Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos In Vitro

Resumen

Se presentan ensayos de alto rendimiento que, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para cuantificar la liberación neta de neutrófilos humanos.

Resumen

Los granulocitos neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana. Los neutrófilos son los primeros en llegar al sitio de la infección. Los neutrófilos desarrollaron varios mecanismos antimicrobianos, como la fagocitosis, la degranulación y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los NET consisten en un andamio de ADN decorado con histonas y varios marcadores de gránulos, como la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos humanos (HNE). La liberación de NET es un proceso activo que implica cambios morfológicos característicos de los neutrófilos que conducen a la expulsión de su ADN al espacio extracelular. Los tumores neuroendocrinos son esenciales para combatir los microbios, pero la liberación incontrolada de tumores neuroendocrinos se ha asociado con varios trastornos. Para aprender más sobre la relevancia clínica y el mecanismo de formación de NET, existe la necesidad de contar con herramientas confiables capaces de cuantificar NET.

Aquí se presentan tres métodos que pueden evaluar la liberación de NET de neutrófilos humanos in vitro. El primero es un ensayo de alto rendimiento para medir la liberación de ADN extracelular de neutrófilos humanos utilizando un tinte de unión al ADN impermeable a la membrana. Además, se describen otros dos métodos capaces de cuantificar la formación de NET mediante la medición de los niveles de los complejos MPO-DNA y HNE-DNA específicos de NET. Estos métodos basados en microplacas, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para estudiar de manera eficiente el mecanismo y la regulación de la formación de NET de neutrófilos humanos.

Introducción

La formación de NET es un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos luchan contra los patógenos. ¹ El núcleo de las redes electrónicas es el ADN nuclear. ¹ Esta red de ADN está asociada con proteínas granulosas de neutrófilos e histonas. ¹ La forma principal de formación de NET requiere la muerte de los neutrófilos caracterizada por la descondensación de la cromatina, la desaparición de las membranas granulares y nucleares, la translocación de la elastasa de los neutrófilos al núcleo, la citrulinación de las histonas y, finalmente, el derrame de NET basados en el ADN. ^{número arábigo} Los NET atrapan y matan una amplia va....

Protocolo

La Junta Institucional de la Universidad de Georgia Revisión aprobó el estudio de sujetos humanos para recoger la sangre periférica de voluntarios sanos (UGA # 2012-10769-06). ^5,7,8 voluntarios firmaron el consentimiento informado necesario antes de la extracción de sangre. La investigación realizada en este artículo está en conformidad con las directrices éticas para la investigación médica en seres humanos de la Declaración de Helsinki.

1. Aislamiento de los neutrófilos de sangre periférica humana (Figura 1)

Nota: Hay varias maneras de aislar los neutrófilos de sangre periférica. El siguiente protocolo proporciona una posibilidad. Este prot....

Resultados

Las cifras en este manuscrito se describe el método de aislamiento de neutrófilos, los procedimientos experimentales, y presentar los resultados representativos con la explicación de análisis de datos. La figura 1 muestra las etapas secuenciales de la preparación de neutrófilos humanos. Este protocolo representa sólo una manera posible de aislamiento de neutrófilos. Se produce grandes cantidades de neutrófilos en reposo capaces de liberar TNE a la estimulación. L.......

Discusión

TNE representan un fascinante nuevo mecanismo por el cual los neutrófilos matar los agentes patógenos. ¹ Aunque la literatura de los TNE ha sido cada vez más importante en los últimos diez años desde su descubrimiento, varias cuestiones importantes relacionadas con su papel en la biología, el mecanismo y la regulación siguen sin estar claros. metodología adecuada tiene que ser desarrollado para medir los TNE, este mecanismo antimicrobiano muy singular. Este artículo describe métodos que se pueden utilizar par.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Elastasa de neutrófilos antihumanos  Conejo Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x
recubierto Anti-mieloperoxidasa Ab (Conejo)	Millipore	07-496	1:2,000x
recubierto DNasa-1	Roche	10-104-159-001	1 µ g/ml utilizado para la digestión
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Detección de muerte celular ELISA Anti-DNA POD	Roche		11544675001 1:500x
Espectrofotómetro de microplacas Eon	Biotek
Gen5 Software de microplacas todo en uno	Biotek		(ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0,2% concentración final/volumen
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Uso 10 mM concentración final
1 M de glucosa	Sigma		Utilice 5 mM de concentración final.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final usado
Placa ELISA	Greiner bio-one	655061
Tubos cónicos 15 ml	Thermoscientific	339650
Tubos cónicos 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8,5-9,5)	Sigma	P 1644	Cloruro de sodio, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 medios	Corning Cellgro	17-105-CV
96 placa de ensayo de pocillo placa negra fondo transparente	Costar	3603