Aquí demostramos los métodos más eficientes para congelar, incrustar, crioseccionar y teñir biopsias musculares para evitar la congelación de artefactos.
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Artículo de método
Qué hacer y qué no hacer en la preparación de Muscle criosecciones de Análisis histológico
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Resumen
Resumen
La evaluación histológica de las biopsias musculares ha servido como una herramienta indispensable en la comprensión del desarrollo y la progresión de la patología de los trastornos neuromusculares. Sin embargo, con el fin de hacerlo, el cuidado apropiado debe ser tomado cuando la escisión y la preservación de los tejidos para lograr tinción óptimo. Uno de los métodos de conservación de tejidos implica la fijación de tejidos en formaldehído y luego incrustarlos con cera de parafina. Este método preserva la morfología bien y permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente pero es engorroso y requiere la manipulación de productos químicos tóxicos. Además, los resultados de fijación en formol antígeno entrecruzamiento, lo que requiere protocolos de recuperación de antígeno por inmunotinción eficaz. Por el contrario, seccionado congelado no requiere la fijación y por lo tanto retiene conformación antígeno biológica. Este método también proporciona una clara ventaja en vuelta rápida alrededor del tiempo, por lo que es especialmente útil en situaciones que requieren evaluación histológica rápida como intraoperaTIVE biopsias quirúrgicas. A continuación se describe el método más eficaz de preparar biopsias musculares para la visualización con diferentes tinciones histológicas e inmunológicas.
Introducción
El examen de histología muscular juega un papel crítico en la comprensión de los diferentes tipos de trastornos neuromusculares 1-4. Cuando se combina con otras técnicas, permite a los investigadores para obtener una mejor idea de la manifestación y la progresión de la patología y también pueden ser esenciales para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica 5-10. Sin embargo, para ser precisos, los tejidos necesitan ser conservado en la manera apropiada a fin de preservar el estado fisiológico inmediatamente antes de la escisión. Esto requiere gran cuidado durante la extracción, preservación, seccionamiento y tinción.
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Protocolo
1. Tejido Cosecha y congelación de los tejidos musculares
- La eutanasia del ratón con una sobredosis de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Realice este paso en una campana de extracción y el uso de un método de contención secundaria, como un secador o una campana de vidrio que contiene un hisopo de algodón empapado en isoflurano.
- Confirmar la muerte apretando firmemente la almohadilla plantar. Use un método secundario de la eutanasia como la dislocación cervical.
- Humedezca la piel con alcohol al 70% para reducir la adherencia de los cabellos sueltos sobre los músculos. Pelar la piel de la extremidad utilizan....
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Resultados
La puesta a punto para la cosecha y la congelación de los tejidos se puede ver en la Figura 1. Tejidos extirpados se deben almacenar en una gasa empapada en PBS para evitar el secado (Figura 1A). Cuando se seleccionan los tejidos a ser utilizado para el análisis histológico deben ser sumergidos en OCT y se presentarán en molde crio en la orientación adecuada y lo más cerca a la longitud fisiológica como sea posible para asegurar la morfología exacta (Figura 1B). Slurry .......
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Discusión
Histología e inmunohistoquímica se han utilizado como herramientas clave en la comprensión de la manifestación y la progresión de la patología en diversos trastornos neuromusculares. Clásicamente, las biopsias musculares se fijaron por primera vez en formaldehído y luego incrustados con cera de parafina. Si bien la fijación de formaldehído conserva la arquitectura del tejido y permite el almacenamiento y transporte del tejido a temperatura ambiente, también inactiva las enzimas y los entrecruzamientos proteínas que requ.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Alex Miller por las revisiones de los manuscritos. Este trabajo fue apoyado con las becas de investigación otorgadas a M.G. de Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) y Muscular Dystrophy Association (218938).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Criostato | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., teléfono de la oficina 1-800-248-0123 Alternativa: Richard Allen Scientific |
| Microscopio | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Teléfono: 1-631-547-8500 Alternativa: Olympus |
| Software de análisis de imágenes | Nikon Software de imagen Investigación básica | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Teléfono: 1-631-547-8500 Alternativas: Imagen J, Metamorph |
| Isoflurano | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Fuente alternativa: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| Molde de pañuelo desechable | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| Diapositivas Colorfrost plus | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| Alcohol etílico | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| 2-metil butano | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR |
| Scientific Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fuente alternativa: VWR Scientific |
Referencias
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 ....
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Reimpresiones y permisos
