Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Resumen

Se presentan ensayos de alto rendimiento que, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para cuantificar la liberación neta de neutrófilos humanos.

Resumen

Los granulocitos neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana. Los neutrófilos son los primeros en llegar al sitio de la infección. Los neutrófilos desarrollaron varios mecanismos antimicrobianos, como la fagocitosis, la degranulación y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los NET consisten en un andamio de ADN decorado con histonas y varios marcadores de gránulos, como la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos humanos (HNE). La liberación de NET es un proceso activo que implica cambios morfológicos característicos de los neutrófilos que conducen a la expulsión de su ADN al espacio extracelular. Los tumores neuroendocrinos son esenciales para combatir los microbios, pero la liberación incontrolada de tumores neuroendocrinos se ha asociado con varios trastornos. Para aprender más sobre la relevancia clínica y el mecanismo de formación de NET, existe la necesidad de contar con herramientas confiables capaces de cuantificar NET.

Aquí se presentan tres métodos que pueden evaluar la liberación de NET de neutrófilos humanos in vitro. El primero es un ensayo de alto rendimiento para medir la liberación de ADN extracelular de neutrófilos humanos utilizando un tinte de unión al ADN impermeable a la membrana. Además, se describen otros dos métodos capaces de cuantificar la formación de NET mediante la medición de los niveles de los complejos MPO-DNA y HNE-DNA específicos de NET. Estos métodos basados en microplacas, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para estudiar de manera eficiente el mecanismo y la regulación de la formación de NET de neutrófilos humanos.

Introducción

La formación de NET es un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos luchan contra los patógenos. ¹ El núcleo de las redes electrónicas es el ADN nuclear. ¹ Esta red de ADN está asociada con proteínas granulosas de neutrófilos e histonas. ¹ La forma principal de formación de NET requiere la muerte de los neutrófilos caracterizada por la descondensación de la cromatina, la desaparición de las membranas granulares y nucleares, la translocación de la elastasa de los neutrófilos al núcleo, la citrulinación de las histonas y, finalmente, el derrame de NET basados en el ADN. ^{número arábigo} Los NET atrapan y matan una amplia variedad de microbios y son una parte esencial del repertorio de armas inmunes innatas. Sin embargo, la formación incontrolada de NET se ha relacionado con numerosas enfermedades autoinflamatorias. ^3,4 A pesar de su relevancia cada vez más establecida, se sabe poco sobre el mecanismo y la regulación de la liberación de NET.

Los neutrófilos que mueren por liberación de NETs son diferentes de los neutrófilos apoptóticos o necróticos. ^3,5 Los neutrófilos liberadores de NET muestran varias características que son características de la formación de NET. Los componentes de los gránulos están asociados con el ADN en los NET. ¹ La mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos humanos (HNE) se encuentran en gránulos primarios en las células en reposo, pero se translocan al núcleo para unirse al ADN en los NET. ¹ Los complejos MPO-DNA y HNE-DNA son específicos para los NETs, no ocurren en neutrófilos apoptóticos o necróticos. La descondensación de la cromatina ^1,3,5 es otra característica típica de NETosis. ^{número arábigo} La liberación de NET también requiere la citrulinación de las histonas por la peptidil aminidasa 4 (PAD4). ⁶ Las histonas citrulinadas son características distintivas de los neutrófilos que se sometieron a la liberación de NET. ⁶

Aquí se introducen tres métodos que, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para cuantificar NETs en una escala de alto rendimiento. El primer ensayo se ha utilizado en el campo con diferentes cambios y cuantifica la liberación de ADN extracelular en formato de microplaca. El segundo y tercer ensayo proporcionan la confirmación de los NET mediante la medición de los complejos MPO-DNA y HNE-DNA específicos de NET.

Protocolo

La Junta Institucional de la Universidad de Georgia Revisión aprobó el estudio de sujetos humanos para recoger la sangre periférica de voluntarios sanos (UGA # 2012-10769-06). ^5,7,8 voluntarios firmaron el consentimiento informado necesario antes de la extracción de sangre. La investigación realizada en este artículo está en conformidad con las directrices éticas para la investigación médica en seres humanos de la Declaración de Helsinki.

1. Aislamiento de los neutrófilos de sangre periférica humana (Figura 1)

Nota: Hay varias maneras de aislar los neutrófilos de sangre periférica. El siguiente protocolo proporciona una posibilidad. Este protocolo produce un gran número de neutrófilos no activadas humanos capaces de liberar TNE a la estimulación externa. Utilice 40 ml de sangre entera obtenida de voluntarios sanos por punción venosa. ^7,9

1. Alícuota de sangre 20 ml en dos tubos cónicos de 50 ml. Añadir 10 ml de dextrano al 6%. Mezclar suavemente.
2. Después de 20 minutos, la transferencia de leucocitos-rich fase superior sin tomar ninguna glóbulos rojos sedimentados en limpios de 50 ml tubos cónicos, y llenarlo con PBS estéril.
3. Centrifugar a 400 xg 10 min. Resuspender pellet en 4 ml de PBS estéril.
4. Preparar un 5 a paso Percoll gradiente de 85% -80% -75% -70% -65% en dos tubos de 15 ml cónicos y capa 2 ml de suspensión de leucocitos en la parte superior de cada gradiente.
5. Centrifugadora 800 xg durante 30 min con frenos estarán desactivados.
6. Recoge todas las células (neutrófilos) en las capas en el 75% / 80% y la interfaz 70% / 75%.
7. Lavar las células dos veces en PBS (350 xg, 10 min, RT) y contar las células usando un hemocitómetro.

2. Medición de la Cinética de ADN extracelular de liberación utilizando una microplaca Fluorimétrico

Nota: Este método permite la medición de cambios en la fluorescencia de una membrana impermeable al colorante indicativo de la liberación de ADN en un formato de microplaca de 96 pocillos de unión a ADN (Figura 2).

1. Preparar una suspensión de neutrófilos en medio de ensayo (HBSS +(V / v) 1% de suero autólogo + glucosa 5 mM) a una concentración de 2 x 10 ⁶ células / ml.
2. Añadir 5 mol / L del colorante de unión a ADN impermeable membrana. Mezclar suavemente.
3. neutrófilos humanos alícuota (50 l / pocillo) en 96 pocillos de fondo negro, transparente microplacas. Asegúrese de que el medio de ensayo cubre todo el fondo del pozo. Si no, toque suavemente la placa en el lateral.
4. Calentar los neutrófilos placa que contiene de 10 minutos a 37 ° C.
5. Mientras tanto preparar soluciones de estímulos al doble de sus concentraciones finales a utilizar (en 37 ° C medio de ensayo en caliente). Como control positivo neto utilizar los neutrófilos humanos con 100 nM de forbol-miristato-acetato (PMA) durante 4 horas para desencadenar la liberación máxima NET. ^5,8 estimulación de PMA durante 4 horas asegura la liberación máxima NET NET mientras que la formación espontánea sigue siendo baja ^5,8.
6. Preparar el fluorímetro de microplaca para la medición (4 hr, 37 ° C, 530 nm para la excitación y 590 nm para la emisión).
7. Estimular neutrófilos mediante la adición de solución de estímulo 50 l 50 l suspensiones de neutrófilos. Utilizar 0,5 mg / ml de saponina en un pocillo para medir la señal máxima de liberación de ADN.
8. Colocar la placa en el lector y medir los cambios en la fluorescencia durante 4 horas a cada 2 minutos sin agitación.
9. Para el análisis de datos, calcular los aumentos en la fluorescencia normalizados a través del tiempo.
   1. Restar de fluorescencia base de los valores de punto final para todos los pozos que incluye saponina (Figura 2A, B). Aumento de la fluorescencia saponina debe ser la señal más alta. Se conoce como "la liberación de ADN máxima" (Figura 2).
   2. Calcular los porcentajes de liberación de ADN en muestras desconocidas dividiendo los aumentos en la fluorescencia de muestras desconocidas por la liberación máxima de ADN.
   3. Los resultados promedio de las réplicas y los presentan como "% de la liberación máxima de ADN" (Figura 2C).

3. La cuantificación de la Forma NETación por MPO-ADN y ADN-HNE ensayos ELISA

Nota: Estos ensayos (MPO-ADN) modificado o establecido (HNE-ADN) en nuestro laboratorio cuantificar la formación neta midiendo los niveles de MPO-ADN y complejos de ADN ^HNE-5.

1. Escudo de 96 pocillos de alta unión a placas de ELISA de capacidad durante la noche con anticuerpos de captura (50 l / pocillo): anti-MPO (dilución 1: 2000) o anti-HNE (1: 2000).
2. Lavar las placas de ELISA tres veces con PBS (200 l / pocillo) y bloquearlas con BSA al 5% y albúmina de suero humano 0,1% durante 2 horas a RT (200 l / pocillo). Lavar tres veces con PBS.
3. neutrófilos semilla en microplacas de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células / pocillo en 100 l de medio de ensayo, y estimular la formación de NET. Se incuban las células: 4 h para 37 ° C.
4. Realizar una digestión DNasa limitada mediante la adición de 2 U de DNasa / ml de sobrenadante de neutrófilos, mezclarlos bien. Mantenerlos a temperatura ambiente.
5. Detener la DNasa después de 15 minutos mediante la adición de 11 l mM EGTA 25 (concentración final 2,5 mM). Mezclar bien. recoger supernatants en tubos de microcentrífuga limpios. muestras de giro para deshacerse de los restos de células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transferir sus sobrenadantes en tubos de microcentrífuga limpios. Mantenerlos en hielo hasta que esté listo.
6. Se utiliza una alícuota de un preparado previamente "estándar NET".
   Nota: El NET-estándar es una mezcla de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA obtenidos a partir de al menos 5 donantes humanos diferentes e independientes.
   1. Para utilizar el mismo estándar para un largo tiempo, recoger y alícuota un gran volumen de sobrenadantes de neutrófilos de cada donante individual. El cobro por ejemplo 2 ml de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA dará lugar a alícuotas de 200 (10 l cada uno) suficientes para 200 placas de ELISA. Datos que caracterizan el estándar NET se encuentran en la Figura 5.
   2. Estimular los neutrófilos humanos con PMA 100 nM durante 4 horas y aplicar DNasa digerir a sus sobrenadantes europea Según los pasos 3.4-3.5.
   3. Recoger, piscina, alícuota (10 l) y libresobrenadantes ze (-20 ° C) de neutrófilos.
   4. Para preparar el "NET-estándar", descongelar una alícuota / donante obtenida de al menos cinco donantes por separado, mezclar y mantenerlos en hielo.
   5. Desechar las muestras descongeladas y el uso de los frescos para el siguiente experimento.
   6. Preparar una dilución 1: 2 en serie de la red estándar en PBS + EGTA.
7. Diluir muestras digeridas-Dnase1 (estándar y los sobrenadantes desconocidos) 20 veces en PBS + EGTA y alícuota ellos en placas de ELISA recubiertas con anticuerpos de captura.
8. Incubar las placas de ELISA durante la noche a 4 ° C y los lavar tres veces con PBS.
9. Aplicar la solución de anticuerpo de detección (100 l / pocillo): peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo anti-ADN (1: 500, de ratón). Incubar durante 1 hora en la oscuridad.
10. Después de cuatro lavados con PBS añadir sustrato de peroxidasa TMB: 100 l / pocillo, 30 min. coloración azul es una indicación para la actividad de la peroxidasa (TNE) presentes.
11. Detener la reacción mediante la adición de 100 l / pocillo de HCl 1. lossoluciones azules se vuelven amarillas (Figura 5A).
12. Leer la absorbancia a 450 nm utilizando un fotómetro de microplacas.
13. Para el análisis de los datos, el cálculo de la cantidad de MPO-ADN o ADN-HNE complejos en comparación con el estándar NET.
    1. Restar el valor de densidad óptica de fondo del medio de ensayo de todas las muestras.
    2. Representar gráficamente los valores de absorbancia (eje X) de las muestras patrón diluidas en contra de su contenido neto relativo (eje Y) (Figura 5).
    3. El uso de la gama no saturado de esta curva estándar de establecer una línea de tendencia (utilizar mejor ajuste exponencial del software utilizado) (Figura 5). La ecuación de esta línea de tendencia determina la conversión de los valores de DO a lo cuantitativo cantidades de los TNE.
    4. Introduzca los valores de DO medidos de las incógnitas en la ecuación de la línea de tendencia de 3.13.3 que le dará la cantidad de TNE en la muestra desconocida como porcentaje del precio neto estándar (Figura 5A).
    5. Calcularpromedios de repeticiones (por triplicado) y presentar los datos finales como "cantidad de MPO-ADN o complejos de HNE-ADN (%) de la norma" (Figura 5C).

Resultados

Las cifras en este manuscrito se describe el método de aislamiento de neutrófilos, los procedimientos experimentales, y presentar los resultados representativos con la explicación de análisis de datos. La figura 1 muestra las etapas secuenciales de la preparación de neutrófilos humanos. Este protocolo representa sólo una manera posible de aislamiento de neutrófilos. Se produce grandes cantidades de neutrófilos en reposo capaces de liberar TNE a la estimulación. L...

Discusión

TNE representan un fascinante nuevo mecanismo por el cual los neutrófilos matar los agentes patógenos. ¹ Aunque la literatura de los TNE ha sido cada vez más importante en los últimos diez años desde su descubrimiento, varias cuestiones importantes relacionadas con su papel en la biología, el mecanismo y la regulación siguen sin estar claros. metodología adecuada tiene que ser desarrollado para medir los TNE, este mecanismo antimicrobiano muy singular. Este artículo describe métodos que se pueden utilizar par...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Elastasa de neutrófilos antihumanos  Conejo Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x
recubierto Anti-mieloperoxidasa Ab (Conejo)	Millipore	07-496	1:2,000x
recubierto DNasa-1	Roche	10-104-159-001	1 µ g/ml utilizado para la digestión
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Detección de muerte celular ELISA Anti-DNA POD	Roche		11544675001 1:500x
Espectrofotómetro de microplacas Eon	Biotek
Gen5 Software de microplacas todo en uno	Biotek		(ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0,2% concentración final/volumen
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Uso 10 mM concentración final
1 M de glucosa	Sigma		Utilice 5 mM de concentración final.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final usado
Placa ELISA	Greiner bio-one	655061
Tubos cónicos 15 ml	Thermoscientific	339650
Tubos cónicos 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8,5-9,5)	Sigma	P 1644	Cloruro de sodio, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 medios	Corning Cellgro	17-105-CV
96 placa de ensayo de pocillo placa negra fondo transparente	Costar	3603

Herramienta analítica