Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de Plasmodium rhoptry Proteínas

Summary

La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

Abstract

La malaria causa de morbilidad y mortalidad global significativo. Ninguna vacuna rutinaria está disponible actualmente. Una de las principales razones de la falta de una vacuna es el reto de identificar candidatos vacunales adecuados. Proteínas palúdicas expresan utilizando sistemas de expresión procariotas y eucariotas basados ​​en células están mal glicosilados, generalmente insolubles y se someten plegado inadecuada conduce a una inmunogenicidad reducida. Los sistemas de expresión libres de germen de trigo, lisado de reticulocitos de conejo y Escherichia coli lisado de células se utilizan actualmente para la expresión de las proteínas de la malaria. Sin embargo, la longitud de tiempo expresión y glicosilación inadecuada de proteínas sigue siendo un desafío. Demostramos la expresión de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando sistemas de libre expresión basados ​​en células HeLa, denominados "sistemas de expresión in vitro de células humanas libres". Los sistemas de la libre expresión basados ​​en células HeLa 2 transcriben mRNA en 75 min y 3 l de transcribed mRNA es suficiente para traducir proteínas en 90 min. El sistema de expresión 1-paso es una transcripción y traducción acoplada sistema de expresión; la transcripción y co-traducción se produce en 3 horas. El proceso también se puede extender durante 6 horas al proporcionar energía adicional. En el sistema de expresión de 2 a paso, el ARNm se transcribe primero y después se añadió a la mezcla de traducción de la expresión de la proteína. Describimos cómo expresar proteínas de la malaria; un hidrófobo Acantilado de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembrana (PFMC-2 ™), una proteína PF3D7_0925900 hidrófilo y un repeticiones armadillo que contienen proteínas PF3D7_1361800, utilizando el sistema de expresión libre de células HeLa basado. Las proteínas se expresan en micro volúmenes que emplean estrategias de expresión de 2 pasos y 1 pasos. Un método de purificación de afinidad para purificar 25 l de proteínas expresadas mediante el sistema de libre expresión in vitro de células humanas también se describe. Rendimiento de proteína se determina mediante el ensayo de Bradford y la expresóy proteínas purificadas se pueden confirmar por análisis de Western Blot. Proteínas recombinantes expresadas se pueden utilizar para inmunizaciones, inmunoensayos y secuenciación de proteínas.

Introduction

En la investigación de la malaria, la expresión de proteínas inmunogénicas utilizando sistemas basados ​​en células procariotas o eucariotas sigue siendo un reto. La riqueza AT del genoma de Plasmodium y los mecanismos de post traduccionales desconocidos ^14,7, contribuyen a las dificultades asociadas a la obtención de proteínas correctamente plegadas y inmunogénicas para los estudios de producción de anticuerpos y vacunas. Sistemas procariotas tales como Escherichia coli se han utilizado para la expresión de proteína recombinante. Sistemas procariotas son de bajo costo, eficaces, producen altos rendimientos de proteína recombinante y tienen múltiples vectores de clonación. Anfitrión E. coli células son fáciles de transformar y células crecen rápidamente. Sin embargo, los sistemas procariotas tienen limitaciones tales como la falta de sustitución de aminoácidos, modificación post-traduccional, riesgo de contaminación, productos heterogéneos y acumulación de proteínas recombinantes dentro de cuerpos de inclusión ^24.

En unestudio de Mehlin et al (2006)., 1000 marcos de lectura abierta (ORF) se expresaron. Aproximadamente el 7% de las proteínas expresadas eran soluble ^14. La insolubilidad observado es debido a la naturaleza sesgada de los genes y la alta frecuencia de los codones que se utilizan idealmente por el Plasmodium rica en AT del genoma ^14. Una estrategia alternativa para superar este problema se ha desarrollado mediante el uso de plásmidos o células huésped que contienen tRNAs que reconocen codones o codones que coincidan con las frecuencias ³ raras. Incluso después de realizar estas optimizaciones, porciones muy pequeñas de proteínas se expresan como soluble, activo e inmunogénica ^14. Los sistemas de expresión sin células contienen todos los componentes necesarios para la transcripción y la traducción, tales como ribosomas, factores de iniciación, factores de elongación (traducciones factores), tRNA y aminoacil-tRNA sintetasas. Ambas reacciones de transcripción y traducción se acoplan en el procedimiento de un solo paso ^11,29. El transcription reacción se realiza en un tubo antes de cantidad apropiada de mRNA se incuba con maquinaria de traducción en un ^11,29 tubo diferente. Aunque estos métodos tienen éxito en Plasmodium sp. Expresión de proteínas, un inconveniente importante es la longitud de tiempo para la expresión de la proteína, que es aproximadamente 22 hr ^29. Además, el alto costo de los suministros para su inclusión en los protocolos ^29, los preparativos de trabajo intensivo del lisado celular e inconsistencias en los preparativos de los componentes, hacen de estos sistemas inalcanzable. El objetivo principal de los investigadores para el desarrollo de un sistema de expresión libre de células depende de factores tales como la modificación genética rápida, los rendimientos rápidos con altas concentraciones y preparaciones de lisado adelante rectas ^1.

Sistemas eucariotas como las levaduras, las líneas celulares de mamíferos, baculovirus sistema de expresión mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum y sistemas de expresión parasitarias Doch como Leishmania se han utilizado para la expresión de proteína recombinante ^7. Sistemas eucariotas comparten relación filogenética y por lo tanto también comparten características como la glicosilación, acilación, la formación de enlaces disulfuro, la interacción chaperona, la proteolisis y la compartimentación subcelular. Eventos secreción de proteínas en eucariotas evitar la acumulación y disminuye la toxicidad para los sistemas de expresión ^13. Se prefiere el uso de sistemas de levadura, ya que son adecuados para la expresión de proteínas en gran escala y para la obtención de altos rendimientos ^4. Dos P. proteínas falciparum PFCP-29 y Pvs25 se produjeron utilizando el sistema de levadura ^4. Sin embargo, un inconveniente importante en la síntesis de la mayoría de las proteínas era patrones irregulares de N y O-glicosilación, plegado y truncamiento de proteínas a partir de su forma nativa ⁴ inadecuada.

El uso de células de mamíferos para la síntesis de proteínas recombinantes es un trabajo intensivo y se Expensive para mantener las líneas celulares recombinantes estables ^4. Por lo tanto, las células de mamíferos se han limitado para el análisis de señalización de la proteína, interacciones proteína y las interacciones parásito-huésped y también para el ensayo de vacunas de ADN ^4. El ADN humano y vitro sistema libre de células mRNA en la expresión de proteínas se describe en el presente documento es un sistema de base de mamífero derivado de células HeLa que expresa las proteínas en 3 hr. Las proteínas expresadas utilizando vector de expresión pT7CFE1-Chis haber una etiqueta C-terminal de facilitar la identificación y purificación. El sistema basado en HeLa se complementa con factores de iniciación de la traducción y un regulador de la traducción, mejorando así la eficiencia del sistema de traducción. Las proteínas se pueden traducir rápidamente, examinados, verificados y procesados ​​para su uso en diversas aplicaciones inmunológicas y estructurales ^15.

Los sistemas de expresión libres de células eucariotas tales como germen de trigo y de reticulocitos de conejo se utilizan actualmente para la expresión de varproteínas eucariotas pagarés incluyendo proteínas de Plasmodium ^11,29. Además, E. sistemas libres de células basados ​​coli también se emplean para la expresión de la proteína eucariota ^11. La Tabla 1 resume los diferentes sistemas de expresión libre de células mediante la comparación de características de los sistemas, así como la facilidad de uso de los sistemas para la expresión de proteínas. El sistema libre de células humana en comparación con los otros tiene la capacidad de realizar modificaciones post y co-traduccional y es menos costoso. La optimización de codones es posible y todas las reacciones se puede realizar en 3 hr. El sistema de HeLa es un sistema de traducción ideal para la síntesis de proteínas en el entorno de laboratorio.

Una ventaja importante de los sistemas de expresión libre de células humanas sobre otros sistemas libres de células es la disponibilidad de varias líneas celulares diferentes derivadas de diferentes órganos y tejidos. Varias variedades de sistemas libres de células pueden ser diseñados dependiendo de la línea celular. El extracto des derivados de células de mamíferos tienen una mayor eficiencia para sintetizar proteínas grandes que cualquier otro sistema de expresión libre de células. Estos sistemas de expresión de células libres también se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico y caracterización de proteínas tales como micro matrices ^30. Los populares líneas celulares HeLa son los más ampliamente utilizados para llevar a cabo la expresión de proteínas ^33. El retículo endoplasmático en las líneas celulares HeLa es subdesarrollado, que conduce a la ausencia de actividad de modificación de la glicosilación post-traduccional ^33. Sin embargo, se cree que este sistema a ser ventajoso para la síntesis de proteínas Plasmodium como Plasmodium también carece de modificación posterior a la traducción de glicosilación ^29. El protocolo libre de transcripción-traducción de células HeLa es fácil de realizar, de bajo costo y las proteínas se puede expresar en 90 min, listo para la purificación y otras aplicaciones posteriores.

Protocol

1. Preparación de parásitos Cultivos Celulares, Colección de Parásito Pellets

1. Preparar medios RPMI-1640 con HEPES mediante la adición de 10 g de polvo de RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sodio, 5,9 g de tampón HEPES, 50 mg hipoxantina y 3,8 g de dextrosa en 1 L dH estéril ₂ O. Mezclar utilizando la tabla agitador magnético hasta que todos los que se disuelva el polvo en 1 L de agua destilada. Realizar micro filtración de medios utilizando 0,22 micras filtro. Almacene el papel en frascos estériles.
2. Lávese las no infectadas (fresco) tipo A + eritrocitos utilizando RPMI. Preparar 5% de hematocrito de los eritrocitos (0,5 ml de eritrocitos frescos lavados en 9,5 ml 10% RPMI + suero humano).
3. Haz 15% de suero humano + RPMI (15 ml de suero humano y 85 ml de RPMI) para iniciar el cultivo de parásitos. Hacer 10% de suero humano y RPMI (10 ml de suero humano y 90 ml de RPMI) para continuar el cultivo de parásitos en los glóbulos rojos.
4. Cultura P. falciparum (3D7 y FCR-3 cepas) en el tipoA + eritrocitos humanos en 5% de hematocrito y 20% de parasitemia en placa de Petri o un frasco de cultivo de 75 cm ^3. Mantener el cultivo in vitro de acuerdo con el método de Trager y Jensen vela tarro ^26. Alternativamente, mantienen las culturas están en la incubadora a 37 ° C se mantiene 9,5% de CO ₂ y el 3,4% de N ₂ gas. Cultura P. falciparum en RPMI 1640 con HEPES medio suplementado con 10% de suero humano.
5. Sincronizar P. cultura falciparum mediante la adición de 65% de Percoll (65 ml de Percoll + 35 ml de RPMI-1640 sin suero humano) al cultivo concentrado ^27.
6. Centrifugar el concentrado de cultivo con Percoll a 2.500 xg durante 5 min que se traduce en 3 capas. Con cuidado, usando una pipeta de transferencia aislar esquizontes de la transferencia de capa media en un tubo separado en condiciones asépticas ^27.
7. Lavar los cultivos aislados con 10% de suero humano + RPMI-1640 dos veces para eliminar el exceso de Percoll por centrifugación a 7500 xg durante 5 min. Discard el sobrenadante cada vez en condiciones asépticas ^27.
8. Continuar el cultivo de la P. sincronizado esquizontes falciparum en 10% de suero humano RPMI-1640 + ^27.
9. Recoger esquizontes mediante el tratamiento de los eritrocitos infectados por Plasmodium con 10 mM Tris pH 8,8 y centrifugación a 15.000 xg durante 15 min ^23. Gránulos de parásitos tienda a -70 ° C después de la adición de 5 l de inhibidor de la proteasa (aprotinina) a los pellets. Utilice bolitas de parásitos para la extracción de proteínas, el aislamiento de ADN genómico y el aislamiento de ARN.

2. Preparación de plásmido vector

1. Aislar el ADN genómico de P. pellets de esquizontes falciparum preparados a partir de cultivos de aproximadamente el 20% de parasitemia.
2. Añadir 600 l de 10 mM Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS y 1 mg / ml de proteinasa K, a gránulos en un tubo de microcentrífuga, homogeneizar pellet utilizando una jeringa de 1 ml unida a una aguja 26 G. Alternate llenado de la jeringacon la mezcla de pellets y vaciado en un tubo de microcentrífuga de 20 veces. Incubar tubo que contiene homogeneizado O / N en un baño de agua a 50 ° C.
3. Realizar fenol - cloroformo (P + C) la extracción mediante la adición de 600 l de P + C (300 l de fenol y 300 l de cloroformo) a pellet homogeneizada. Tubo de tapa y agite la mezcla vigorosamente por inversión de extremo a extremo de tubo. Tubo de centrífuga a 14.000 xg durante 2 min y recoger solución acuosa superior utilizando una micropipeta en un nuevo tubo de microcentrífuga. Repita este paso dos veces.
4. Añadir 600 l de cloroformo a la capa acuosa en el nuevo tubo de la etapa 2.1.2. Vortex el tubo durante 10 segundos y se centrifuga a 14.000 xg durante 2 min. Medir la capa acuosa superior con una micropipeta y la transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga.
5. Añadir 0,1 vol de 5 M de acetato de sodio pH 5,5 y 1 vol de isopropanol (si capa acuosa es de 300 l añaden 30 l de 5 M de acetato de sodio pH 5,5 + 330 l de isopropanol) para la puesta acuosaer desde el paso 2.1.3. Incubar el tubo a TA durante 15 min.
6. Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 10 min para precipitar sedimento de ADN. Descartar el sobrenadante y lavar pellet con 100 l de etanol al 70% (70 l de etanol y 30 l de dH ₂ O) para eliminar el exceso de sal a partir del ADN. ADN tienda en 50 l de _dH2O a -20 ° C.
7. Diseño de cebadores directo e inverso usando software o manualmente para la amplificación de P. genes falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 y PF3D7_0114100 previamente identificadas en los estudios de proteoma ^16,18 con sitios de restricción apropiados que permitan la clonación de las secuencias de genes en los sitios de clonación múltiple del plásmido de expresión pT7CFE1-CHIS como se muestra en la Tabla 2.
8. Hacer un 50 l mezcla de reacción mediante la adición; 5 l de aislados P. falciparum ADN genómico, 5 l de tampón 10x, 5μl de _MgCl2, 1,5 l de cebador directo, 1,5 l decebador inverso, 0,5 l de ADN polimerasa T7 y 31,5 l de dH ₂ O y realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a 94 ° C durante 8 minutos para la desnaturalización, 50 ° C durante 1 min 30 seg para la extensión y 72 ° C durante 9 min para el recocido y renaturalización para amplificar genes mostrados en la Tabla 1.
9. Productos de PCR separados sobre 1% gel de agarosa (1 g de agarosa y 100 ml de Tris EDTA acetato (TAE) buffer) ^32.
10. Cortar las bandas de ADN amplificados por PCR a partir del gel de agarosa, colocar las rodajas de gel que contienen ADN en una columna de centrifugación de extracción de gel de ADN y congelar a -20 ° C durante 5 min. Añadir 100 l de isopropanol a las rodajas de gel congelado y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min.
11. Medir el flujo a través acuosa filtrada en el tubo de recogida de la etapa 2.5, utilizando una micropipeta y transferir a un tubo nuevo. Añadir 0,1 vol de 5 M de acetato de sodio y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y añadir 10 l de _dH2O a thsedimento de ADN e.
12. Digerir el vector de expresión pT7CFE1-CHIS y fragmentos de ADN purificado (de 2,6) en dos tubos separados mediante la adición de 3 l de plásmido y 5 l de PCR productos génicos a cada tubo. Añadir a cada tubo, 1 l de enzimas de restricción específicas, 2 l de tampón de reacción y 14 l de dH ₂ O.
13. Añadir 3 l de plásmido digerido, 5 l de fragmentos de ADN digeridos, 2 l de tampón de ligasa 10x, 1 l de ligasa y 9 l de dH ₂ O en un tubo de microcentrífuga. Se incuba a 12 ° CO / N.
14. Añadir 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M a pH 5,5 y 2 volúmenes de etanol (si su volumen de tubos de ligadura es 20 l añadir 2 l de 3 M de acetato de sodio + 44 l de etanol) para el tubo desde el paso 2.14. Mezclar bien e incubar a -20 ° C durante 15 min.
15. Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 15 min. Retirar con cuidado el sobrenadante utilizando una pipeta micro sin perturbar el sedimento.
16. Añadir 100 l de etanol al 70% to el sedimento de la etapa 2.10. Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 5 min. Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 10 l de agua libre de nucleasa con el sedimento de ADN.

3. Proteína Expresión Uso en Vitro Cell Humano Sistema Libre Expresión

1. Preparar 20 l de mezcla de transcripción mediante la medición de 2 l de la pT7CFE1-CHIS plásmido de ADN recombinante, 4 l de 5x tampón de transcripción, 4 l de mezcla NTP, 2 l de T7 RNA polimerasa y 8 l de agua libre de nucleasa para 2 pasos Humano en Vitro Protein Expression utilizando moldes de ADN. Mezclar los componentes en un tubo de microcentrífuga y se incuba durante 75 min a 30 ° C en un baño de agua.
2. Tome 2 l de la mezcla de transcripción y añadirlo a 23 l de mezcla de traducción que contiene 12,5 l de lisado de células HeLa, 2,5 l de proteínas accesorias, 1 l de solución de sal A, 0,5 l de aminoácidos Met, 0,5 l de aminoácidos Leu, 181; l de inhibidor de RNasa, 1,25 l de mezcla de energía y 3,75 l de agua libre de nucleasa.
3. Incubar la mezcla de traducción de la etapa 3.2 a 30 ° C durante 90 min. Tienda traducida productos a -20 ° C.
4. Preparar 25 l de transcripción y traducción mezcla añadiendo 3 l de la pT7CFE1-Chis plásmido de ADN recombinante, 2 l de agua libre de nucleasa, 5 l de mezcla de reacción, 12,5 l de lisado de HeLa y 2,5 l de proteínas accesorias durante 1 a paso Junto Expresión IVT proteína humana para las plantillas de ADN.
5. Incubar la mezcla de reacción de la etapa 3.4 para 90 min a 6 horas a 30 ° C. Guarde los productos de traducción a -20 ° C.

4. Purificación de proteínas recombinantes expresadas

1. Añadir 75 l de tampón de purificación 1x a 25 l de producto de traducción para hacer 100 l de mezcla de purificación.
2. Añadir 100 l de resina quelante de níquel de 100 l de mixto de purificaciónUre. Lavar Ni-resina dos veces añadiendo 300 l de dH ₂ O y 300 l de tampón de unión. Vuelva a suspender la resina y se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min para eliminar el exceso de etanol.
3. Añadir 100 l de mezcla de purificación de la etapa 4,2 a 100 l de resina quelante de níquel e incubar la mezcla durante 60 min a TA.
4. Centrifugar la mezcla a 14.000 xg durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo etiquetado como "flujo a través".
5. Resina Lavar con 100 l de tampón de lavado 1x (imidazol 20 mM, NaH ₂ PO ₄ a pH 8, NaCl 2,5 M y dH ₂ O 250). Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo etiquetado "lavado". Repita el paso 4.5 en dos ocasiones.
6. Añadir 100 l de tampón de elución 1x (100 mM de imidazol, 250 mM Na ₂ PO ₄ a pH 8,0, 2,5 M NaCl y dH ₂ O) a la resina y se incuba durante 15 min. Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min. Hacer el paso de elución dos veces. Cadatiempo de recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga frescas y etiqueta como "eluato".
7. Después de la elución, se lava la resina dos veces como se describe en el paso 4.5. Tienda fluya a través, lavados y muestras de elución a -20 ° C o inferior. Resina debe almacenarse a 4 ° C. Utilice 30 l de cada muestra para SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia.

5. Coomassie (Bradford) de ensayo de proteínas ³⁴

1. Preparar soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) estándar con la concentración de 20 mg / ml (mezcla de 10 l de BSA (2 mg / ml) y 90 l de dH ₂ O), 40 mg / ml (mezcla de 20 l de BSA (2 mg / ml) y 80 l de dH ₂ O), 60 mg / ml (mezclar 30 l de BSA (2 mg / ml) y 70 l de dH ₂ O), 80 mg / ml (mezcla de 40 l de BSA (2 mg / ml) y 60 l de dH ₂ O), 100 g / ml (mezclar 50 l de BSA (2 mg / ml) y 50 l de dH ₂ O), 160 g / ml (mezcla de 80 l de BSA (2 mg / ml) y 20 l de dH₂ O) y 200 g / ml (100 l de BSA (2 mg / ml).
2. Medida 5 l de flujo a través, lavados y muestras de eluato de la etapa 4.7. Añadir 95 l de dH ₂ O.
3. Añadir 5 ml de reactivo de azul de Coomassie a las mezclas de los pasos 5.1 y 5.2. Cubrir los tubos con parafilm y se vórtice durante 10 segundos y luego se incuba durante 20 min a TA.
4. El uso de un espectrofotómetro, medir la densidad óptica (DO) a longitud de onda de 650 nm para los tubos de proteínas de paso 5.3. Concentración Parcela vs. lectura de DO para determinar las concentraciones de proteínas ^34.

6. Western Blotting

1. Añadir 5 l de extractos de esquizontes de P. falciparum, 2 l de Escherichia coli expresó rhOP-3 proteínas recombinantes ^31, 5 l de proteínas recombinantes expresadas usando 2-paso 1 y paso en sistemas de expresión in vitro humanos y 10 l de productos de proteína purificada utilizando el método de afinidad para separar los tubos.
2. Añadir tampón de muestra de electroforesis que contiene mercaptoetanol a cada tubo para un volumen final de 20 l para hacer muestras de proteínas solubilizadas. Hervir tubos durante 2 min.
3. Cargar muestras de proteínas solubilizadas en 10% en geles de SDS-PAGE para separar las proteínas.
4. Traslado proteínas separadas a partir de geles de SDS-PAGE a papel de nitrocelulosa (PNC) por electroforesis a 35 mA por gel en una cámara de Western Blot semi-seco durante 2 horas.
5. Bloquear PNC después de la transferencia con 2% de leche sin grasa.
6. Incubar bloqueado PCN con los siguientes anticuerpos policlonales diluidos 1: 100 en 2% de leche para realizar el Western Blot; anticuerpo de conejo # 676 ²¹ específico para P. rhoptries merozoitos falciparum, anticuerpos de ratón ²⁰ específicos para P. yoelii y P. rhoptries merozoitos berghei, antisueros # 685 específicos para el P. falciparum proteína vacuola parasitófora, SERA (rico antígeno serina) ²² y los anticuerpos específicos para el Maurer217; s de proteínas leporino PFMC-2 ™ ^28.
7. Incubar los PNC también en 1: 100 ratones y suero de conejo y de sobrenadante de cultivo gastado (SCS) a partir de células de mieloma SP2 como controles negativos normales diluidas.
8. Incubar los PNC con anticuerpos y controles a 4 ºC O / N.
9. Wash PCN 4x con tampón Blot e incubar PCN con especies anticuerpos secundarios específicos conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1: 1.000 en 2% de leche.
10. Lavar PNC 4x con tampón Blot. Incubar lavó PCN con la solución de desarrollo de color A + B (Solución A: añadir 50 ml de 1x Blot tampón y 30 l de H ₂ O _2; Solución B: añadir 10 ml de metanol y 30 mg de 3-cloro-naftol) para 30 min en la oscuridad. Analizar los resultados de Western blot colorimétricamente.

Results

Validación de las proteínas recombinantes expresadas a través de reactividad con anticuerpos específicos es un primer paso importante para confirmar el correcto plegamiento de las proteínas expresadas. Proteínas recombinantes malaria se expresaron mediante el paso y dos pasos en sistemas de expresión libre de células humanas in vitro. Las proteínas recombinantes son método de afinidad Ni-quelante purificada. A continuación, utiliza antisueros contra rhoptries merozoitos enteros en el Western Blot de SDS-PAGE de proteína...

Discussion

Los pasos importantes para la expresión con éxito de proteínas usando dos etapas en el sistema libre de células humanas in vitro la expresión y purificación son: 1) la amplificación y clonación de genes en pT7CFE-CHIS plásmido vector éxito; 2) la transcripción de ARN a ^{30 °} C; 3) la traducción de proteína a 30 ° C en presencia de inhibidor de RNasa; 4) el desarrollo del protocolo de purificación de afinidad basada usando perlas de resina recubiertas con Ni y 5) el análisis de resultados en western blot utiliz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de libre expresión de células humanas in vitro de 2 pasos	Thermo Fisher	88856	Descatalogado. Almacene siempre a -80 °C. No descongelar en agua tibia
paso in vitro sistema de traducción acoplado	Thermo fischer	88860	Almacenar siempre a -80 °C. No descongele en agua tibia
Sistema de purificación ProBond	Invitrogen	K850-01	Almacene en RT
Probond Resina quelante de níquel	Invitrogen	R801-01	Tienda a 4oC.
del Banco de Sangre		Sangre Humana	a las 4 °C.