Artículo de método

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución In Situ La hibridación

DOI:

10.3791/52799

⸱

17 de junio de 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

situ (ISH) > 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARNm se localizan con frecuencia a los axones de vertebrados y de su traducción locales se requiere para pathfinding axón o ramificación durante el desarrollo y para el mantenimiento, la reparación o la neurodegeneración en períodos postdevelopmental. Análisis de alto rendimiento han revelado recientemente que los axones tienen un transcriptoma más dinámico y complejo de lo esperado. Estos análisis, sin embargo se han realizado principalmente en neuronas cultivadas, donde los axones pueden ser aislados de los compartimentos somato-dendrítica. Es prácticamente imposible de conseguir tal aislamiento en tejidos enteros en vivo. Por lo tanto, con el fin de verificar el reclutamiento de mRNAs y su relevancia funcional en un animal entero, los análisis del transcriptoma idealmente deben ser combinados con técnicas que permiten la visualización de mRNAs in situ. Recientemente, las tecnologías ISH novedosos que detectan ARN a nivel de una sola molécula se han desarrollado. Esto es especialmente importante cuando se analiza la localización subcelular de mRNA, ARN ya localizados se encuentran típicamente en niveles bajos. Aquí se describen dos protocolos para la detección de mRNAs axón localizadas utilizando un nuevo ultrasensible tecnología de ARN ISH. Hemos combinado RNAscope ISH con contratinción axonal mediante inmunohistoquímica de fluorescencia o colorantes histológicos para verificar el reclutamiento de ATF4 mRNA a los axones in vivo en el ratón madura y los cerebros humanos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contratación ARNm axonal y la traducción local de los axones permiten responder a estímulos extracelulares de manera temporal y espacialmente aguda 1. La síntesis de proteínas intra-axonal se entiende mejor en el contexto del desarrollo neurológico en el que desempeña un papel crucial en el crecimiento de la conducta cono 2-8, axón pathfinding 9-11 y señalización retrógrada 12,13. Pero mucho menos se sabe acerca de la importancia funcional de la síntesis de proteínas axonal en las neuronas post-desarrollo cuando los niveles de ARNm y ribosomas axonal se reducen considerablemente 14,15. Axones vertebrados maduros durante mucho tiempo han sido considerados como translationally inactivos 16. Sin embargo, estudios recientes indican que la traducción locales se reactiva en los axones maduros en condiciones patológicas. Por ejemplo, un subconjunto de mRNAs es reclutado para regeneración de los axones se requiere lesión del nervio y la síntesis de proteínas intra-axonal para la regeneración correcta de estos axones 17 siguiente. Además, nuestro grupo has demostró que mRNAs específicos son reclutados a los axones después de que se requiere la exposición local a peptídico de la enfermedad de Alzheimer 1-42, y la traducción local de la ATF4 factor de transcripción para propagar los efectos neurodegenerativos de Aß 1-42 de axones a la soma neuronal 18. Finalmente, los análisis de alto rendimiento han revelado que los axones maduros tienen un transcriptoma más complejo y dinámico de lo esperado 18-21, especialmente bajo condiciones patológicas. A la luz de estos estudios, un método altamente sensible y específica para detectar que se necesita ARNm axón localizados en el sistema nervioso adulto.

Gran parte del trabajo en el reclutamiento de ARNm y la traducción local en axones maduros se ha realizado en las neuronas cultivadas. Esto es especialmente cierto para los análisis de transcriptoma ya que existen métodos de cultivo especializados que permiten el aislamiento de los axones de el compartimiento somato-dendrítica 18-20. Aunque estos estudios han dado valiosos complementosvuelo en el papel de la traducción local en axones maduros, la cuestión de si las neuronas cultivadas representan fielmente la situación in vivo o si ARNm reclutamiento es una respuesta adaptativa de los axones a condiciones de cultivo sigue abierta. Pocos estudios han proporcionado pruebas de la contratación ARNm para madurar axones in vivo. Por ejemplo, la que codifica para la proteína marcadora olfativo transcripción se ha detectado en los axones en las neuronas sensoriales adultas 22. Un transgén que contiene el 3 'UTR del mRNA β-actina se transporta a los axones en las neuronas del sistema nervioso periférico y central en los ratones y se traduce localmente después de períodos de desarrollo 23. ARNm Lamin b2 se localiza en los axones de la retina en Xenopues laevis renacuajos y su agotamiento afecta mantenimiento axón después del desarrollo axonal 21. Interferencia con el transporte axonal de la codificación de ARNm para citocromo C oxidasa IV altera el comportamiento del ratón 24. Por último, ATF4 ARNm se encuentra en un adultoXON de ratones y cerebros humanos en el contexto de Aß 1-42 inducida por la neurodegeneración 18.

Análisis del transcriptoma alto rendimiento han demostrado ser útiles para identificar perfiles de mRNA en los axones aislados in vitro, pero tienen limitaciones para los estudios in vivo, ya que en los tejidos enteros axones no se encuentran en forma aislada, sino entremezclados con cuerpos celulares neuronales, células gliales y otros tipos de células. Por lo tanto, este tipo de análisis tienen que ser combinado con técnicas de imagen que confirman la localización subcelular de mRNAs. ARN hibridación in situ (ISH ARN) permite la detección y visualización de las secuencias de ARN específicos en células y tejidos. Sin embargo, los ensayos originales ARN ISH eran adecuadas sólo para la identificación de los muy abundantes ARN 25, que rara vez es el caso de los ARNm axón localizadas. Desde hace décadas el aumento de los esfuerzos se han puesto en el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan la detección de ARNm en el nivel de una sola molécula 25,26. Por ejemplo, Singer y sus colegas han desarrollado sondas ISH para detectar ARNm en las células individuales, que consiste en 5 no se solapan etiqueta fluorescente 50-meros (para más detalles, consulte 27). La principal diferencia entre las técnicas antes mencionadas y el que aquí se describe es que el más tarde utiliza 20-Z estructura doble (no lineal) sondas que normalmente se dirigen a ~ 1 kb de la región de ARN de interés asegurar la especificidad y bajos niveles de fondo. Las sondas se hibridan con secuencias de preamplificador y amplificador que finalmente están marcados con fluorescencia o conjugarse con las enzimas que permiten reacciones cromogénicos. Estos pasos de amplificación mejorar la relación señal-ruido en comparación con otras tecnologías de ISH 28. Aquí se describen dos protocolos que utilizan RNAscope combinado ya sea con inmunocitoquímica fluorescencia o con colorantes histológicos que permiten counterstaining axonal. Ambos protocolos son apropiados para visualizar la localización axonal de ATF4 mRNA en mo adultosusar y cerebros humanos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Columbia y las directrices aplicables para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos. Nota: Preparar todos los tampones utilizados para los procedimientos de ISH en RNasa libre de agua o tratada con DEPC. Esta recomendación no es estrictamente necesario después de ISH se ha completado, pero se sugiere que los tampones todavía se preparan en agua doblemente destilada esterilizada en autoclave y / o esterilizados por filtración.

1. Detección de ATF4 mRNA localizada a colinérgica axones en el ratón adulto cerebro usando Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) Seguido por inmunohistoquímica

  1. Preparación de muestras para las secciones de cerebro congeladas paraformaldehído-fijo
    1. Para el siguiente ejemplo, preparar rodajas de cerebro de ratones congelados fijos.
      1. En pocas palabras, sacrificar los ratones 9 meses de edad, por la anestesia con ketamina (100 mg kg -1 de peso corporal) y xilazina (10 mg kg -1 weig cuerpoht) seguido de una infusión transcardial de 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7,4).
      2. Retire cerebros y post-fix en paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 4 ° C
      3. Después de la fijación, lavar las muestras tres veces en PBS y cryoprotect en 30% de sacarosa en PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C.
      4. Cerebros Insertar en octubre congelación compuesto, en serie sección a 20 micras en un criostato y montar en poli-D-lisina tratados portaobjetos de microscopio. Mantenga rodajas de cerebro a -20 ° C hasta su uso.
    2. Eliminar rodajas de cerebro paraformaldehído fijo de congelador y aire seco durante 30 min a TA.
    3. Lavar tres veces con PBS 1x.
    4. En una campana de extracción, re-fix cerebro rebanadas 20 min con paraformaldehído al 4% a TA.
      NOTA: PRECAUCIÓN: 4% de paraformaldehído es tóxico y debe manejarse y desecharse adecuadamente siguiendo los protocolos de seguridad.
    5. Lavar tres veces con PBS 1x.
    6. Deshidratar rodajas de cerebro.
      1. Preparar 50%, 75% y 100%soluciones de etanol.
      2. Sumergir los portaobjetos en etanol al 50% durante 5 min a RT.
      3. Sumergir los portaobjetos en etanol al 75% durante 5 min a RT.
      4. Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min a RT.
      5. Sumergir los portaobjetos en etanol fresco 100% durante 5 min a RT. Nota: Como alternativa, las diapositivas se pueden almacenar en etanol al 100% a -20 ° C hasta 1 mes.
  2. Prueba FISH seguido por inmunohistoquímica utilizando antígeno / ARN desenmascaramiento inducida por calor
    1. Antes de comenzar la preparación de todo el material necesario:
      1. Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada en el horno para crear un ambiente humidificado.
      2. Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación.
      3. Eliminar sondas (ambas sondas negativos y objetivo) de la nevera y calentar en el horno de hibridación para 10 min. Deja que se enfríen las sondas down a RT.
      4. Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.4 (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex Reactivo) a TA.
      5. Preparar la solución de recuperación de antígeno: 10 mM de citrato sódico (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: La solución puede ser almacenada a temperatura ambiente indefinidamente y se utiliza para la tinción futuro.
      6. Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC.
        NOTA: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro. Tampón de lavado 50x podría precipitar. Si es así, el calor 50x tampón de lavado a 40 ° C durante 10 minutos antes de preparar la solución 1x.
    2. Retirar los portaobjetos de etanol 100% y aire seco durante 5 min a RT.
    3. Prepara una jarra Coplin que contiene 50 ml de solución de recuperación de antígeno. Sumergir los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos y hervir durante 10 minutos en un horno de microondas.
      NOTA: También se desliza horizontalmente en lugar de 100 mmplato de cristal redondo de diámetro que contiene 100 ml de solución de recuperación.
      1. Llenar un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada y colóquelo en el microondas.
        NOTA: El agua se "amortiguar" el calor al realizar desenmascaramiento.
      2. Colocar los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos dentro del microondas. Hervir desliza a alta potencia durante 5 minutos. Inmediatamente después de las muestras han dejado de ebullición, el calor se desliza de nuevo a alta potencia de descuento del 5 min.
      3. Enfriar diapositivas a RT.
        NOTA: CRÍTICA PASO: hervir la duración y el procedimiento deben ser determinados por el usuario, dependiendo de las características de microondas. La más rápida es la ebullición comienza mayores serán las posibilidades de solución de evaporación. En este caso, se recomienda que las muestras se hirvieron durante períodos de tiempo más cortos más de dos veces para completar un tiempo total de desenmascaramiento 10 min. Por el contrario, si calentamiento se realiza a una potencia media o baja, desenmascaramiento puede realizarse una vez por 10 min. Sin embargo, si las muestras no hervir continuously para un total de aproximadamente 10 min, esto podría resultar en desenmascaramiento parcial de tanto el ARN diana y la proteína a detectar.
    4. Lavar los portaobjetos tres veces con PBS 1x.
    5. Añadir 2 - 3 gotas (~ 100 l) de la sonda dapB ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para evaluar la tinción de fondo. Nota: La sonda conjunto dapB dirige a un gen bacteriano y no debe reconocer ninguna ARN de mamífero.
    6. Añadir 2 - 3 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés. Nota: un conjunto de sonda focalización residuos 20 - 1381 del ratón ATF4 mRNA se utiliza en este ejemplo.
    7. Diapositivas Cubra con parafina para evitar la evaporación de la sonda, los colocan en el cuadro de diapositivas humidificado en el interior del horno de hibridación y los incuban a 40 ° C durante 2 horas.
      NOTA: OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden hibridar con una sonda conjunto dirigido ratón POLR2A y utilizaron como controles positivos.
    8. Lavar slides dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    9. Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 1-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
    10. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    11. Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 2-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
    12. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    13. Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 3-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
    14. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    15. Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 4-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colóquelos en lacaja de portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
    16. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y dos veces con PBS 1x.
    17. Añadir 100 a 200 l (o un volumen suficiente para cubrir completamente rebanadas) de una solución de bloqueo que contenía 3 mg / ml de BSA, glicina 100 mM y 0,25% de Triton X-100 en PBS (pH 7,4) a los portaobjetos, cubrir con parafilm y se incubar durante 30 min a TA.
    18. Añadir 100 a 200 l de anticuerpo anti-ChAT diluido en solución de bloqueo (1/100) a las diapositivas, cubrirlos con parafilm y se incuba durante 2 días a 4 ° C. Asegúrese de que las secciones de cerebro no se sequen. Si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpo anti-chat para cortes de cerebro 24 horas después de la incubación.
    19. Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA.
    20. Añadir 100 a 200 l de anticuerpo secundario conjugado con Alexa adecuado (. Por ejemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este ejemplo en particular) a las diapositivas, cubrir con parafilm y incubcomió durante 1 hora a temperatura ambiente.
    21. Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA.
    22. Lavar los portaobjetos una vez con agua destilada.
    23. Monte desliza con medio de montaje que contiene DAPI.
    24. Visualizar rodajas de cerebro bajo un microscopio de fluorescencia.

2. Detección de ATF4 mRNA localizada a axones en muestras de cerebro humano utilizando cromogénico hibridación in situ (CISH) Seguido por Luxol Fast azul y violeta de cresilo Counterstaining

  1. Preparación de muestras para muestras de cerebro humano incluidas en parafina fijado en formol
    1. Rebanadas Hornear en un horno seco a 60 ° C durante 1 hora.
    2. Desparafinar rodajas de cerebro en una campana de humos.
      NOTA: PRECAUCIÓN: Los reactivos son tóxicos y deben manejarse y se desecha siguiendo las pautas de seguridad apropiadas
      1. Sumergir los portaobjetos en cámara de compensación alternativa xileno dos veces durante 10 minutos.
      2. Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% dos veces durante 1 min.
      3. LArodajas de IR-seca 5 min a TA. Nota: Como alternativa, las muestras pueden ser secadas a RT O / N, pero deben utilizarse dentro de las 24 hrs.
  2. Diaminobencidina (DAB) a base de ensayo de ISH cromogénico seguido por luxol rápido azul y violeta de cresilo mancha utilizando ARN desenmascaramiento inducida proteasa inducida por el calor y
    1. Antes de comenzar la preparación de materiales necesarios:
      1. Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada para crear un ambiente humidificado.
      2. Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación.
      3. Prepare 1x Pretrate 2 diluyendo la solución 10x (incluido en el Kit de CISH reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC. Si el pretratamiento se lleva a cabo en una placa caliente, añadir 100 ml de solución de pretratamiento a un plato de vidrio de diámetro 100 mm para aumentar la superficie de contacto entre el plato y la placa caliente (si pretratamientose realiza en un horno de microondas, un tarro Coplin puede utilizarse en lugar como se especifica en 1.2.3). Solución de calor a 100 ° C y mantenerla no más de 30 minutos hirviendo antes de sumergir las muestras.
      4. Calor sondas negativos y positivos 10 min a 40 ° C y enfriar a temperatura ambiente.
      5. Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.6 (incluido en el Kit de CISH Reactivo) a TA.
      6. Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el kit de reactivos CISH) en agua destilada. Nota: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro.
    2. Añadir ~ 4 gotas (~ 120 mu l) de Pretrate 1 a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba a TA durante 10 min.
    3. Lavar 3 a 5 veces en agua destilada fresca.
    4. Realizar desenmascaramiento inducida por calor:
      1. Diapositivas de traslado hasta el caliente Trate previamente 2 (incluido en el kit de reactivos CISH) de solución y hervir durante 15 minutos. Nota: de ebullición se puede realizar en un plato caliente garantizandoebullición continua o en el microondas siguiendo los pasos críticos especificados en 1.2.3).
    5. Transferir inmediatamente diapositivas a agua destilada y lavar 3 a 5 veces.
    6. Lavar los portaobjetos 3 a 5 veces en etanol al 100% fresco.
    7. Rodajas de aire seco 5 min a temperatura ambiente. Nota: O Alternativamente rebanadas se pueden secar / N.
    8. Realizar desenmascaramiento inducida proteasa-:
      1. Añadir 4 gotas de Pretrate 3 (incluido en el kit de reactivos CISH), cubrir con parafilm y se incuba 30 minutos a 40 ° C en el horno de hibridación.
    9. Lavar los portaobjetos de 3 a 5 veces en agua destilada fresca.
    10. Añadir 4 gotas de la sonda dapB ajustado a esas rodajas de cerebro utilizadas para evaluar la tinción de fondo.
    11. Añadir 4 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés.
      NOTA: Una sonda conjunto dirigido residuos 15 - 1256 del ARNm ATF4 humano se utiliza en este ejemplo. OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden ser hybridized con una sonda conjunto dirigido PPIB humana y se utiliza como controles positivos.
    12. Coloque las diapositivas en el cuadro de diapositivas y se incuba durante 2 horas. a 40 ° C en el horno de hibridación.
    13. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    14. Añadir 4 gotas de AMP 1 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
    15. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    16. Añadir 4 gotas de AMP 2 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
    17. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    18. Añadir 4 gotas de AMP 3 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación.
    19. Lavar los portaobjetos dos veces con 1x erah tampón durante 2 minutos a RT.
    20. Añadir 4 gotas de AMP 4 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación.
    21. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    22. Añadir 4 gotas de AMP 5 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente.
    23. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    24. Añadir 4 gotas de AMP 6 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente.
    25. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT.
    26. Mezclar un volumen igual de BROWN-1 y BROWN-2 reactivos (incluido en el Kit Reactivo de CISH), añadir ~ 120 l de solución a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba 10 min a TA.
    27. Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y enjuagar una vez en agua destilada.
      NOTA: Los pasos críticos: los siguientes pasos son fundamentales paraobtener una contratinción axonal óptima sin enmascarar la presencia de gránulos de ARN.
    28. Antes de realizar contratinción comprobar la presencia de ARNm de interés bajo un microscopio de campo claro. Definir las áreas de referencia en las muestras de cerebro en el que monitorean la presencia de puntos lagrimales durante todo el procedimiento de contraste.
    29. Luxol Precaliente solución de azul rápido a 60 ° C.
    30. Coloque los portaobjetos en luxol azul rápido e incubar 30 minutos a 60 ° C
    31. Enjuague varias veces en agua destilada.
    32. Dip desliza varias veces en solución de carbonato de litio 0,05% para iniciar la diferenciación.
    33. Dip desliza dos veces en etanol fresco 75%.
    34. Enjuague con agua destilada.
    35. Compruebe rodajas de cerebro con un microscopio de campo claro. Tenga en cuenta que la materia gris y blanca debería empezar a ser gránulos distinguibles y ARN todavía visibles como / puntos lagrimales negro azul oscuro. Verifique que los axones comienzan a aparecer como fibras de color azul claro.
    36. Repita los pasos del 02/02/28 a 02/02/32. Perform incubaciones con solución de azul luxol rápido en 10 a 20 pasos min, controlando cuidadosamente la contratinción y la presencia de gránulos de ARN. Nota: Por lo general, de contraste óptimo se adquiere en 60 a 90 minutos (tiempo total de incubación), pero el tiempo se puede acortar si se sospecha que los gránulos de ARN pueden ser enmascarados por la luxol mancha azul rápido (ver Figura 2 para ver ejemplos).
    37. Incubar los portaobjetos en una solución de violeta de cresilo durante 10 min a RT.
    38. Enjuague los portaobjetos en agua destilada.
    39. Dip desliza 5 a 10 veces en etanol al 70%.
    40. Deshidratar rodajas de cerebro a través de 3 cambios rápidos de etanol al 100%.
    41. En una campana de humos, rodajas de cerebro claras por incubando dos veces en cámara de compensación alternativa xileno durante 2 minutos y una tercera vez durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    42. Rebanadas Monte cerebrales en medio de montaje permanente a base de xileno.
    43. Analizar las muestras en un microscopio de campo claro.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un breve resumen de los procedimientos descritos anteriormente se muestra en la Figura 1.

Detección óptima de ATF4 ARNm gránulos en los axones colinérgicos usando desenmascaramiento inducida por calor

Al evaluar la localización axonal de los ARNm, es fundamental para poder identificar a los axones y ser capaz de visualizar los ARN abundantes bajas. La tecnología de ARN ISH descrito aquí permite la detección de ARN a una resolución de una...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este informe se describe el uso de una tecnología de ISH de alta resolución en la detección de mRNA ATF4 axón localizada. Estos y los anteriores estudios publicados muestran que esta tecnología es compatible con base de anticuerpos de detección de proteínas en los tejidos o incluso embriones enteros 33. Es importante destacar que se ha utilizado recientemente para la detección de Arco mRNA dentro de las dendritas de las neuronas del hipocampo 34. También se puede combinar con t...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Alzheimer (NIRG-10-171721; a la U.H.), el Instituto Nacional de Salud Mental (MH096702; a la U.H.), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS081333; a C.M.T.), y premios de estudio piloto del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer financiado por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento en la Universidad de Columbia (AG008702; a J.B. e Y.Y.J.) que también apoya al Banco de Cerebros de Nueva York. Agradecemos a los miembros del laboratorio Hengst por sus comentarios y discusiones

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sonda personalizada dirigida a los residuos 20-1.381 del ratón Atf4 ARNm (NM_009716)Sonda de diagnóstico celular avanzadaSonda
personalizada dirigida a los residuos 15-1.256 del ARNm humano ATF4 (NM_001675.2)Diagnóstico celularavanzado-sonda
control negativo-DapBSonda
de 310043 de diagnóstico celular avanzadosonda de control positivo-ratón Polr2A (opcional)Sonda de diagnóstico celular avanzado312471sonda
control positivo-PPIB humano (opcional)Sondadiagnóstico celular avanzado
313901 Kit de reactivos multiplex fluorescentes de RNAscope (para detección de fluorescencia)Diagnóstico celular avanzado320850in situ kit
de hibridaciónKit de reactivos RNAscope 2.0 HD - BROWN (para detección cromogénica)Cell Diagnostics310035in situ
Anticuerpo policlonal anti-ChAT de cabraMilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Kit de tinción violeta AmericanMasterTechKTLFB
Clearify (sustituto del xileno)American MasterTechCACLEGAL
Medio de montaje ProLong Gold con medio de montaje DAPILife TechnologiesP36935
DPXSigma6522
de de de Kit de hibridación Advanced

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506(2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079(2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55(2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

Artículos relacionados