Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Resumen

Desarrollamos una preparación génica-quimérica del circuito ventral hipocampo-accumbens in vitro que permite obtener imágenes directas en vivo para analizar los mecanismos presinápticos de la transmisión sináptica mediada por los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparación también proporciona un enfoque informativo para estudiar los mecanismos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica.

Resumen

La mejora sostenida de la señalización axonal y el aumento de la liberación de neurotransmisores mediante la activación de los receptores nicotínicos de acetilcolina presinápticos (nAChRs) es un mecanismo importante para la neuromodulación por acetilcolina (ACh). La dificultad para acceder al sondeo de los mecanismos de señalización dentro de los axones intactos y en las terminales nerviosas, tanto in vitro como in vivo, ha limitado el progreso en el estudio de los componentes presinápticos de la plasticidad sináptica. Aquí presentamos una preparación génica-quimérica del circuito ventral del hipocampo (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro que permite obtener imágenes directas en vivo para analizar los componentes pre y postsinápticos de la transmisión, al tiempo que varía selectivamente el perfil genético de las neuronas pre y postsinápticas. Demostramos que las proyecciones de los microcortes de vHipp, como entrada axonal presináptica, forman múltiples sinapsis glutamatérgicas confiables con objetivos postsinápticos, las neuronas dispersas de nAcc. Se detecta la localización presináptica de varios subtipos de nAChRs y se monitoriza la transmisión sináptica mediada por señalización nicotínica presináptica mediante registro electrofisiológico concurrente e imágenes de células vivas. Esta preparación también proporciona un enfoque informativo para estudiar los mecanismos pre y postsinápticos de la plasticidad sináptica glutamatérgica in vitro.

Introducción

Modulación de la excitabilidad colinérgica circuito contribuye a aspectos fundamentales de la cognición, y alterado modulación colinérgica es una característica de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y la adicción ^1-4. Un mecanismo establecido de la facilitación de la transmisión sináptica colinérgica en el sistema nervioso central es a través de la activación directa de nAChR localizadas en los sitios pre-sinápticas. La activación de estos receptores presinápticos conduce a un aumento de Ca2 ⁺ intracelular ([Ca ^{2 +]} _i) en los terminales presinápticos - tanto de forma directa, debido a la relativamente alta conductancia de calcio de ciertos subtipos de nAChR, e indirectamente, a través de cascadas de señalización intracelular ^5, mejorando de este modo la liberación de neurotransmisores. De hecho, la activación de nAChR pre-sinápticos se ha relacionado con los cambios en la liberación de una amplia variedad de neurotransmisores incluyendo glutamato, GABA, ACh, unand dopamina ^6-10. Aunque este proceso se ha estudiado indirectamente usando métodos electrofisiológicos en varias sinapsis, los reporteros ópticas de [Ca2 ^+] _i y el reciclado de vesículas sinápticas permiten una medición más directa y temporalmente precisa de los fenómenos pre-sinápticos.

Localización presináptica de nAChR se ha demostrado de forma convincente con el etiquetado inmuno-oro directa de nAChR en el microscopio electrónico (EM) nivel de ^11,12. Varias otras técnicas también se han utilizado para tratar la localización nAChR indirectamente, incluyendo la detección de lugares de nAChRs subunit- quimeras de proteínas fluorescentes en neuronas cultivadas ^13,14, registro electrofisiológico de las corrientes de nAChR en las terminales sinápticas ^15,16, seguimiento de los cambios inducidos por la nicotina en [Ca ^{2 +]} _i en las terminales nerviosas sinápticas de imágenes en vivo de células ^17, y la supervisión indirecta de la liberación de neurotransmisores en la terminal sináptica portécnicas de imagen de células vivas con indicadores fluorescentes, incluyendo exocitosis de vesículas sinápticas vistos por estirilo tintes anfipáticas FM (FM1-43 y FM4-64) y / o synapto-pHluorin y por los reporteros fluorescentes neurotransmisores específicos, como CNiFERs de ACh y iGluSnFr para el glutamato ^18-20. En general, estos enfoques actuales para la identificación de la localización presináptica de nAChR son complicados y requieren sistemas y técnicas especiales para permitir la identificación fiable y monitorización fisiológica de la actividad presináptica.

Aquí se describen los protocolos y equipos para un sistema de co-cultivo in vitro de un hipocampo ventral (vHipp) - núcleo accumbens (NACC) de circuito que proporciona acceso directo a identificar y analizar los dos componentes pre y post-sinápticos de la transmisión sináptica. Mostramos ejemplos de localización presináptica de nAChR y la imagen de células vivas de nAChR mediada por Ca ^{2 +} de señalización y la liberación de neurotransmisores aloaxones ng vHipp. Una extensión natural (y sencillo) del protocolo que se presenta aquí es la preparación de los contactos pre y post-sináptica compuestos por neuronas de diferentes genotipos. De esta manera la contribución de un producto génico particular, a la pre y / o post-sinápticas mecanismos de modulación se puede evaluar directamente.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publicaciones Nº 80-23, revisado 2012) y los estudios fueron aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el uso de los Comités de Investigación en Stony Brook University (# 1618 y # 1792).

1. vHipp-NACC sinápticas Co-culturas

1. Ratones Sacrificio (día postnatal 0-3, de tipo salvaje (WT) o nAChR α7 línea de ratón transgénico) con CO _2. Decapitar a cada cachorro y guardar la cola en un tubo de 1,5 ml de centrífuga para el genotipado post facto. Realice los siguientes pasos en una campana esterilizada.
2. Retire la parte superior del cráneo con tijeras y pinzas para exponer todo el cerebro. A partir de la coyuntura en la que las cortezas cerebrales parte el uno del otro en sentido caudal, obtienen una sección coronal que contiene las cortezas posteriores incluyendo el vHipp ^5,21 con un microscopio de disección.
3. Diseccionar vTiras de tejido Hipp contienen la región CA1-subiculum a cabo de acuerdo con un desarrollo de atlas de cerebro de ratón ²² (Figura 1A). Transferir a una placa de cultivo de 35 mm que contiene medio de cultivo frío (4 ° C), cortado en pequeñas rodajas finas (alrededor de 100 micras x 100 micras microslices).
4. Pre-incubar 12 mm poli-D-lisina / laminina cubreobjetos de vidrio recubiertos dentro de 24 placas de cultivo de tejido bien con medios de cultivo (~ 500 l) durante al menos 30 min en la incubadora a 37 ° C. Retire los medios de comunicación antes de chapado microslices.
5. Placa con una pipeta Pasteur pulida al fuego en el centro del cubreobjetos con cantidad mínima de medios de comunicación (~ 50 l, que contiene ~ 20 piezas de microslices) para facilitar la unión de los explantes. Placa microslices vHipp procedentes de un solo animal (ya sea el + / + o el - / - genotipo de la línea transgénica α7) en cada cubreobjetos.
6. Después de los explantes se asientan en el cubreobjetos, añadir con cuidado los medios de comunicación adicional (~ 100 l) por The pared de manera que el nivel de los medios de comunicación es lo suficientemente alto para cubrir completamente los explantes en la periferia, pero no los que están en el centro del cubreobjetos.
7. Después de un / N incubación O en 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora, dispersar neuronas NACC de días embrionarios 18 de postnatal día 1 ratones WT y añadir a los explantes.
   1. Diseccionar tejidos NACC de acuerdo con un desarrollo de atlas de cerebro de ratón ²⁰ (Figura 1B).
   2. Cortar en trozos pequeños (alrededor de 500 m × 500 m microslices) y transferir a un tubo de 15 ml.
   3. Tratar con tripsina al 0,25% (2 ml) durante 15 min a 37 ° C. Wash trozos de tejido tres veces con medios de lavado en frío (5 ml, 4 ° C) seguido de un lavado en medio de cultivo frío (5 ml, 4 ° C). Deje reposar la suspensión durante 5 minutos en cada etapa de lavado, y luego verter el sobrenadante con cuidado.
   4. Disociar las células por trituración suave en 2 ml de medio de cultivo con una pipeta Pasteur pulida al fuego ligeramente.
   5. Transfer suspensión celular a otro tubo de 15 ml y centrifugar a 2000 x rpm durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en medios de cultivo en 1 ml por 6 cachorros. Dispersar las células pipeteando suavemente en medios varias veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego.
   6. Añadir 0,25 ml de células NACC dispersas a cada cubreobjetos con explantes vHipp.
   7. Mantener las culturas en un humidificado 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora. Coloque las placas de cultivo en gasas estériles humedecidas para estabilizar mecánicamente y mantener la humedad, lo que facilita la formación de sinapsis.

2. La inmunocitoquímica

1. Fijar culturas (5-7 días in vitro) en paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa / PBS (~ 500 l por cubreobjetos, 20 min, RT).
2. Culturas permeabilizar con 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 l por cubreobjetos, 5 min, RT).
3. Culturas bloque con 10% de suero normal de burro en PBS (~ 500 l por cubreobjetos, 30 min, RT) antes de la antibodtinción y. Incubar con anticuerpos primarios O / N a 4 ° C. Usa los siguientes anticuerpos primarios: anti-nAChR (α ₄ -ECD 1: 500; anti-α ₅ subunidades, 1: 500), anti-transportador vesicular de glutamato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
4. Lavar anticuerpos primarios a cabo con PBS (3 veces / ~ 500 l por cubreobjetos, 5 min) y luego incubar culturas en anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 (~ 500 l por cubreobjetos, 1: 500) o Alexa 594 (~ 500 l por cubreobjetos , 1: 500) durante 1 hora a 37 ° C.
5. Incubar culturas en αBgTx conjugados con Alexa 594 (~ 500 l por cubreobjetos, 1: 1000 en medios de cultivo) durante 45 min a 37 ° C antes de la fijación para el etiquetado α7 superficie * nAChR.
6. Montaje y sello cubreobjetos.
7. Captura de imágenes con un microscopio de fluorescencia equipado con los objetivos del Plan-apocromáticos (20X con 0,8 NA o 63X aceite con 1,4 NA) y una cámara CCD.

3. FM1-43 Based vesicular Fusión

1. Mantener culturas (5-7 días in vitro) en una cámara de imágenes, montar la cámara en el hilado disco microscopio confocal. Continuamente perfundir (1 ml / min) con cóctel de HBS a temperatura ambiente.
2. Detener culturas de perfusión y de carga con 10 M FM1-43 en 56 mM K ⁺ ACSF (~ 500 l) durante 90 segundos (tinción), lavar colorante externo de distancia durante 15 minutos con Ca ²⁺ HBS que contenía ADVASEP-7 (0,1 mM) para secuestrar FM1-43 unida a la membrana.
3. Estimular las culturas con 56 mM de K ⁺ ACSF (~ 500 l) sin FM1-43 durante 120 segundos (decoloración), vuelva a cargar las culturas con FM1-43 utilizando las mismas condiciones, y lavar de nuevo con Ca ²⁺ HBS que contenía ADVASEP-7 para 15 min.
4. Adquirir FM1-43 imágenes de fluorescencia con disco giratorio microscopio confocal equipado con un objetivo Plan-Apochromat (60X agua con 1,4 NA, de excitación 488 nm, emisión 530 nm) y capturar imágenes con una cámara CCD.
5. Recoge imágenes de fluorescencia FM1-43 basales (cada 2 s durante 1 min) Como control pre-nicotina; aplicar la nicotina (1 mM) por perfusión rápida (2 ml / min) durante 1 min, y luego lavar la nicotina a cabo con el coctel HBS. Mantenga imágenes con lapso de tiempo de captura antes, durante y después de la aplicación de nicotina cada 2 s durante 5 min.
6. Cuantificar la intensidad de fluorescencia antes de FM1-43 _(tinción F) y después (F _destaining) aplicación de nicotina en cada botón sináptico.
7. Calcular la cantidad total de liberables fluorescencia FM1-43 largo de los axones vHipp cuantificando la diferencia de intensidad de fluorescencia FM1-43 antes y después de la aplicación de la nicotina (Df = _tinción F -F _{decoloración).} Analizar fracción de disminución de intensidad de fluorescencia después de la nicotina con la siguiente ecuación: F =% _{de disminución} Delta F / F _{de tinción.}

Imagen 4. Calcio

1. Enjuague culturas (5-7 días in vitro) rápidamente con HBS normal, entonces cargar las culturas con 5 M Fluo-4 Ca ²⁺ indicador (AM éster) y 0,02% de Pluronic F-127 en HBS (2 ml) durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO _2.
2. Lave Fluo-4 solución con HBS (3 veces / 5 min). Culturas Regreso a la incubadora (37 ° C / 5% de CO ₂₎ por lo menos durante 30 minutos.
3. Mantener culturas en la misma cámara de imágenes y las mismas condiciones que se describen en la sección FM1-43 fusión vesicular en base (consulte el paso 3.1).
4. Recoge imágenes Fluo-4 de fluorescencia de proyecciones axonales de las vHipp micro-rebanadas con un objetivo Plan-Apochromat (60X agua con 1,4 NA, de excitación 488 nm, emisión 530 nm) y una cámara CCD.
5. Suma de línea de base Fluo-4 imágenes de fluorescencia (cada 10 seg durante 2 min) como control pre-nicotina, aplicar la nicotina (1 mM) por perfusión rápida (2 ml / min) durante 1 min, y luego lavar la nicotina a cabo con cóctel de HBS. Mantenga imágenes con lapso de tiempo de captura antes, durante y después de la aplicación de nicotina cada 10 segundos durante 30 minutos.
6. Guarde todos los marcos de las fluo-4 imágenes de fluorescencia primas, la exportación como una serie deImágenes en formato TIFF para su posterior análisis.
7. Recoge la intensidad integrada de fluo-4 de fluorescencia a lo largo de los axones vHipp antes y después de la aplicación de la nicotina.
8. Normalizar la intensidad de fluorescencia integrada con la siguiente ecuación: Delta F / F = _{0 (0} FF) / F _0, donde F ₀ es el pre-nicotina intensidad de fondo con corrección de fluorescencia integrado y F es la intensidad de fluorescencia integrada a lo largo de los axones vHipp en cada punto temporal después de la aplicación de nicotina. Analizar y trazar la intensidad de fluorescencia integrado normalizado.

Resultados

La preparación empleada consiste en genes quiméricos co-cultivos de circuitos vHipp-NACC in vitro. Las proyecciones que emanan de microslices vHipp, como entrada axonal presináptica, pueden hacer contactos sinápticos con las metas post-sinápticas, las neuronas dispersas de NACC. Indujo un (≥ 30 min) la facilitación sostenida de la transmisión glutamatérgica de las neuronas NACC inervados por vHipp nicotina axones ²¹ y prolongada de calcio de señalización a lo largo de los axones vHipp ⁵ tr...

Discusión

La preparación de co-cultivo describe re-capitula circuitos del hipocampo ventral-accumbens in vitro. Este examen permite la preparación relativamente sencillo y fiable de los perfiles espaciales y temporales por el cual la activación de nAChR pre-sinápticos obtener mejor transmisión glutamatérgica ^{5, 21.}

Co-culturas se definen como el crecimiento de diferentes tipos de células específicas en un plato que puede proporcionar condiciones fisiológicas in vitro para ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1. Medios de cultivo (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Suplementos	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicilina-Estreptomicina	GIBCO	10908-010	0,5 ml
GlutaMAX Suplemento	GIBCO	35050-061	0,5 ml
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. medios de lavado (HBSS, 100 ml)
HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3. solución salina tamponada HEPES  (HBS)    pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016 y nbsp;	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucosa	Sigma	G0350500	10 mM
4. Cóctel HBS para imágenes en vivo pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016 y nbsp;	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucosa	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxina	Tocris	1078	2 y micro; M
bicucullina	Tocris	131	10 µ M
D-AP-5	Tocris	105	50 y micro; M
CNQX	Tocris	1045	20 µ M
LY341495	Tocris	1209	10 µ M
5. Sin calcio  HBS    pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucosa	Sigma	G0350500	10 mM
6. 56 mM Potasio ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucosa	Sigma	G0350500	10 mM