vehículos eléctricos son a menudo consume mucho tiempo, engorroso, y requieren grandes volúmenes de muestras y equipos caros, tales como una ultracentrífuga. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado una plataforma de inmunoafinidad en papel para separar subgrupos de vehículos eléctricos que es fácil, eficiente y requiere volúmenes de muestra tan bajas como 10 l. Las muestras biológicas pueden ser pipetearon directamente sobre zonas de ensayo de papel que han sido modificados químicamente con moléculas de captura que tienen alta afinidad a los marcadores específicos de la superficie EV. Immunosorben ligado a enzimas Validamos el ensayo mediante el uso de microscopía electrónica de barrido (SEM), en papelensayos t (P-ELISA), y el análisis del transcriptoma. Estos dispositivos basados ​​en papel permitirán el estudio de los vehículos eléctricos en la clínica y el marco de la investigación para ayudar a avanzar nuestra comprensión de las funciones de EV en la salud y la enfermedad.

Introduction

Las vesículas extracelulares (EVs) son partículas membranosas heterogéneas que varían en tamaño desde 40 nm hasta 5.000 nm y son liberadas activamente por muchos tipos de células a través de diferentes rutas de biogénesis^1-9. Contienen subconjuntos únicos y seleccionados de ADN, ARN, proteínas y marcadores de superficie de las células parentales. Su participación en una variedad de procesos celulares, como la comunicación intercelular¹⁰, la modulación de la inmunidad¹¹, la angiogénesis¹², la metástasis¹², la quimiorresistencia¹³ y el desarrollo de enfermedades oculares⁹, es cada vez más recon....

Protocol

Un esquema general del procedimiento de operación se presenta en la Figura 1. El uso de prácticas éticas, se recogieron muestras de sangre de sujetos sanos, y se obtuvieron muestras de humor acuoso de los pacientes a través del Hospital General de Veteranos Taichung (TCVGH), Taichung, Taiwán bajo IRB aprobó protocolos ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. La fabricación de dispositivos de papel

1. Cortar papel de cromatografía en círculos de 5 mm de diámetro para proporcionar el mismo diseño que una placa de microtitulación de 96 pocillos. Sandwich estas piezas de papel con dos láminas de poliestireno con domicilio orificios pasantes y lamin....

Results

La capacidad del dispositivo de papel para aislar subgrupos de los vehículos eléctricos se basa de manera eficiente a partir de su reconocimiento sensible y específica de los marcadores de superficie EV. La modificación estable de fibras de papel con moléculas de captura se logra mediante el uso de la química de avidina-biotina como se describe en otra parte ^28-30. La eficacia de la conjugación química y la del método de fisisorción se evalúa utilizando lecturas basadas en fluorescencia. Las zonas de ensayo d.......

Discussion

Los pasos más críticos para el éxito en el aislamiento de los subgrupos de vesículas extracelulares son: 1) una buena opción de papel; 2) la cobertura estable y alto de moléculas de captura en la superficie de las fibras de papel; 3) el manejo adecuado de las muestras; y 4) las prácticas de higiene general de laboratorio.

Los materiales porosos se han utilizado en muchos ensayos baratas y equipo libre. Pueden tener el tamaño de poro sintonizable, funcionalidad versátil, de bajo coste y alta .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Papel de cromatografía	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman® Papel de celulosa de grado 1
(3-Mercaptopropyl) trimetoxisilano	Sigma Aldrich	175617	Este producto químico reacciona con el agua y la humedad y debe aplicarse dentro de una bolsa de guantes llena de nitrógeno. Evite el contacto con los ojos y la piel. No respire humos ni inhale vapores.
Etanol	Fisher Scientific	BP2818	Absolute, 200 Proof, grado de biología molecular
Albúmina sérica bovina (BSA)	BioShop Canada Inc.	ALB001	A menudo denominada fracción V de Cohn.
N-γ-maleimidobutiriloxy éster de sucinimida (GMBS)	Pierce Biotechnology	22309	GMBS es un reticulante de amina a sulfhidrilo. GMBS es sensible a la humedad.
Avidin	Pierce Biotechnology	31000	NeutrAvidin tiene 4 sitios de unión para la biotina y su valor pI es 6.3, que es más neutro que la avidina nativa
Ratón biotinilado anti-humano anti-CD63	Ancell	215-030	AHN16.1/46-4-5
anexina V biotinilada	Biosciences		556418 Annxin V tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina (PS)
Primario anti-CD9 y secundario anticuerpo	System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	El anticuerpo secundario es tubos de separación de suero conjugados con peróxido de rábano picante
	BD Biosciences	367991	Activador de coágulos y gel para la separación de suero
Tampón de unión a anexina V	BD Biosciences		556454 10x; diluir a 1x antes de usar.
Set de reactivos de sustrato TMB	BD Biosciences	555214	El set contiene peróxido de hidrógeno y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)
[header]kit de
aislamiento de ARN	Life Technologies	AM1560	MirVana Kit de aislamiento de ARN
basado en polivinilpirrolidona Life	Technologies	AM9690	El coadyuvante de aislamiento de ARN vegetal contiene polivinilpirrolidona (PVP) que se une a los polisacáridos.
kit de limpieza de ARN	Qiagen Inc.	El	kit de limpieza de ARN MinElute 74004 está diseñado para la purificación de hasta 45  μ g ARN.
Cámara de plasma	March Instruments	PX-250
Microscopio electrónico de barrido	Hitachi Ltd.	S-4300
Escáner de sobremesa	Hewlett-Packard Company	Photosmart B110	Se capturaron imágenes en color de 8 bits. También se pueden utilizar cámaras y teléfonos inteligentes.
Sistema de registro de imágenes	J& Se	GeneSys G:BOX Chemi-XX8	. También se pueden utilizar microscopios de fluroscencia.