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Artículo de método

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de

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⸱

DOI:

10.3791/52788

⸱

21 de abril de 2015

 , 
1Microbiology Doctoral Training Program, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la generación y obtención de imágenes de una infección bacteriana localizada en la vesícula ótica del pez cebra.

Resumen

El patógeno acuático, Streptococcus iniae, es responsable de más de 100 millones de dólares en pérdidas anuales para la industria de la acuicultura y es capaz de causar enfermedad sistémica en ambos peces y los seres humanos. Una mejor comprensión de S. iniae patogénesis de la enfermedad requiere un sistema modelo apropiado. La maleabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas tempranas del desarrollo de pez cebra permiten la generación y proyección de imagen no invasiva de las líneas transgénicas con marcados fluorescentemente células inmunes. El sistema inmune adaptativo no es completamente funcional hasta varias semanas después de la fecundación, pero las larvas de pez cebra tienen un sistema inmune innato vertebrados conservadas con neutrófilos y macrófagos. Por lo tanto, la generación de un modelo de infección de larvas permite el estudio de la contribución específica de la inmunidad innata en el control de S. infección iniae.

El sitio de microinyección determinará si hay una infecciónsistémica o localizada inicialmente. A continuación, presentamos nuestros protocolos para inyección vesícula ótica de pez cebra edad de 2-3 días después de la fecundación, así como las técnicas de imagen confocal de fluorescencia de la infección. Un sitio de infección localizada permite la observación de la invasión inicial microbio, el reclutamiento de células huésped y la difusión de la infección. Nuestros resultados utilizando el modelo de larvas de pez cebra de S. infección iniae indican que el pez cebra puede ser usado para examinar las diferentes contribuciones de los neutrófilos y los macrófagos de acogida en las infecciones bacterianas localizadas. Además, se describe cómo photolabeling de las células inmunes puede ser usado para rastrear el destino de la célula huésped individual durante el curso de la infección.

Introducción

Streptococcus iniae es un importante patógeno acuático que es capaz de causar enfermedad sistémica en peces y seres humanos 1. Aunque S. iniae es responsable de grandes pérdidas en el sector de la acuicultura, también es un potencial patógeno zoonótico, capaces de causar enfermedad en huéspedes humanos inmunocomprometidos con patologías clínicas similares a las causadas por otros patógenos humanos estreptocócicas. Habida cuenta de sus similitudes con patógenos humanos, es importante para estudiar S. iniae patogénesis de la enfermedad en el contexto de un huésped natural. Un modelo de pez cebra adultos de S. infección iniae reveló la infiltración de leucocitos robusta host al sitio localizado de infección, así como un rápido tiempo de acoger la muerte, un tiempo demasiado corto para involucrar al sistema inmune adaptativo 7. Con el fin de obtener una mirada en profundidad sobre la respuesta inmune innata a S. iniae infección in vivo, es necesario utilizar un modelo que es más susceptible de nen invasiva de imágenes en directo.

El larvas de pez cebra tiene una serie de ventajas que lo hacen un modelo vertebrado cada vez más atractivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El pez cebra son relativamente barato y fácil de usar y de mantener en comparación con los modelos de mamíferos. La inmunidad adaptativa no es funcionalmente maduro hasta 4-6 semanas después de la fecundación, pero las larvas tienen un sistema inmune innato de vertebrados muy conservada con complemento, receptores tipo Toll, citocinas y los neutrófilos y macrófagos con capacidades antimicrobianas incluyendo la fagocitosis y el estallido respiratorio 2-6, 8-11. Además, la tratabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas embrionarias y larvarias de desarrollo permiten la generación de líneas transgénicas estables con las células inmunes marcados con fluorescencia por lo que es posible examinar la interacción huésped-patógeno en tiempo real en vivo. La generación de estas líneas transgénicas utilizando una proteína fotoconvertible tales como DenDRA2 permite el seguimiento de origen célula huésped individual y el destino en el transcurso de la infección 12.

Cuando se desarrolla un modelo de infección de larvas de pez cebra, el sitio elegido de microinyección determinará si una infección es inicialmente localizado o sistémico. Infecciones de la sangre sistémica en la vena caudal o conducto de Cuvier son los más utilizados para estudiar los patógenos microbianos en el pez cebra y son útiles para el estudio de las interacciones entre el huésped y las células microbianas, las respuestas de citoquinas, y las diferencias en la virulencia entre cepas de patógenos. Para los microorganismos de crecimiento más lento, inyección temprana en el saco vitelino de un embrión en la etapa de 16-1,000 célula puede ser usado para generar una infección sistémica 13,14, con la etapa de desarrollo óptimo para la microinyección de un microorganismo de crecimiento lento encontrado que entre la etapa de 16-128 células 15. Sin embargo, la yema inyecciones saco de muchos microbios en las etapas posteriores del desarrollo de acogida tienden a ser letal en tél huésped debido al medio ambiente rico en nutrientes para el microbio y la falta de infiltración de leucocitos 16-18.

Una infección localizada generalmente resulta en la migración dirigida de los leucocitos hacia el sitio de la infección que puede ser fácilmente cuantificó con imagen no invasiva. Este tipo de infección puede permitir para la disección de los mecanismos que median la migración de leucocitos así como la investigación de diferentes capacidades migratorias y fagocíticas de diversas poblaciones de leucocitos. Las infecciones localizadas también son útiles al examinar las diferencias de virulencia entre las cepas bacterianas, así como el estudio de los mecanismos de invasión de microbios ya que las barreras host físicos deben ser cruzados por una infección localizada para convertirse en sistémica. El pez cebra se eleva típicamente a temperaturas de 25-31 ° C 19, sino que también puede mantenerse a temperaturas tan altas como 34-35 ° C para los estudios de la invasividad de ciertos patógenos humanos con requisitos estrictos de temperaturapara la virulencia 20, 21.

Muchos sitios diferentes se han utilizado para generar una infección bacteriana localizada inicialmente como el ventrículo cerebro posterior 22, músculo dorsal de la cola 18, cavidad pericárdica 23, y vesícula ótica (oreja) 5, 16, 24. Sin embargo, se ha encontrado que la inyección de bacterias en el músculo de la cola puede causar daños en los tejidos y la inflamación independiente de las bacterias, que pueden sesgar los resultados en la investigación de la respuesta de leucocitos 13. Aunque menos daño está asociado con la inyección en el cerebro posterior y aunque es inicialmente desprovista de leucocitos en los embriones jóvenes, el ventrículo rombencéfalo gana constantemente más células inmunes con el tiempo como microglia toman la residencia. El ventrículo posterior del cerebro es también un lugar más difícil de imagen. La vesícula ótica es una cavidad hueca cerrada, sin acceso directo a la vasculatura 25, 26. Es normalmente desprovista de leukocytes, pero los leucocitos pueden ser reclutados a la vesícula ótica en respuesta a estímulos inflamatorios, como la infección. También es un sitio preferido de la microinyección de bacterias en 2-3 días de edad después de la fertilización de pez cebra (dpf) debido a la facilidad de formación de imágenes y la visualización de la inyección. Por lo tanto, se optó por la vesícula ótica como nuestro lugar de la infección bacteriana localizada.

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Protocolo

Adultas y embrionarias pez cebra se mantuvieron de acuerdo con la Universidad de Wisconsin-Madison Centro de Investigación de Recursos Animales.

1. Preparación de microinyección Needles

  1. Preparar agujas de inyección capilar de vidrio de pared delgada (1,0 OD / 0.75 ID) utilizando un dispositivo extractor de micropipeta con los siguientes valores: presión de aire 200, de calor 502, tirar 90, velocidad 80, hora 70, tiempo en el aire en el arranque de la tracción 5, tiempo en el aire al final de la tracción 5.
  2. Utilizando pinzas finas, rompa la punta de la aguja retirado de manera que la abertura de la punta tiene un diámetro de aproximadamente 10 micras.

2. la preparación de platos de inyección de larvas

  1. Enjuague un peine de gel con ancho de carril de aproximadamente 4.5 mm de agua estéril y dejar secar.
  2. Preparar una solución de agarosa de fusión alto 1,5-2% en medio E3 19 y microondas hasta que la solución es clara. Una vez enfriado, se vierte algunos de la agarosa en una placa de Petri (100 x 15 mm) y remolino,añadiendo suficiente de agarosa para cubrir completamente el fondo del plato.
  3. Una vez que la capa de agarosa se ha solidificado, colocar el peine gel se enjuaga y se seca en la parte superior de manera que el extremo no peinado se acaba descansando en la parte superior de la placa de Petri y el extremo peinado está en contacto con la agarosa. Asegúrese de que el peine es lo más horizontal posible, creando un ángulo de 30 ° con respecto a la capa de agarosa al fondo.
  4. Verter una pequeña cantidad adicional de agarosa en la interfaz entre el peine y la capa de agarosa parte inferior de modo que la capa de agarosa fresca cubre los pocillos de la peine. Deje que se enfríe por completo antes de retirar el peine. Usando una punta de pipeta, retire los trozos colgantes de agarosa de los pozos.
  5. Verter medio E3 en la parte superior del molde de inyección y se almacena a 4 ° C.
  6. Antes de cada uso, cambie con medianas y de inyección caliente rampas frescas a 28,5 ° C durante al menos una hora antes de la inyección.
  7. Inmediatamente antes de las inyecciones, reemplazar el E3 en la rampa de inyección conE3 medio que contiene 200 mg / ml de acetato de 3-aminobenzoato (tricaína).

3. Preparación S. iniae inóculo

  1. Preparar y esterilizar en autoclave medio de caldo Todd Hewitt suplementado con 0,2% de extracto de levadura y 2% de peptona proteosa (THY + P): 30 g / L Todd Hewitt, 2 g / L de extracto de levadura, 20 g / L de peptona proteosa. Para placas de agar, añadir 14 g / L de agar.
  2. Preparar cultivos bacterianos la noche antes de las infecciones por pipetear una parte alícuota de 100 l de stock bacteriana congelado en 10 ml de THY + P caldo en un tubo sellado 15 ml. Incubar toda la noche sin agitación a 37 ° C. Después de 14 a 16 h de crecimiento, utilice el cultivo durante la noche, ya sea para hacer las reservas del congelador o preparar para su uso en inyecciones.
  3. Hacer las existencias del congelador mediante la colocación de 1 ml del cultivo durante la noche en 500 l de 80% de glicerol en un tubo de 1,7 ml de centrífuga. Para evitar los ciclos de congelación-descongelación, hacer 100 l de un solo uso alícuotas de esta mezcla y se almacena a -80 ° C.
  4. Para S. iniae utiliza en infections, diluir el cultivo durante la noche 1: 100 para un volumen total de cultivo de 10 ml mediante la adición de 0,1 ml de cultivo durante la noche a 9,9 ml de THY + P caldo. Crece a 37 ° C sin agitación durante aproximadamente 4-5 horas. Monitorear la densidad óptica (DO) a 600 nm utilizando un espectrofotómetro Nanodrop y cosechar las bacterias en fase logarítmica media cuando la DO600 nm alcanza 0,250 a 0,500. Una DO600 nm de 0,250 corresponde a aproximadamente 10 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml.
  5. Pellet 1 ml del cultivo bacteriano en un tubo de 1,7 ml se centrifuga a 1500 xg durante 5 min. Resuspender en 1 ml de PBS fresco y de repetición. Medir la DO600 nm de las bacterias en PBS, pellet, y resuspender en PBS para alcanzar la concentración deseada.
  6. Para ayudar en la visualización de la microinyección, añadir rojo de fenol a las suspensiones bacterianas antes de la inyección para una concentración final de 0,1%.
  7. Para los experimentos que implican la inyección de bacterias muertas por calor, calentar las bacterias en PBS a 95 ° C durante 30 min.Confirmar que el proceso para matar calor redujo el número de bacterias viables hasta niveles indetectables mediante siembra de un volumen de inyección (aproximadamente 1 nl) en THY sólido + P placas de agar e incubar durante la noche a 37 ° C.

4. Etiquetado S. INIA e con un CellTracker rojo fluorescente del tinte

  1. Para etiquetar las células bacterianas de estar, preparar una solución stock de un colorante fluorescente CellTracker o equivalente. Como el colorante usado viene en 20 x 50 g alícuotas de polvo y necesita ser resuspendieron en DMSO, añadir 7,3 l DMSO al tubo para obtener una concentración stock de 10 mM.
  2. Prueba de una gama de concentraciones de colorante (por ejemplo, 0,5-25 mM) sobre las bacterias para determinar la concentración óptima más bajo que tiñe las células. Las células se dividen rápidamente y experimentos más largos pueden requerir una mayor concentración de colorante.
    1. Pellet 1,0 ml de cultivo bacteriano en un tubo de 1,7 ml por centrifugación como se describió anteriormente (sección 3). Resuspender el precipitado en 1ml de PBS fresco y añadir el volumen apropiado de medio de contraste para el cultivo bacteriano.
    2. Incubar sin agitación a 37 ° C durante 30 min. Centrifugar las bacterias y resuspender en 1 ml de pre-calentado caldo THY + P y se incuba sin agitación durante 30 minutos adicionales a 37 ° C.
    3. Centrifugar las bacterias y lavar dos veces en PBS antes de medir la DO600 nm y diluyendo las bacterias para la microinyección como se detalló anteriormente (sección 3). Normalmente nos inyectamos aproximadamente 100 UFC en 1 volumen de inyección nl para nuestros estudios de reclutamiento de leucocitos y la fagocitosis.

5. Preparación de pez cebra larvas de Infecciones

  1. Configure parejas reproductoras de la noche anterior y recoger los embriones según lo descrito por Rosen et al. 27 embriones se incuban en medio E3 a 28,5 ° C hasta que esté listo para infectar.
  2. Para pez cebra que se fotografiada, prevenir el desarrollo de pigmento (melanization) mediante la adición de N-feniltiourea (PTU) a laMedio E3 a 24 h después de la fecundación (HPF) para una concentración final de 0,2 nM.
  3. Para las infecciones con embriones de edad 2 dpf, embriones dechorionate manualmente con un par de pinzas finas. Alternativamente, los embriones dechorionate mediante la eliminación de E3 y la sustitución con pronasa (2 mg / ml) durante aproximadamente 5 minutos o hasta que pipeteo suave rompe embriones fuera del corion. La mayoría de las larvas deberían haber tramado naturalmente por 3 dpf.
  4. Anestesie pez cebra varios minutos antes de la infección mediante la colocación de larvas dechorionated en el medio de E3 que contiene 200 mg / ml tricaína.

6. Otic Vesícula La inyección de S. iniae en Tres Días Viejo larvas

  1. Encienda el microinyector y establecer el rango de tiempo para "milisegundos". Abrir la válvula en el tanque de dióxido de carbono para permitir que el gas en la línea. La presión de la microinyector debe leer aproximadamente 20 PSI. Ajuste la presión en la unidad microinyector por las agujas del reloj de inflexión de la perilla estriada negro para incraliviado la presión o en sentido contrario de giro para disminución de la presión.
  2. Vortex el S. preparado cultura iniae en rojo fenol y PBS y utilizar una punta microloader para cargar 2.3 l de la cultura en una aguja de inyección capilar tirado.
  3. Montar la aguja cargada en un micromanipulador conectado a un soporte magnético y la posición debajo de un microscopio estereoscópico de manera que la aguja esté en un ángulo aproximado de 45-65 ° con respecto a la base del microscopio.
  4. Pulse en el pedal del microinyector para dispensar una gota de inóculo en la punta de la aguja. Medir el diámetro de la gota usando la barra de escala en la lente ocular del microscopio.
    1. Alternativamente, estimar el diámetro de la gota mediante la inyección de un volumen en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio con una barra de escala. El diámetro de la gota debe ser de aproximadamente 0,10 mm, que es aproximadamente un volumen de 1 nl.
    2. Ajuste el tamaño de la gota ajustando la configuración de la duraciónla microinyector o por el recorte de más de la punta de la aguja con unas pinzas finas. Tenga en cuenta que el tiempo de inyección debe ser de entre 20 - 35 mseg para evitar causar demasiado daño tisular.
  5. Usando una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de 12 anestesiaron las larvas en cada pocillo del molde de inyección.
  6. Usar una varilla de vidrio, bucle de cabello, o punta de plástico para colocar suavemente las larvas para que las cabezas apuntan hacia la parte posterior del microscopio y los sacos de yema de huevo se contra el lado izquierdo del pozo. El punto de la oreja izquierda de la larva hacia el techo.
  7. Mirando a través de la lente ocular del microscopio estereoscópico, utilice los mandos en el micromanipulador para alinear la aguja cargada con la vesícula ótica para que ambos están en el mismo campo de visión. Pierce la capa epitelial externa de la vesícula ótica con la punta de la aguja de modo que la punta de la aguja es justo dentro de la vesícula.
  8. Pulse en el pedal de pie para inyectar 1 nl de la dosis deseada de S. iniae. Asegúrese de utilizar unbaja presión suficiente para no romper la cavidad. Si la inyección es exitosa, la vesícula ótica, pero no el tejido circundante, deben llenar con el fenol rojo inóculo (Figura 1 Ai). Quitarse de inmediato toda pescado mal inyectado desde la placa de inyección.
  9. Retraer con cuidado la aguja de la larva y mover la placa de inyección con la mano para que la próxima larva está a la vista. Haga esto con una lupa 5X.
    Nota: La retracción de la aguja puede dar lugar a la deposición de algunas bacterias fuera de la vesícula ótica, que pueden sesgar la supervivencia y el reclutamiento de leucocitos resultados. Para evitar esto, se recomienda para inyectar bacterias marcados con colorante fluorescentes y visualmente escanear larvas se inyecta bajo un microscopio de fluorescencia para eliminar cualquier larvas donde esto ha ocurrido. Una larva inyecta correctamente se muestra en la (Figura 1 Bi).
  10. Para asegurar el volumen de inyección / inóculo sigue siendo la misma en el transcurso del experimento, inyectar una gota de las s bacterianasUSPENSIÓN en un tubo de 1,7 ml de centrífuga que contiene 100 l de PBS estéril después de cada 48ª embrión. Placa de los 100 l en placas de agar THY + P a 37 ° C durante la noche para determinar la CFU en el volumen de inyección.
  11. Cuando se ha inyectado todo el grupo de 12 larvas en la rampa de inyección, utilizar cuidadosamente una pipeta de transferencia de plástico para eliminar las larvas de los pocillos y colocarlos en una nueva placa de Petri (35 x 10 mm 2). Retire la solución tricaína y reemplazar con aproximadamente 2 ml de medio E3 fresco para permitir que las larvas se recupere.
  12. Pipetear inyecta larvas en los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y se incuba a 28,5 ° C. Monitorear las larvas en el tiempo de supervivencia en estas placas o eliminar más adelante para el recuento de imágenes o UFC.

7. Negro Sudán tinción de neutrófilos

Nota: Los siguientes pasos se pueden realizar a temperatura ambiente en una pequeña placa de Petri (35 x 10 mm 2) en un agitador orbital a menos otherwise declaró. Para cada paso, la cantidad de reactivo utilizado es de aproximadamente 2 ml por placa, utilizando sólo lo suficiente de líquido para cubrir completamente las larvas.

  1. Para la fijación de larvas infectadas, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para eliminar medio E3 y reemplazarlo con un 4% de paraformaldehído helada en solución de PBS. Colocar inmediatamente el pescado a 4 ° C para la eutanasia. Fijar la noche a 4 ° C.
  2. Lavar 3 veces en PBS durante 5 min cada uno.
  3. Mancha con Negro Sudán (0,18% stock diluido 1: 5 en 70% de etanol, 0,1% de fenol) durante 30 min a 5 h. Utilice un microscopio estereoscópico para comprobar si gránulos de los neutrófilos han asumido la mancha.
  4. Realizar una serie de 5 min lavados a partir de un único lavado en etanol al 70% seguido de un único lavado de una relación de 1: 1 de etanol al 70% y PBS, seguido de un lavado final en PBS.
  5. Rehidratar en PBS más 0,1% de Tween (PBT).
  6. Para borrar el pigmento de las larvas, lavar en hidróxido de potasio / 1% de peróxido de hidrógeno al 1% durante aproximadamente 6-10 min. Supervisar el Closel muestray, y después de unos 5 minutos, comprobar las larvas bajo un microscopio estereoscópico para ver cuánto del pigmento se ha compensado. Si la solución se deja demasiado tiempo, las bolsas de la yema se hinchan y se rompen.
  7. Lavar 3 veces durante 5 minutos cada uno en PBS.
  8. Almacenar las muestras en PBS o PBT a 4 ° C durante un máximo de 1 semana hasta que esté listo para la imagen y contar.
  9. Para imagen manchada-Negro Sudán larvas, transferir el pescado en PBT y luego en el 80% de glicerol y colocar en una sola diapositiva depresión cavidad. Posición fija larvas bajo un microscopio estereoscópico con una punta de pipeta. Image usando una cámara digital de color en un estereomicroscopio (Figura 1 Aii-iv).

8. La enumeración de bacterias viables de larvas infectadas

  1. La eutanasia a las larvas en los momentos deseados después de la infección en una solución de 200-300 mg / L enfriada con hielo de tricaína en un medio de E3.
  2. Pipet eutanasia larvas en 1,7 ml tubos de centrífuga. Retire la solución tricaína y reemplazar con 100 l de 0,2%Triton X-100 en PBS (PBSTx).
  3. Homogeneizar larvas pasando arriba y hacia abajo 10 veces a través de una aguja de 27 G.
  4. Preparar diluciones seriadas de homogeneizados en PBS estéril. Por ejemplo, si la dosis infecciosa es 100 CFU, pipeta 100 l de homogeneizado en 900 l de PBS estéril. Usando una nueva punta de pipeta, transferir 100 l de homogeneizado diluido en 900 l de PBS estéril.
  5. Placa 100 l de las diluciones en agar Columbia CNA para el aislamiento selectivo de bacterias gram-positivas, y se incuba a 37 ° C durante 48 horas. Este medio proporcionará una mayor selección de las placas de agar THY + P, que apoyarán el crecimiento de las bacterias gram-negativas y gram-positivas.
  6. En las placas con menos de 500 colonias individuales, contar el número de colonias y se multiplica por el factor de dilución para determinar el número de CFU.

9. La fijación de las larvas de la Imagen

  1. Fijar las larvas en un 4% de paraformaldehído helada en solución PBS como dedescrito en la sección 7.
  2. A temperatura ambiente, se lava 3 veces durante 5 min cada uno en PBS antes de formación de imágenes.

Preparación 10. de larvas de imágenes en vivo

  1. Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% en E3 calentando en el microondas hasta que la solución es clara.
  2. Coloque solución de agarosa en un 55 ° C baño de agua para que se enfríe, pero no se endurezca.
  3. Añadir tricaína a la agarosa a una concentración final de 0,016%.
  4. Con una pipeta de transferencia de plástico, coloque 4-5 larvas anestesiado en un plato con fondo de cristal en el escenario de un microscopio estereoscópico.
  5. Retire la tricaína y solución de agarosa del baño de agua a 55 ° C y dejar enfriar a temperatura ambiente durante 1-2 minutos. Mientras que la agarosa se está enfriando, eliminar la mayor cantidad de líquido de las larvas anestesiado posible.
  6. Verter la agarosa enfriada en el plato hasta aproximadamente la mitad de la superficie está cubierta. Agitar el plato para difundir la agarosa. Tenga en cuenta que si la agarosaes demasiado caliente, se matan las larvas. Además, si demasiado agarosa se añade al plato, la lente del objetivo del microscopio puede golpear la parte inferior del plato cuando se enfoca a través de la agarosa.
  7. Con una pipeta de transferencia, recoger las larvas que han flotado a los lados del plato y pipeta de nuevo en el centro.
  8. Bajo el microscopio estereoscópico, coloque suavemente las larvas como se desee con un lazo de pelo, una punta de pipeta largo o una varilla de vidrio. Para obtención de imágenes de la vesícula ótica, posicionar las larvas de manera que la vesícula ótica izquierda es plana contra la parte inferior del plato.
  9. Deje enfriar la agarosa durante unos 10 minutos antes de mover el plato. Las larvas pueden cambiar de posición si la agarosa no es sólida. Pipetear suavemente algunos tricaína y la solución de E3 a la parte superior de la capa de agarosa para mantenerlo húmedo.

11. Confocal Imaging de la infección

  1. Coloque el plato de fondo de vidrio con larvas en el escenario de un microscopio invertido con un escaneo láser confoca-FV 1000l sistema.
  2. Ajuste el agujero de alfiler a 200-300 micras y usando una apertura numérica 0.75 / 20X lente del objetivo, fijado z-pilas con 3-6 micras rodajas.
  3. Utilice la exploración línea continua para ajustar la ganancia de potencia láser y el detector para cada canal.
  4. Usando análisis de la línea secuencial para cada canal de fluorescencia (por ejemplo, 488 y 543 nm) y de contraste de interferencia diferencial (DIC), llevar a cabo una película de lapso de tiempo de la vesícula ótica izquierdo cada 3 min para 2-6 hr para observar el reclutamiento inicial y la fagocitosis por los neutrófilos y macrófagos. Para los cursos de tiempo más largos, coloque una tapa en la placa de Petri para evitar la evaporación y secado de la agarosa.
  5. Adquirir imágenes fijas de fijo (Figura 1B) o en vivo (Figura 2) larvas en 20X o 40X.

12. Fotoconversión de marcado con Dendra2 leucocitos en la vesícula ótica

Nota: Dendra2 puede photoconverted de verde a fluorescencia rojapor enfocar un láser 405 nm (50-70% de la potencia de láser debe ser suficiente) en la región de interés (ROI) durante 1 min. A continuación se muestra el protocolo paso a paso utilizado para el sistema FV-1000 confocal de barrido láser:

  1. Visualice la muestra usando una exploración z-stack con los 488 nm y 543 nm láseres. Utilice la exploración línea continua para ajustar la ganancia de potencia del láser y el detector. Asegúrese de que no hay fluorescencia roja photoconverted accidentalmente.
  2. En la ventana "Control de imagen de adquisición", bajo "Estímulo Setting" seleccione la herramienta "Uso del escáner" y seleccione "principal". Seleccione el láser de 405 nm y la puso en el poder el 70%. Utilizando la opción de círculo, definir el retorno de la inversión en la vesícula ótica.
  3. En "Estímulo Inicio Configuración", seleccione "Activación en serie" con una activación previa de 1 marco y un tiempo de activación de 60 000 ms. En la ventana de "Adquisición Setting" bajo el "tiempo de escán de la partida", elija 2 enintervalos de 00:01:00 (uno para pre y uno para fotoconversión post-).
    Nota: Después de la exploración serie lapso de tiempo se ha completado, el Dendra2 debería haberse photoconverted a su estado fluorescente de color rojo.
  4. Analiza la muestra por un z-pila usando el 488 nm y 543 nm láser para visualizar la fluorescencia roja photoconverted así como cualquier fluorescencia verde restante (Figura 3).

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Resultados

La microinyección de S. iniae en la vesícula ótica (Figura 1 y Figura 2) resulta en una respuesta del huésped localizado inicialmente. Cuando se inyecta correctamente, las bacterias sólo deben verse en la vesícula ótica y no en el tejido circundante o de la sangre. Esto puede ser visualizado durante la microinyección usando fenol colorante rojo (Figura 1A). Alternativamente, si se inyectan bacterias marcadas, un análisis rápido de las larvas infectadas publicar...

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Discusión

El método de infección utilizado aquí es útil para el estudio de la respuesta inmune del huésped a una infección localizada inicialmente en 2-3 embriones y larvas dpf. El enfoque de un estímulo inflamatorio, como una infección, en una cavidad cerrada, como la vesícula ótica permite el estudio de neutrófilos y macrófagos quimiotaxis y la fagocitosis. Una advertencia de la inyección de bacterias en la vesícula ótica es que la capacidad de los neutrófilos para fagocitar eficazmente las bacterias en cavidades llenas de líqu...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio para el cuidado y mantenimiento de pez cebra. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, Premio Nacional de Servicio de Investigación A155397 a EA Harvie y NIH R01GM074827 a Anna Huttenlocher.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,7 ml EppendorfsMidSciAVSS1700
14 ml Tubo FalconBD Falcon352059
27 G x ½ pulg. agujaBD Biosciences305109
Placa de 96 pocillosCorning Incorporated3596
AgarBD Biosciences214030
CellTracker Sondasmoleculares rojas, InvitrogenC34552
CNA agarDot Scientific, Inc7126A
Pipetas de transferencia desechablesFisher Scientific13-711-7m
Visor de disecciónNikonSMZ745
DMSOSigma AldrichD2650
Etanol 200 a pruebaMDS2292
Pinzas finas Science Tools11251-20
Peine de gelVWR27372-4824,2 mm de ancho, 1,5 mm de grosor
PlatosHecho a medida perforando un orificio de 16 a 18 mm en el centro de un fondo de placa de cultivo de tejidos de 35 mm y colocando un cubreobjetos redondo #1 de 22 mm en el orificio y sellando con una fina capa de adhesivo óptico Norland 68 curado con luz ultravioleta.
GlicerolFisher ScientificG33-4
Agarosa de alto punto de fusiónDenville Scientific, Inc.CA3510-6
Peróxido de hidrógenoFisher ScientificH325
Microscopio confocal de barrido láserOlympuscon sistema
Agarosa de bajo punto de fusiónFisherBP165-25
Soporte magnéticoTritech (Narishige)GJ-1
Sistema de microinyecciónParkerPicospritzer III
Puntas de pipeta con microcargadorEppendorf930001007
MicromanipuladorTritech (Narishige)M-152
Extractor de micropipetasSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeterThermo ScientificND-1000
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma AldrichP7629
ParaformaldheydeElectrónica Microscopy Sciences15710
Placas de PetriFisher ScientificFB0875712 100 x 15 mm
PhenolSigma AldrichP-4557
Phenol RedRicca Chemoical Company572516
Solución salina tamponada con fosfatoFisher ScientificBP665-1
Hidróxido de potasioSigma AldrichP-6310
PronaseRoche 165921
Peptona proteasaFluka Biochemika29185
Placa de cultivo de células pequeñasCorning Incorporated43016535 x 10 mm
Sudán NegroSigma AldrichS2380
Agujas de inyección capilar de vidrio de pared delgadaWorld Precision Instruments, Inc.TW100-3
Todd HewittSigma Aldrich/Fluka AnalyticalT1438
Tricaína (3-aminobenzoato de etilo)Argent Chemical Laboratory/FinquelC-FINQ-UE-100G
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Extracto de levaduraFluka Biochemika92144
con fondo de vidrio FV-1000

Referencias

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