Artículo de método

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

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DOI:

10.3791/52771

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29 de abril de 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

En este artículo

Resumen

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Resumen

Los adyuvantes tradicionales de las vacunas, como el alumbre, provocan respuestas subóptimas de las células T CD8+. Para abordar este importante desafío en el desarrollo de vacunas, se han diseñado varios sistemas de nanopartículas para imitar las características de los patógenos para mejorar la entrega de antígenos a los ganglios linfáticos que drenan y aumentar la absorción de antígenos por parte de las células presentadoras de antígenos, lo que lleva a nuevas formulaciones de vacunas optimizadas para la inducción de respuestas de células T CD8+ específicas de antígenos. En este artículo, describimos la síntesis de un sistema de nanopartículas "imitador de patógenos", denominadas vesículas multilaminares reticuladas entre capas (ICMV) que pueden servir como un portador de vacuna eficaz para la administración conjunta de antígenos de subunidades y agentes inmunoestimulantes y la obtención de potentes respuestas citotóxicas de linfocitos T CD8+ (CTL). Describimos métodos para caracterizar el tamaño hidrodinámico y la carga superficial de las nanopartículas de la vacuna con dispersión dinámica de luz y analizador de potencial zeta, y presentamos un procedimiento basado en microscopía confocal para analizar la entrega de antígenos mediada por nanopartículas a los ganglios linfáticos drenantes. Además, mostramos una nueva técnica de imagen de bioluminiscencia de animales enteros que utiliza la transferencia adoptiva de células T CD8+ específicas de antígeno que expresan luciferasa a ratones receptores, seguida de la vacunación con nanopartículas, que permite la interrogación no invasiva de los patrones de expansión y tráfico de CTL en tiempo real. También describimos la tinción de tetrámeros y el análisis citométrico de flujo de células mononucleares de sangre periférica para la cuantificación longitudinal de las respuestas de las células T endógenas en ratones vacunados con nanopartículas.

Introducción

Desarrollo de la vacuna tradicional ha empleado principalmente el enfoque empírico de ensayo y error. Sin embargo, con el reciente desarrollo de una amplia variedad de biomateriales y descubrimiento de los determinantes moleculares de la activación inmune, ahora es posible diseñar racionalmente formulaciones de vacunas con señales biofísicos y bioquímicos derivados de patógenos 1,2. En particular, varias plataformas de administración de fármacos de partículas han sido examinadas como portadores de vacuna, ya que pueden ser co-cargado con antígenos de subunidades y agentes inmunoestimulantes, proteger componentes de la vacuna de la degradación, y mejorar su co-entrega a células presentadoras de antígeno (APCs) que reside en la linfa nodos (LNS), maximizando así la estimulación inmune y la activación 3-5. En este informe, se describe la síntesis de un sistema de nanopartículas "patógenos imitando", denominado vesículas multilamelares-interbilayer reticulado (ICMVs), que se han demostrado previamente como platfor vacuna potentem para elicitación de robusta de linfocitos T citotóxicos (CTL) y respuestas inmunes humorales en ambos compartimentos de tejido sistémicas y mucosas 6-9. En particular, la vacunación con ICMVs Conseguido mejorado sustancialmente los niveles de IgG en suero contra un antígeno de la malaria, en comparación con la vacunación con adyuvantes convencionales (por ejemplo, alumbre y Montanide) 7 y también suscitó respuestas CTL potentes contra las células tumorales y modelos de desafío virales en ratones 9. Aquí, utilizando ICMVs como un sistema de nanopartículas vacuna modelo, se describen los métodos para la caracterización de la vacuna nano-formulaciones, incluyendo el tamaño de las partículas y las mediciones de potencial zeta y el seguimiento de la trata de partículas para los LN de drenaje (dLNs) que utilizan la imagen confocal de tejidos cryosectioned 7. Además, se presenta un método basado en imágenes-toda-animales de analizar la expansión de las respuestas de CTL en ratones después de la transferencia adoptiva de células T CD8 + específicas de antígeno que expresan luciferasa 9,10. Finalmente, detinción de tetrámero escriba de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para la cuantificación longitudinal de las respuestas de células T endógenas en ratones vacunados con nanopartículas de 6,9.

ICMVs son una formulación de nanopartículas a base de lípidos sintetizados por fusión controlada de liposomas simples en estructuras multilaminares, que luego son estabilizadas químicamente por grupos de cabeza de fosfolípidos de maleimida-funcionalizado de reticulación dentro de las capas de lípidos con ditiol reticulantes 6. Una vez ICMVs se sintetizan, una pequeña fracción de nanopartículas se puede utilizar para determinar el tamaño de partícula y el potencial zeta (es decir, la carga superficial de las partículas) con un sistema de dispersión de luz dinámica (DLS) y un analizador de potencial zeta. DLS mide los cambios en la dispersión de luz en suspensiones de partículas, lo que permite la determinación del coeficiente de difusión y el tamaño hidrodinámico de partículas 11. El logro de tamaño de partícula consistente de lote a lote síntesis es críticoya que el tamaño de partícula es uno de los principales factores que influyen en el drenaje linfático de partículas de vacunas para dLNs y captación celular posterior por APCs 12,13. Además, el potencial zeta puede obtenerse mediante la medición de la velocidad de las partículas cuando se aplica una corriente eléctrica, que permite la determinación de la movilidad electroforética de las partículas y superficie de las partículas de carga 11. Garantizar valores de potencial zeta consistentes de partículas es importante ya que la carga superficial de las partículas determina la estabilidad coloidal, la cual tiene un impacto directo sobre la dispersión de partículas durante el almacenamiento y después de la administración in vivo 14,15. Con el fin de realizar un seguimiento de la localización de partículas para dLNs, ICMVs pueden ser etiquetados con fluoróforos deseados incluyendo colorantes lipófilos y antígenos covalentemente etiquetados. Después de la inmunización, los ratones pueden ser sacrificados en diversos puntos temporales, dLNs resecadas, cryosectioned, y se analizaron con microscopía confocal. Esta técnica permite la visualización de Desagüe linfáticoción tanto de los transportistas y el antígeno de la vacuna dLNs nanopartícula. Las secciones de tejido, además, se pueden teñir con anticuerpos marcados fluorescentemente y utilizado para obtener más información, tales como tipos de células asociadas con el antígeno y la formación de centros germinales como hemos demostrado previamente 7.

Una vez que la síntesis de partículas está optimizado y el tráfico a las dLNs se confirma, es importante para validar la elicitación de expansión de CTL in vivo. Con el fin de analizar la elicitación de las células T CD8 + específicas de antígeno en respuesta a la vacunación de nanopartículas, hemos utilizado un antígeno modelo, ovoalbúmina (OVA), con OVA 257-264 péptido (SIINFEKL) inmunodominante epítopo de células T CD8 +, que permite análisis inmunológicos detalladas de las respuestas de células T específicas de antígeno de 16,17 inicial el desarrollo de vacunas. En particular, para interrogar a la dinámica de expansión y migración de las células T CD8 + específicas de antígeno, hemos generado unamodelo de doble ratón transgénico mediante el cruce de luciferasa de luciérnaga-expresión de ratones transgénicos (Luc) con OT-I ratones transgénicos que poseen las células T CD8 + con receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (en asociación con H-2K b). A partir de estos ratones OT-I / Luc, luciferasa que expresan, las células T OT-I CD8 + pueden ser aislados y preparados para la transferencia adoptiva en ingenuas ratones C57BL / 6. Una vez sembrada, la inmunización con éxito con nanopartículas que contienen OVA-dará lugar a la expansión de las células T transferidas, que pueden ser rastreados mediante el control de la señal de bioluminiscencia con todo un sistema de imagen 9,10 animal. Esta técnica de formación de imágenes de todo el cuerpo no invasiva se ha utilizado con otros antígenos virales o tumorales en el pasado 18-20, revelando procesos implicados en la expansión de células T en los tejidos linfoides y difusión a los tejidos periféricos de una manera longitudinal.

Complementario al análisis de adoptivamente células T CD8 + específicas de antígeno transferidos, endogenolas respuestas de células T después de la vacunación nos puede ser examinado con el complejo péptido-mayor de histocompatibilidad (MHC) de ensayo tetrámero 21, en ​​el que un complejo tetrámero MHC-péptido, que consta de cuatro fluoróforo de etiquetado MHC de clase I moléculas cargado con epítopos de péptidos, se emplea para unirse TCR y la etiqueta las células T CD8 + de una manera específica de antígeno. El ensayo de tetrámero de péptido-MHC se puede realizar ya sea en estudios de necropsia terminales para identificar las células T CD8 + específicas de antígeno en tejidos linfoides y periféricas o en estudios longitudinales con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas a partir de extracciones de sangre en serie. Después de la tinción de los linfocitos con el péptido-MHC tetrámero, citometría de flujo análisis se realiza para los análisis detallados sobre el fenotipo de los CTL o cuantificación de su frecuencia entre las células T CD8 +.

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Protocolo

Todos los experimentos descritos en este protocolo fue aprobado por el Comité Universitario de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) de la Universidad de Michigan y realizaron de acuerdo con las políticas y directrices establecidas.

1. Síntesis y caracterización de ICMVs Co-cargado con proteína de antígeno y adyuvante Moléculas

  1. Mezclar 1: 1 relación molar de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butiramida] (MPB) en cloroformo, manteniendo la cantidad total de lípidos en 1,26 mol por lotes (es decir, 500 g de DOPC y 630 g de MPB) en un vial de vidrio de 20 ml (diámetro = 28 mm y la altura = 61 mm).
  2. Añadir fármacos lipófilos, como monofosforil lípido A (MPLA), o colorantes lipófilos (por ejemplo, DiD), a la solución de los lípidos en la concentración deseada. Eliminar completamente el disolvente orgánico purgando con nitroge extra secon gas y la colocación de las muestras al vacío O / N.
  3. Hidratar la película lipídica mediante la adición de 200 l de 10 mM de propano bis-tris (BTP, pH 7,0) que contiene fármacos solubles en agua (por ejemplo, antígenos de proteína). Vortex durante 10 s cada 10 min durante 1 hora a RT.
  4. Transferir el contenido del frasco de vidrio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, colocar las muestras en un baño de agua helada, y sonicar continuamente durante 5 min usando la intensidad del 40% en un ajuste / 20 kHz sonicador de sonda de punta de 125 W.
  5. Añadir 4 l de ditiotreitol 150 mM (DTT) a cada lote (trabajando concentración 2,4 mM), vórtice, y centrifugar brevemente utilizando una microcentrífuga de mesa.
  6. Añadir 40 l de 200 mM CaCl 2 y mezclar con la pipeta (trabajando concentración 33 mM). Incubar las muestras a 37 ° C durante 1 hora para permitir la reticulación de MPB-que contiene capas de lípidos con DTT.
  7. Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 minutos, retire el sobrenadante y resuspender en 200 l de ddiH 2 O.
  8. Repita el paso 1.7 y centrifugar de nuevo después de la segunda ddiH 2 O de lavado para eliminar CaCl 2, DTT sin reaccionar, y materiales de carga no encapsuladas a partir del sobrenadante.
  9. Preparar 10 mg / ml de 2 kDa polietilenglicol-tiol (PEG-SH) en ddiH 2 O. Resuspender cada muestra ICMV en 100 l de solución de PEG-SH y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
  10. Realice dos ddiH 2 O lavados (paso 1.7) y resuspender el botón ICMV final en PBS y se almacena a 4 ° C. Antes de usar, mezclar la suspensión ICMV, como partículas pueden depositarse en el fondo después de un almacenamiento prolongado.
  11. Para la caracterización de partículas, extraer una pequeña alícuota (~ 10%) de ICMVs de cada lote y diluir individualmente en un volumen total de 1 ml de ddiH 2 O. Coloque una sola muestra en un tamaño de partícula Zetasizer celular y medida, índice de polidispersidad, y el potencial zeta de las muestras usando un DLS y sistema de medición potencial zeta (de acuerdo con el protocolo del fabricante).

2. El examen de Nódulo Linfático Drenaje de ICMVs fluorescencia etiquetada con Microscopía Confocal

  1. Preparación de ICMVs cargado con antígeno-fluoróforo etiquetado y colorante fluorescente lipofílico
    1. Preparar proteína fluoróforo de etiquetado, tales como ovoalbúmina hace reaccionar con Alexa Fluor 555-éster de succinimidilo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Para preparar ICMVs etiquetados con fluoróforo en la cáscara de los lípidos, añadir colorante fluorescente lipofílica, (por ejemplo, 1,1-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DiD)) durante la preparación de la película lipídica (Paso 1.2) en 0,05% de lípidos cantidad molar. Para lípidos hidratación película (Paso 1.3), tampón uso que contiene el antígeno fluoróforo etiquetado, y la síntesis ICMV completa tal como se describe en los pasos 1.4 a 1.11.
  2. La administración subcutánea de nanopartículas a base de la cola
    1. Anestesiar ratón usando un vaporizador flujo controlado equipado con una cámara de inducción utilizing 3% isoflurano y 1,5 l / min de flujo de oxígeno de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Una vez que el ratón está inconsciente, realice los siguientes pasos con rapidez antes de la anestesia que desaparecen para permitir un acceso óptimo a el sitio de la inyección y minimizar las molestias al animal. También puede utilizar un buen cono de la nariz apropiado para mantener la anestesia. Si los ratones se anestesiaron durante más de 5 min, aplicar lubricante necesario para minimizar la irritación del ojo después del procedimiento.
    2. Pulverizar la base de la cola con etanol al 70% para desinfectar y humedecer la parte de piel el pelo mojado para exponer un pequeño parche de piel visible, que puede ser utilizado para visualizar la aguja bajo la piel.
    3. Prepare suspensión inyección de partículas que contiene la cantidad deseada de antígeno y adyuvante por 100 l de dosis de vacunación en PBS (por ejemplo, 10 g OVA y 0,3 g MPLA por 100 l de dosis de inyección se ha utilizado en el pasado 6,9).
    4. Dibujar el int suspensión de partículasjeringuilla oa una aguja 27-29 G e insertar la aguja en la base de la cola (~ 5 mm de la línea del cabello) con el bisel hacia arriba e inyectar 50 l de la suspensión de partículas 22.
    5. Espere unos segundos para que la presión de igualar para evitar excesiva de reflujo y tire de la aguja. Repetir la inyección en el otro lado de la base de la cola para dirigirse tanto que drenan los LN inguinales.
  3. Preparación de cryosections ganglios linfáticos y el examen con el microscopio confocal.
    1. La eutanasia del ratón con asfixia con CO2, seguido por neumotórax inducida de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Extraer los LN inguinales, según el protocolo demostrado en Bedoya 23 y lavar la sangre mediante la colocación de los tejidos en 1 ml de PBS 4 ° C.
    2. Absorbe el PBS de los tejidos con tejidos y colocar el tejido en criomoldes de tejido (10 x 10 x 5 mm 3) precargada a la cima con 24 octubre medio de congelación. Snap congelar la tisdemandar bloque en nitrógeno líquido durante 30 segundos. Como alternativa, coloque bloque de tejido en hielo seco durante 30 minutos. Almacenar tejido congelado en -80 ° C congelador.
    3. Cortar secciones de tejido de 5-10 m de espesor en un criostato fijado en -20 ° C 24.
    4. Si es necesario, lleve a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia, y examinar el tejido con la microscopía confocal como previamente demostrada 24.

3. Monitoreo de expansión de antígeno-específica, luciferasa que expresan las células T CD8 + después de nanopartículas vacunación con Whole Animal Imaging

  1. Aislamiento de OVA 257-264 específico de, las células T CD8 + que expresan luciferasa de OT-I / Luc ratones transgénicos
    1. La eutanasia a un ratón transgénico OT-I / Luc con asfixia de CO 2 e inducir un neumotórax de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Se recoge el bazo de una manera estéril mediante el acceso a la cavidad peritoneal y con cuidado de extraer el tejido del páncreas 23, ylugar en 5 ml de 4 ° C PBS + FBS al 2% para la transferencia a la campana de cultivo de tejidos.
    2. Coloque el bazo en un colador de nylon 70 micras sobre un tubo de centrífuga cónico de 50 ml (hasta 3 bazos a la vez). El uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml, moler las células a través del colador.
    3. Lave el émbolo y el filtro con PBS + FBS al 2% y deseche. Llevar el volumen total a 10 ml / bazo en el tubo de 50 ml, tomar una pequeña muestra de la suspensión celular a contar con un hemocitómetro, y se centrifuga durante 10 min a 300 x g.
    4. El uso de un kit de selección negativa magnético disponible comercialmente, aislar la población de células T CD8 +, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    5. Después de lavar las células con PBS, contar el número de células T CD8 + aisladas. Para evaluar la pureza de las células T CD8 + aisladas, incubar ~ 20.000-30.000 células en 20 l de CD16 de ratón / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) durante 10 min, a continuación, añadir 20 l de anticuerpo αCD8-APC (0,005 mg / ml) y se incuba durante 30 min. Performa todas las incubaciones a 4 ° C en PBS + 1% w / v BSA. Realizar análisis de citometría de flujo 25.
  2. La transferencia adoptiva de células T CD8 + aisladas y la visualización de su expansión después de la vacunación
    1. Realice la transferencia adoptiva de células T aisladas OT-I / Luc CD8 + en ingenuo C57BL / 6 ratones mediante la administración de 1-10 × 10 5 células en un volumen de 200 l de PBS mediante inyección intravenosa vena de la cola 22 (día -1). Teniendo en cuenta que los parches de piel y de la piel negro en ratones C57BL / 6 puede interferir con la señal bioluminiscente, albinos afeitado C57BL / 6 ratones son ideales para estos estudios.
    2. Después de un día (día 0), administrar la vacuna como se describe anteriormente (sección 2.2).
    3. Administrar 150 mg de luciferina por kg de peso corporal del ratón por vía intraperitoneal en un volumen de 300 l de PBS. Después de 10 min, anestesiar los ratones con isoflurano (como en el paso 2.2.1) y visualizar las células T OT-I / Luc CD8 + mediante la adquisición de la señal de la bioluminiscencia durante 5-10 min won un sistema de imágenes de animales conjunto (IVIS; consulte Wilson 26 para obtener instrucciones detalladas). Repita según sea necesario para los estudios longitudinales.

Las células 4. péptido-MHC de tetrámeros La tinción de PBMCs de Análisis del antígeno T CD8 + específicas

Nota: El procedimiento siguiente protocolo se puede realizar utilizando cualquiera de ratones C57BL / 6 adoptiva transferidos con las células T OT-I / Luc CD8 + o C57BL / 6 ratones sin la transferencia adoptiva.

  1. En un punto de tiempo deseado después de la vacunación, recoger aproximadamente 100 l de sangre (4-6 gotas) de los ratones a través de la técnica de sangrado submandibular 27 en un tubo revestido con K 2 EDTA y se invierte varias veces para prevenir la coagulación.
  2. Transferir 100 l de sangre a un tubo de microcentrífuga, añadir 1 ml de tampón de lisis, y se incuba durante 2 a 3 min con el fin de eliminar los glóbulos rojos (GR). Centrifugar las muestras durante 5 min a 1.500 xg y eliminar el sobrenadante. Si el pellet todavía unappears rojo (que indica eliminación incompleta de los glóbulos rojos), repetir la etapa de lisis con una breve incubación (<1 min) de tampón de lisis.
  3. Lavar las PBMCs restantes con 1 ml de tampón FACS (PBS + 1% p / v BSA) y centrifugar a 1500 xg durante 5 min.
  4. Aspirar el sobrenadante y resuspender la muestra en 20 l de ratón CD16 / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) para bloquear el anticuerpo no específica y mediada por FcR vinculante. Incubar durante 10 min a TA.
  5. Transferir las células a partir de tubos de microcentrífuga en 4 ml de fondo redondo de tubos de FACS. Añadir 20 l de H-2K b solución OVA Tetramer-SIINFEKL-PE de acuerdo con las especificaciones del fabricante a cada muestra y se incuba durante 30 minutos en hielo.
  6. Prepare el cóctel de anticuerpos (por ejemplo, αCD8-APC, αCD44-FITC y αCD62L-PECy7 anticuerpos (0.005, / ml de concentración 0.005 y 0.002 mg, respectivamente)). Añadir 20 l a cada muestra experimental, y se incuba durante 20 min en hielo. Preparar controles individuales fluoróforo por labeling células con cada tetrámero fluoróforo de etiquetado o anticuerpo a la concentración indicada anteriormente.
  7. Lavar 2 veces con tampón FACS y resuspender el sedimento final en tampón FACS que contiene 2 mg / ml de DAPI. Las células están ahora listas para citometría de flujo (análisis de detalles y ejemplos se pueden encontrar en Scheffold 25).

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Resultados

Los pasos implicados en la síntesis de ICMVs se ilustran en la Figura 1 6. En resumen, una película lipídica que contiene cualquier fármacos lipófilos o colorantes fluorescentes se hidrata en presencia de fármacos hidrófilos. Los cationes divalentes, tales como Ca 2+, se añaden a conducir fusión de liposomas aniónicos en vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulación, tales como la TDT, se añade a los lípidos de maleimida-funcionalizado "grapas" en apposing capas...

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Discusión

El protocolo previsto en este artículo se describe la síntesis y caracterización de un nuevo sistema de nanopartículas a base de lípidos, denominados ICMVs, y proporciona el proceso de validar la efectividad de las formulaciones vacunales basados ​​en nanopartículas para inducir respuestas de células T CD8 + específicas de antígeno. ICMV síntesis se completa en todas las condiciones acuosa, que es una importante ventaja en comparación con otros sistemas de nanopartículas poliméricas comúnmente utilizados (por ejempl...

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Divulgaciones

Perkin Elmer siempre que el coste de producción incurridos durante la publicación de este artículo.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud otorga 1K22AI097291-01 y por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación de los Institutos Nacionales de la Salud con el Número Premio UL1TR000433. También reconocemos Prof. Darrell Irvine en el MIT y profesor Matthias Stephan en el Centro del Cáncer Fred Hutchinson por su contribución en el trabajo inicial sobre las nanopartículas de vacunas y ratones transgénicos OT-I / Luc.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1. Síntesis y caracterización de ICMVs cocargados con antígeno proteico y moléculas adyuvantes
1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil)butiramida] (sal sódica) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Avanti Polar Lipids, INC.
Lípido monofosforílico A (sintético) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
Viales de vidrio de 20 mlWheaton0334125D
Symphny Horno de vacíoVWR414004-580
Ovoalbúmina (OVA)Worthington3054
Bis-Tris Propano (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonicador (125  W/20  kHz)QsonicaQ125-110
Ditiothreitol (DTT)FisherBP172
2 kDa Polietilenglicol tiolado (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer CubetasMalvernDTS1070
2. Examen del drenaje de ganglios linfáticos de ICMV marcados con fluorescencia con microscopía confocal
1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobencenosulfonato (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-succinimidil éster (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Tissue-Tek OCT medio de congelación VWR25608-930
Criomoldes de tejidosVWR25608-922
3. Monitorización de la expansión de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno que expresan luciferasa después de la vacunación con nanopartículas con imágenes de animales enteros
C57BL/6 ratonesJackson000664
Albino C57BL/6 ratonesJackson000058
OT-1 C57BL/6 ratonesJackson
70 μ m colador de nylonBD352350
EasySep™ Kit de aislamiento de células T CD8+ de ratónStemCell19853
IVIS® sistema de imagen de animales enterosPerkin Elmer
4. Tinción de tetrámeros peptídicos-MHC de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para el análisis por citometría de flujo de células T CD8+ específicas de antígenos
K2EDTA tubosBD365974
ACK tampón de lisisLife TechnologiesA10492-01 
Anti-CD16/32 Fc BlockEbioscience14-0161-86
H-2Kb OVA TetrámeroMBLTS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4′,6- Diimino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)SIGMAD8417-10MG
CyAn Citómetro de flujoBeckman Coulter
FlowJo SoftwareFlowJo
870012850375 003831

Referencias

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