Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

Resumen

Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe.

Resumen

La capacidad de las células para migrar es crucial en una amplia variedad de funciones celulares durante toda la vida desde el desarrollo embrionario y la curación de heridas de tumor y la metástasis del cáncer. A pesar de intensos esfuerzos de investigación, los principios básicos bioquímicos y biofísicos de la migración de las células aún no se entienden completamente, especialmente en los microambientes (3D) tridimensionales fisiológicamente relevantes. Aquí se describe un ensayo in vitro diseñado para permitir el examen cuantitativo de los comportamientos de migración celular en 3D. El método explota la capacidad mechanosensing de la célula y la propensión a migrar en la matriz extracelular previamente desocupada (ECM). Usamos la invasión de células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, en geles de colágeno como un sistema modelo. La difusión de la población de células y la dinámica de migración de las células individuales durante semanas de cultivo pueden ser monitoreados utilizando imágenes de células vivas y se analizan para extraer datos espaciotemporalmente resueltas. Además, El método es fácilmente adaptable para diversas matrices extracelulares, lo que ofrece una manera simple pero potente para investigar el papel de los factores biofísicos en el microambiente sobre la migración celular.

Introducción

La migración de las células juega un papel clave en diversas respuestas fisiológicas, tales como el desarrollo embrionario, la hemostasia, y la respuesta inmune, así como en procesos patológicos tales como enfermedades vasculares, la inflamación y el cáncer ^1. La disección de los factores bioquímicos y biofísicos subyacentes migración celular es, por tanto, fundamentalmente importante no sólo para entender los principios básicos de las funciones celulares, sino también para avanzar diversas aplicaciones biomédicas, tales como en la ingeniería de tejidos, anti-metástasis y el desarrollo de fármacos antiinflamatorios. Dado que la observación in vivo....

Protocolo

Cosecha 1. celular

1. Obtener MD-MBA-231 desde la 37 ° C, 5% de _CO2. Separe las células de la placa de cultivo de tejidos utilizando la solución de tripsina-EDTA 0,5%. Usar 1 ml de solución de tripsina-EDTA para células cultivadas en un matraz T25.
2. Precipitar las células en un tubo cónico de 15 ml mediante centrifugación a 200 × g durante 4 min, aspirar el sobrenadante, y Resuspender las células en 5 ml de medio de cultivo.
3. Contar la densidad celular, ρ, usando un hemocitómetro.
   Nota: Para preparar el gel interior sembrado de células, la suspensión de células después se diluyó 10 × para llegar a la densidad final d....

Resultados

El ensayo de gel concéntrica que aquí se presenta se realizó utilizando células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml de gel de colágeno interior y una densidad de siembra de células de = 2 × 10 ⁶ células / ml, como un ejemplo. Como se muestra en la Figura 2, por lo general después de unos días de cultivo, las células incumplieron la interfaz gel interior-exterior y comenzaron a invadir el exterior de gel. La población de células propaga predominantemente radialme.......

Discusión

En este protocolo describimos un ensayo in vitro para estudiar el comportamiento migratorio 3D de las células en entornos de matriz que se asemejan topológicamente a los ECM encontrados in vivo. Hay tres fortalezas principales de este ensayo en comparación con otros métodos disponibles actualmente. En primer lugar, este ensayo permite examinar simultáneamente los mecanismos de migración celular tanto a nivel de población como a nivel de célula individual. Esto abre posibilidades de estudiar la migración.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora de cultivos celulares	Fisher Scientific Pte Ltd	Modelo: 371, S/No 318854-6055
			Microscopio de barrido láser confocal invertido equipado con cámara de incubadora
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Suero fetal bovino (FBS)	Life Technologies	10082-147
Colorante fluorescente CellTracker CMTMR	Life Technologies	C2927
Plato con fondo de vidrio	IWAKI Cell Biology	3931-035 Plato de	35 mm de diámetro con pozo de fondo de vidrio de 12 mm de diámetro
Hemocitómetro	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Mejorado)
Medidor de pH con microprocesador	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Colágeno	Advanced BioMatrix	#5010-D	Colágeno bovino solubilizado con ácido tipo I (stock pH ~ 2)
Lente	objetivo Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicilina-estreptomicina	Life Technologies	15140-122
Medidor de pH	Sartorius	S/No 29153352	Medidor de pH básico PB-11
Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054