Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Resumen

La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

Resumen

La malaria causa de morbilidad y mortalidad global significativo. Ninguna vacuna rutinaria está disponible actualmente. Una de las principales razones de la falta de una vacuna es el reto de identificar candidatos vacunales adecuados. Proteínas palúdicas expresan utilizando sistemas de expresión procariotas y eucariotas basados ​​en células están mal glicosilados, generalmente insolubles y se someten plegado inadecuada conduce a una inmunogenicidad reducida. Los sistemas de expresión libres de germen de trigo, lisado de reticulocitos de conejo y Escherichia coli lisado de células se utilizan actualmente para la expresión de las proteínas de la malaria. Sin embargo, la longitud de tiempo expresión y glicosilación inadecuada de proteínas sigue siendo un desafío. Demostramos la expresión de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando sistemas de libre expresión basados ​​en células HeLa, denominados "sistemas de expresión in vitro de células humanas libres". Los sistemas de la libre expresión basados ​​en células HeLa 2 transcriben mRNA en 75 min y 3 l de transcribed mRNA es suficiente para traducir proteínas en 90 min. El sistema de expresión 1-paso es una transcripción y traducción acoplada sistema de expresión; la transcripción y co-traducción se produce en 3 horas. El proceso también se puede extender durante 6 horas al proporcionar energía adicional. En el sistema de expresión de 2 a paso, el ARNm se transcribe primero y después se añadió a la mezcla de traducción de la expresión de la proteína. Describimos cómo expresar proteínas de la malaria; un hidrófobo Acantilado de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembrana (PFMC-2 ™), una proteína PF3D7_0925900 hidrófilo y un repeticiones armadillo que contienen proteínas PF3D7_1361800, utilizando el sistema de expresión libre de células HeLa basado. Las proteínas se expresan en micro volúmenes que emplean estrategias de expresión de 2 pasos y 1 pasos. Un método de purificación de afinidad para purificar 25 l de proteínas expresadas mediante el sistema de libre expresión in vitro de células humanas también se describe. Rendimiento de proteína se determina mediante el ensayo de Bradford y la expresóy proteínas purificadas se pueden confirmar por análisis de Western Blot. Proteínas recombinantes expresadas se pueden utilizar para inmunizaciones, inmunoensayos y secuenciación de proteínas.

Introducción

En la investigación de la malaria, la expresión de proteínas inmunogénicas utilizando sistemas basados ​​en células procariotas o eucariotas sigue siendo un reto. La riqueza AT del genoma de Plasmodium y los mecanismos de post traduccionales desconocidos ^14,7, contribuyen a las dificultades asociadas a la obtención de proteínas correctamente plegadas y inmunogénicas para los estudios de producción de anticuerpos y vacunas. Sistemas procariotas tales como Escherichia coli se han utilizado para la expresión de proteína recombinante. Sistemas procariotas son de bajo costo, eficaces, producen altos rendimientos de proteína recombinante

Protocolo

1. Preparación de parásitos Cultivos Celulares, Colección de Parásito Pellets

1. Preparar medios RPMI-1640 con HEPES mediante la adición de 10 g de polvo de RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sodio, 5,9 g de tampón HEPES, 50 mg hipoxantina y 3,8 g de dextrosa en 1 L dH estéril ₂ O. Mezclar utilizando la tabla agitador magnético hasta que todos los que se disuelva el polvo en 1 L de agua destilada. Realizar micro filtración de medios utilizando 0,22 micras filtro. Almacene el papel en frascos estériles.
2. Lávese las no infectadas (fresco) tipo A + eritrocitos utilizando RPMI. Preparar 5% de hematocrito de los e....

Resultados

Validación de las proteínas recombinantes expresadas a través de reactividad con anticuerpos específicos es un primer paso importante para confirmar el correcto plegamiento de las proteínas expresadas. Proteínas recombinantes malaria se expresaron mediante el paso y dos pasos en sistemas de expresión libre de células humanas in vitro. Las proteínas recombinantes son método de afinidad Ni-quelante purificada. A continuación, utiliza antisueros contra rhoptries merozoitos enteros en el Western Blot de SDS-PAGE de proteína.......

Discusión

Los pasos importantes para la expresión con éxito de proteínas usando dos etapas en el sistema libre de células humanas in vitro la expresión y purificación son: 1) la amplificación y clonación de genes en pT7CFE-CHIS plásmido vector éxito; 2) la transcripción de ARN a ^{30 °} C; 3) la traducción de proteína a 30 ° C en presencia de inhibidor de RNasa; 4) el desarrollo del protocolo de purificación de afinidad basada usando perlas de resina recubiertas con Ni y 5) el análisis de resultados en western blot utiliz.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de libre expresión de células humanas in vitro de 2 pasos	Thermo Fisher	88856	Descatalogado. Almacene siempre a -80 °C. No descongelar en agua tibia
paso in vitro sistema de traducción acoplado	Thermo fischer	88860	Almacenar siempre a -80 °C. No descongele en agua tibia
Sistema de purificación ProBond	Invitrogen	K850-01	Almacene en RT
Probond Resina quelante de níquel	Invitrogen	R801-01	Tienda a 4oC.
del Banco de Sangre		Sangre Humana	a las 4 °C.

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