El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

Resumen

Aquí describimos el flujo de trabajo para usar el sistema TetON para lograr la expresión génica específica del tejido en la aleta de la cola del pez cebra adulto en regeneración.

Resumen

El pez cebra se ha convertido en un organismo modelo muy importante para estudiar el desarrollo de los vertebrados, la fisiología, las enfermedades y la regeneración de tejidos. Una comprensión profunda de los mecanismos moleculares y celulares involucrados requiere herramientas experimentales que permitan la manipulación inducible y específica de tejido de la expresión génica o las vías de señalización. Por lo tanto, nosotros y otros hemos adaptado recientemente el sistema TetON para su uso en el pez cebra. El sistema TetON facilita la expresión génica controlada temporal y espacialmente, y recientemente hemos utilizado esta herramienta para investigar las funciones específicas de los tejidos de la señalización de Wnt/beta-catenina durante la regeneración de la aleta de la cola del pez cebra. Aquí describimos el flujo de trabajo para usar el sistema TetON para lograr la expresión génica inducible y específica del tejido en la aleta de la cola del pez cebra adulto en regeneración. Esto incluye la generación de líneas transgénicas estables TetActivator y TetResponder, la inducción de transgenes y técnicas para la verificación de la expresión génica específica de tejido en la aleta regenerada. Por lo tanto, este protocolo sirve como modelo para establecer un sistema TetON funcional en el pez cebra y su posterior uso, en particular para estudiar la regeneración de las aletas.

Introducción

El pez cebra es un organismo vertebrado modelo bien establecido para estudiar muchos aspectos del desarrollo, fisiología, la enfermedad, y la regeneración. Con la creciente adopción de pez cebra como modelo para los procesos biológicos post-embrionarias, herramientas experimentales para la manipulación inducible, específico de tejido de la expresión génica o vías de señalización se han convertido cada vez más importante. En particular, los estudios sobre la regeneración de órganos y apéndice en el pez cebra adultos han sufrido de una falta de herramientas para la disección de los requisitos de espacio-temporales de las vías de señalización durante estos procesos rege....

Protocolo

1. Generación de transgénicos TetActivator Líneas de pescado

1. Generación de construcción TetActivator
   1. Secuencias reguladoras Clon de interés aguas arriba de la casete TetActivator en el vector # 1247 utilizando técnicas estándar. Alternativamente, utilizar técnicas de recombinación para generar un BAC, en la que el casete TetActivator (vector # 1180) se inserta en el primer exón del gen diana, y donde la Tol2 repeticiones invertidas se introducen en la columna vertebral BAC (para un protocolo detallado recombinería ver ^7,8).
   2. Preparar ADN plásmido libre de toxinas o preparaciones de ADN BAC utilizando kits disponibles comercialm....

Resultados

Establecer un sistema de Teton funcional para la expresión génica inducible específico de tejido, TetActivator transgénicos y líneas TetResponder necesitar ser generado (Figura 1A). Esto se logra mediante la microinyección de TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) constructos en embriones de pez cebra temprana y posterior integración de la línea germinal. Construcciones TetActivator funcionales pueden ser generados ya sea por clonación .......

Discusión

El pez cebra adulto tiene una asombrosa capacidad para regenerar con éxito a muchos órganos y apéndices internos. Un conocimiento profundo de los mecanismos moleculares y celulares implicados requiere un análisis específico de tejido de las funciones de genes y vías de señalización. Hacia esto, el sistema de Teton ofrece una herramienta eficaz para la expresión génica espaciotemporalmente controlada en el pez cebra embrionarias y adultas. Las construcciones del sistema de Teton y la metodología descritos en este manuscr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cajas de cría	Aqua Schwarz	AquaBox 1
Microscopio fluorescente compuesto	, p. ej., Leica, Zeiss	varía según el fabricante	para obtener imágenes de secciones de tejido fluorescentes
Microscopio confocal	, p. ej., Leica, Zeiss	varía según el fabricante	para obtener imágenes de secciones de tejido fluorescentes
Cryostat	, p. ej., Leica, Thermo-Scientific	varía según el fabricante	para la criosección
de 4', 6-diamidino-2-fenilinodol (Dapi)	Sigma-Aldrich	D9542	uso 1/5.000 en PBS para la visualización de núcleos
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891	prepara existencias en 50% EtOH a 50 mg/ml (97 mM) para la inducción de TetResponder
Paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	4% (p/v) de paraformaldehído en PBS, pH 7,5 para la fijación
1x Solución salina tampón de fosfato (PBS)			1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5
1x solución salina tampón de fosfato + Tween 20 (PBT)			1x PBS con 0,1% de
portaobjetos de microscopio de adhesión Tween 20 Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	1014356190	para la recolección de secciones de tejido
Microscopio fluorescente estereoscópico	, p. ej., Leica, Zeiss	varía según el fabricante	para el genotipado basado en fluorescencia
Termociclador	, p. ej., Biorad, Applied Biosystems	varía según el fabricante	para el genotipado basado en PCR
Medio de congelación de tejidos (TFM)	Triangel Biomedical Sciences	TFM-C	para la inclusión de tejidos
muestras de tricaína (L-etil-m-amino-benzoato-sulfonato de metano/MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	para anestesia uso a 1 mg/ml en medio embrionario E3