Name: La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución In Situ La hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a detectar ARNm localizado en axones de tejido cerebral mediante hibridación in situ de alta resolución combinada con inmunohistoquímica. Este método permite visualizar la distribución espacial de moléculas de ARN en neuronas de ratón y humano.

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Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Alzheimer (NIRG-10-171721; a la U.H.), el Instituto Nacional de Salud Mental (MH096702; a la U.H.), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS081333; a C.M.T.), y premios de estudio piloto del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer financiado por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento en la Universidad de Columbia (AG008702; a J.B. e Y.Y.J.) que también apoya al Banco de Cerebros de Nueva York. Agradecemos a los miembros del laboratorio Hengst por sus comentarios y discusiones

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Columbia y las directrices aplicables para el cuidado y uso de animales de laboratorio fueron seguidos. Nota: Preparar todos los tampones utilizados para los procedimientos de ISH en RNasa libre de agua o tratada con DEPC. Esta recomendación no es estrictamente necesario después de ISH se ha completado, pero se sugiere que los tampones todavía se preparan en agua doblemente destilada esterilizada en autoclave y / o esterilizados por filtración. 1. Detección de ATF4 mRNA localizada a colinérgica axones en el ratón adulto cerebro usando Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) Seguido por inmunohistoquímica <ol><li> Preparación de muestras para las secciones de cerebro congeladas paraformaldehído-fijo <ol><li> Para el siguiente ejemplo, preparar rodajas de cerebro de ratones congelados fijos. <ol><li> En pocas palabras, sacrificar los ratones 9 meses de edad, por la anestesia con ketamina (100 mg kg -1 de peso corporal) y xilazina (10 mg kg -1 weig cuerpoht) seguido de una infusión transcardial de 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7,4). </li><li> Retire cerebros y post-fix en paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 4 ° C </li><li> Después de la fijación, lavar las muestras tres veces en PBS y cryoprotect en 30% de sacarosa en PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C. </li><li> Cerebros Insertar en octubre congelación compuesto, en serie sección a 20 micras en un criostato y montar en poli-D-lisina tratados portaobjetos de microscopio. Mantenga rodajas de cerebro a -20 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Eliminar rodajas de cerebro paraformaldehído fijo de congelador y aire seco durante 30 min a TA. </li><li> Lavar tres veces con PBS 1x. </li><li> En una campana de extracción, re-fix cerebro rebanadas 20 min con paraformaldehído al 4% a TA. NOTA: PRECAUCIÓN: 4% de paraformaldehído es tóxico y debe manejarse y desecharse adecuadamente siguiendo los protocolos de seguridad. </li><li> Lavar tres veces con PBS 1x. </li><li> Deshidratar rodajas de cerebro. <ol><li> Preparar 50%, 75% y 100%soluciones de etanol. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 50% durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 75% durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol fresco 100% durante 5 min a RT. Nota: Como alternativa, las diapositivas se pueden almacenar en etanol al 100% a -20 ° C hasta 1 mes. </li></ol></li></ol></li><li> Prueba FISH seguido por inmunohistoquímica utilizando antígeno / ARN desenmascaramiento inducida por calor <ol><li> Antes de comenzar la preparación de todo el material necesario: <ol><li> Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada en el horno para crear un ambiente humidificado. </li><li> Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación. </li><li> Eliminar sondas (ambas sondas negativos y objetivo) de la nevera y calentar en el horno de hibridación para 10 min. Deja que se enfríen las sondas down a RT. </li><li> Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.4 (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex Reactivo) a TA. </li><li> Preparar la solución de recuperación de antígeno: 10 mM de citrato sódico (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: La solución puede ser almacenada a temperatura ambiente indefinidamente y se utiliza para la tinción futuro. </li><li> Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el Kit Fluorescente Multiplex reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC. NOTA: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro. Tampón de lavado 50x podría precipitar. Si es así, el calor 50x tampón de lavado a 40 ° C durante 10 minutos antes de preparar la solución 1x. </li></ol></li><li> Retirar los portaobjetos de etanol 100% y aire seco durante 5 min a RT. </li><li> Prepara una jarra Coplin que contiene 50 ml de solución de recuperación de antígeno. Sumergir los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos y hervir durante 10 minutos en un horno de microondas. NOTA: También se desliza horizontalmente en lugar de 100 mmplato de cristal redondo de diámetro que contiene 100 ml de solución de recuperación. <ol><li> Llenar un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada y colóquelo en el microondas. NOTA: El agua se &quot;amortiguar&quot; el calor al realizar desenmascaramiento. </li><li> Colocar los portaobjetos en solución de recuperación de antígenos dentro del microondas. Hervir desliza a alta potencia durante 5 minutos. Inmediatamente después de las muestras han dejado de ebullición, el calor se desliza de nuevo a alta potencia de descuento del 5 min. </li><li> Enfriar diapositivas a RT. NOTA: CRÍTICA PASO: hervir la duración y el procedimiento deben ser determinados por el usuario, dependiendo de las características de microondas. La más rápida es la ebullición comienza mayores serán las posibilidades de solución de evaporación. En este caso, se recomienda que las muestras se hirvieron durante períodos de tiempo más cortos más de dos veces para completar un tiempo total de desenmascaramiento 10 min. Por el contrario, si calentamiento se realiza a una potencia media o baja, desenmascaramiento puede realizarse una vez por 10 min. Sin embargo, si las muestras no hervir continuously para un total de aproximadamente 10 min, esto podría resultar en desenmascaramiento parcial de tanto el ARN diana y la proteína a detectar. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos tres veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 2 - 3 gotas (~ 100 l) de la sonda dapB ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para evaluar la tinción de fondo. Nota: La sonda conjunto dapB dirige a un gen bacteriano y no debe reconocer ninguna ARN de mamífero. </li><li> Añadir 2 - 3 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés. Nota: un conjunto de sonda focalización residuos 20 - 1381 del ratón ATF4 mRNA se utiliza en este ejemplo. </li><li> Diapositivas Cubra con parafina para evitar la evaporación de la sonda, los colocan en el cuadro de diapositivas humidificado en el interior del horno de hibridación y los incuban a 40 ° C durante 2 horas. NOTA: OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden hibridar con una sonda conjunto dirigido ratón POLR2A y utilizaron como controles positivos. </li><li> Lavar slides dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 1-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 2-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 3-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm, colóquelos en la caja portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 2-3 gotas de reactivo de amplificación AMP 4-FL para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colóquelos en lacaja de portaobjetos y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y dos veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 100 a 200 l (o un volumen suficiente para cubrir completamente rebanadas) de una solución de bloqueo que contenía 3 mg / ml de BSA, glicina 100 mM y 0,25% de Triton X-100 en PBS (pH 7,4) a los portaobjetos, cubrir con parafilm y se incubar durante 30 min a TA. </li><li> Añadir 100 a 200 l de anticuerpo anti-ChAT diluido en solución de bloqueo (1/100) a las diapositivas, cubrirlos con parafilm y se incuba durante 2 días a 4 ° C. Asegúrese de que las secciones de cerebro no se sequen. Si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpo anti-chat para cortes de cerebro 24 horas después de la incubación. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 100 a 200 l de anticuerpo secundario conjugado con Alexa adecuado (. Por ejemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este ejemplo en particular) a las diapositivas, cubrir con parafilm y incubcomió durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min a TA. </li><li> Lavar los portaobjetos una vez con agua destilada. </li><li> Monte desliza con medio de montaje que contiene DAPI. </li><li> Visualizar rodajas de cerebro bajo un microscopio de fluorescencia. </li></ol></li></ol> 2. Detección de ATF4 mRNA localizada a axones en muestras de cerebro humano utilizando cromogénico hibridación in situ (CISH) Seguido por Luxol Fast azul y violeta de cresilo Counterstaining <ol><li> Preparación de muestras para muestras de cerebro humano incluidas en parafina fijado en formol <ol><li> Rebanadas Hornear en un horno seco a 60 ° C durante 1 hora. </li><li> Desparafinar rodajas de cerebro en una campana de humos. NOTA: PRECAUCIÓN: Los reactivos son tóxicos y deben manejarse y se desecha siguiendo las pautas de seguridad apropiadas <ol><li> Sumergir los portaobjetos en cámara de compensación alternativa xileno dos veces durante 10 minutos. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 100% dos veces durante 1 min. </li><li> LArodajas de IR-seca 5 min a TA. Nota: Como alternativa, las muestras pueden ser secadas a RT O / N, pero deben utilizarse dentro de las 24 hrs. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobencidina (DAB) a base de ensayo de ISH cromogénico seguido por luxol rápido azul y violeta de cresilo mancha utilizando ARN desenmascaramiento inducida proteasa inducida por el calor y <ol><li> Antes de comenzar la preparación de materiales necesarios: <ol><li> Calentar el horno de hibridación a 40 ° C y colocar una bandeja que contiene agua destilada para crear un ambiente humidificado. </li><li> Tome una caja portaobjetos y colocar toallas de papel empapado en agua destilada dentro para humidificar el cuadro diapositiva. Coloque la caja portaobjetos en el horno de hibridación. </li><li> Prepare 1x Pretrate 2 diluyendo la solución 10x (incluido en el Kit de CISH reactivo) en agua libre de RNasa o tratada con DEPC. Si el pretratamiento se lleva a cabo en una placa caliente, añadir 100 ml de solución de pretratamiento a un plato de vidrio de diámetro 100 mm para aumentar la superficie de contacto entre el plato y la placa caliente (si pretratamientose realiza en un horno de microondas, un tarro Coplin puede utilizarse en lugar como se especifica en 1.2.3). Solución de calor a 100 ° C y mantenerla no más de 30 minutos hirviendo antes de sumergir las muestras. </li><li> Calor sondas negativos y positivos 10 min a 40 ° C y enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Equilibrar reactivos de amplificación AMP 1.6 (incluido en el Kit de CISH Reactivo) a TA. </li><li> Preparar el tampón de lavado 1x diluyendo la solución 50x social (incluido en el kit de reactivos CISH) en agua destilada. Nota: 1x tampón de lavado se puede almacenar a temperatura ambiente durante 1 mes y se utiliza para la tinción futuro. </li></ol></li><li> Añadir ~ 4 gotas (~ 120 mu l) de Pretrate 1 a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba a TA durante 10 min. </li><li> Lavar 3 a 5 veces en agua destilada fresca. </li><li> Realizar desenmascaramiento inducida por calor: <ol><li> Diapositivas de traslado hasta el caliente Trate previamente 2 (incluido en el kit de reactivos CISH) de solución y hervir durante 15 minutos. Nota: de ebullición se puede realizar en un plato caliente garantizandoebullición continua o en el microondas siguiendo los pasos críticos especificados en 1.2.3). </li></ol></li><li> Transferir inmediatamente diapositivas a agua destilada y lavar 3 a 5 veces. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 a 5 veces en etanol al 100% fresco. </li><li> Rodajas de aire seco 5 min a temperatura ambiente. Nota: O Alternativamente rebanadas se pueden secar / N. </li><li> Realizar desenmascaramiento inducida proteasa-: <ol><li> Añadir 4 gotas de Pretrate 3 (incluido en el kit de reactivos CISH), cubrir con parafilm y se incuba 30 minutos a 40 ° C en el horno de hibridación. </li></ol></li><li> Lavar los portaobjetos de 3 a 5 veces en agua destilada fresca. </li><li> Añadir 4 gotas de la sonda dapB ajustado a esas rodajas de cerebro utilizadas para evaluar la tinción de fondo. </li><li> Añadir 4 gotas de la sonda de focalización ajustado a esos cortes de cerebro utilizados para detectar el ARN de interés. NOTA: Una sonda conjunto dirigido residuos 15 - 1256 del ARNm ATF4 humano se utiliza en este ejemplo. OPCIONAL: rodajas de cerebro adicionales pueden ser hybridized con una sonda conjunto dirigido PPIB humana y se utiliza como controles positivos. </li><li> Coloque las diapositivas en el cuadro de diapositivas y se incuba durante 2 horas. a 40 ° C en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 1 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 2 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 3 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 30 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con 1x erah tampón durante 2 minutos a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 4 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafina, colocarlos en la caja de diapositivas y se incuba a 40 ° C durante 15 minutos en el horno de hibridación. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 5 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Añadir 4 gotas de AMP 6 reactivo para cada rebanada cerebro, cubrir diapositivas con parafilm y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT. </li><li> Mezclar un volumen igual de BROWN-1 y BROWN-2 reactivos (incluido en el Kit Reactivo de CISH), añadir ~ 120 l de solución a cada rebanada de cerebro, cubrir con parafilm y se incuba 10 min a TA. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado 1x durante 2 min a RT y enjuagar una vez en agua destilada. NOTA: Los pasos críticos: los siguientes pasos son fundamentales paraobtener una contratinción axonal óptima sin enmascarar la presencia de gránulos de ARN. </li><li> Antes de realizar contratinción comprobar la presencia de ARNm de interés bajo un microscopio de campo claro. Definir las áreas de referencia en las muestras de cerebro en el que monitorean la presencia de puntos lagrimales durante todo el procedimiento de contraste. </li><li> Luxol Precaliente solución de azul rápido a 60 ° C. </li><li> Coloque los portaobjetos en luxol azul rápido e incubar 30 minutos a 60 ° C </li><li> Enjuague varias veces en agua destilada. </li><li> Dip desliza varias veces en solución de carbonato de litio 0,05% para iniciar la diferenciación. </li><li> Dip desliza dos veces en etanol fresco 75%. </li><li> Enjuague con agua destilada. </li><li> Compruebe rodajas de cerebro con un microscopio de campo claro. Tenga en cuenta que la materia gris y blanca debería empezar a ser gránulos distinguibles y ARN todavía visibles como / puntos lagrimales negro azul oscuro. Verifique que los axones comienzan a aparecer como fibras de color azul claro. </li><li> Repita los pasos del 02/02/28 a 02/02/32. Perform incubaciones con solución de azul luxol rápido en 10 a 20 pasos min, controlando cuidadosamente la contratinción y la presencia de gránulos de ARN. Nota: Por lo general, de contraste óptimo se adquiere en 60 a 90 minutos (tiempo total de incubación), pero el tiempo se puede acortar si se sospecha que los gránulos de ARN pueden ser enmascarados por la luxol mancha azul rápido (ver Figura 2 para ver ejemplos). </li><li> Incubar los portaobjetos en una solución de violeta de cresilo durante 10 min a RT. </li><li> Enjuague los portaobjetos en agua destilada. </li><li> Dip desliza 5 a 10 veces en etanol al 70%. </li><li> Deshidratar rodajas de cerebro a través de 3 cambios rápidos de etanol al 100%. </li><li> En una campana de humos, rodajas de cerebro claras por incubando dos veces en cámara de compensación alternativa xileno durante 2 minutos y una tercera vez durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Rebanadas Monte cerebrales en medio de montaje permanente a base de xileno. </li><li> Analizar las muestras en un microscopio de campo claro. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este informe se describe el uso de una tecnología de ISH de alta resolución en la detección de mRNA ATF4 axón localizada. Estos y los anteriores estudios publicados muestran que esta tecnología es compatible con base de anticuerpos de detección de proteínas en los tejidos o incluso embriones enteros 33. Es importante destacar que se ha utilizado recientemente para la detección de Arco mRNA dentro de las dendritas de las neuronas del hipocampo 34. También se puede combinar con t...

Contratación ARNm axonal y la traducción local de los axones permiten responder a estímulos extracelulares de manera temporal y espacialmente aguda 1. La síntesis de proteínas intra-axonal se entiende mejor en el contexto del desarrollo neurológico en el que desempeña un papel crucial en el crecimiento de la conducta cono 2-8, axón pathfinding 9-11 y señalización retrógrada 12,13. Pero mucho menos se sabe acerca de la importancia funcional de la síntesis de proteínas axonal en las neuronas post-desarrollo cuando los niveles de ARNm y ribosomas axonal se reducen considerablemente 14,15. Axones vertebrados maduros durante mucho tiempo han sido considerados como translationally inactivos 16. Sin embargo, estudios recientes indican que la traducción locales se reactiva en los axones maduros en condiciones patológicas. Por ejemplo, un subconjunto de mRNAs es reclutado para regeneración de los axones se requiere lesión del nervio y la síntesis de proteínas intra-axonal para la regeneración correcta de estos axones 17 siguiente. Además, nuestro grupo has demostró que mRNAs específicos son reclutados a los axones después de que se requiere la exposición local a peptídico de la enfermedad de Alzheimer 1-42, y la traducción local de la ATF4 factor de transcripción para propagar los efectos neurodegenerativos de Aß 1-42 de axones a la soma neuronal 18. Finalmente, los análisis de alto rendimiento han revelado que los axones maduros tienen un transcriptoma más complejo y dinámico de lo esperado 18-21, especialmente bajo condiciones patológicas. A la luz de estos estudios, un método altamente sensible y específica para detectar que se necesita ARNm axón localizados en el sistema nervioso adulto. Gran parte del trabajo en el reclutamiento de ARNm y la traducción local en axones maduros se ha realizado en las neuronas cultivadas. Esto es especialmente cierto para los análisis de transcriptoma ya que existen métodos de cultivo especializados que permiten el aislamiento de los axones de el compartimiento somato-dendrítica 18-20. Aunque estos estudios han dado valiosos complementosvuelo en el papel de la traducción local en axones maduros, la cuestión de si las neuronas cultivadas representan fielmente la situación in vivo o si ARNm reclutamiento es una respuesta adaptativa de los axones a condiciones de cultivo sigue abierta. Pocos estudios han proporcionado pruebas de la contratación ARNm para madurar axones in vivo. Por ejemplo, la que codifica para la proteína marcadora olfativo transcripción se ha detectado en los axones en las neuronas sensoriales adultas 22. Un transgén que contiene el 3 &#39;UTR del mRNA β-actina se transporta a los axones en las neuronas del sistema nervioso periférico y central en los ratones y se traduce localmente después de períodos de desarrollo 23. ARNm Lamin b2 se localiza en los axones de la retina en Xenopues laevis renacuajos y su agotamiento afecta mantenimiento axón después del desarrollo axonal 21. Interferencia con el transporte axonal de la codificación de ARNm para citocromo C oxidasa IV altera el comportamiento del ratón 24. Por último, ATF4 ARNm se encuentra en un adultoXON de ratones y cerebros humanos en el contexto de Aß 1-42 inducida por la neurodegeneración 18. Análisis del transcriptoma alto rendimiento han demostrado ser útiles para identificar perfiles de mRNA en los axones aislados in vitro, pero tienen limitaciones para los estudios in vivo, ya que en los tejidos enteros axones no se encuentran en forma aislada, sino entremezclados con cuerpos celulares neuronales, células gliales y otros tipos de células. Por lo tanto, este tipo de análisis tienen que ser combinado con técnicas de imagen que confirman la localización subcelular de mRNAs. ARN hibridación in situ (ISH ARN) permite la detección y visualización de las secuencias de ARN específicos en células y tejidos. Sin embargo, los ensayos originales ARN ISH eran adecuadas sólo para la identificación de los muy abundantes ARN 25, que rara vez es el caso de los ARNm axón localizadas. Desde hace décadas el aumento de los esfuerzos se han puesto en el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan la detección de ARNm en el nivel de una sola molécula <sup&gt; 25,26. Por ejemplo, Singer y sus colegas han desarrollado sondas ISH para detectar ARNm en las células individuales, que consiste en 5 no se solapan etiqueta fluorescente 50-meros (para más detalles, consulte 27). La principal diferencia entre las técnicas antes mencionadas y el que aquí se describe es que el más tarde utiliza 20-Z estructura doble (no lineal) sondas que normalmente se dirigen a ~ 1 kb de la región de ARN de interés asegurar la especificidad y bajos niveles de fondo. Las sondas se hibridan con secuencias de preamplificador y amplificador que finalmente están marcados con fluorescencia o conjugarse con las enzimas que permiten reacciones cromogénicos. Estos pasos de amplificación mejorar la relación señal-ruido en comparación con otras tecnologías de ISH 28. Aquí se describen dos protocolos que utilizan RNAscope combinado ya sea con inmunocitoquímica fluorescencia o con colorantes histológicos que permiten counterstaining axonal. Ambos protocolos son apropiados para visualizar la localización axonal de ATF4 mRNA en mo adultosusar y cerebros humanos.

<table><tbody><tr><td>Sonda personalizada dirigida a los residuos 20-1.381 del ratón Atf4 ARNm (NM_009716)</td><td>Sonda de diagnóstico celular avanzada</td><td></td> <td>Sonda</td></tr><tr><td>personalizada dirigida a los residuos 15-1.256 del ARNm humano ATF4 (NM_001675.2)</td><td>Diagnóstico celular</td> <td>avanzado-sonda</td><td></td></tr> de <tr><td>control negativo-DapB</td><td>Sonda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de 310043 de diagnóstico celular avanzadosonda de control positivo-ratón Polr2A (opcional)</td><td>Sonda de diagnóstico celular avanzado</td><td>312471</td><td>sonda</td></tr> de <tr><td>control positivo-PPIB humano (opcional)</td><td>Sonda</td>de <td>diagnóstico celular avanzado</td><td></td></tr><tr><td>313901 Kit de reactivos multiplex fluorescentes de RNAscope (para detección de fluorescencia)</td><td>Diagnóstico celular avanzado</td><td>320850</td><td>in situ kit</td></tr> <tr><td>de hibridaciónKit de reactivos RNAscope 2.0 HD - BROWN (para detección cromogénica)</td>Kit de hibridación Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>in situ</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-ChAT de cabra</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Kit de tinción violeta American</td><td>MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify (sustituto del xileno)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje ProLong Gold con medio de montaje DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de arnm axón localizado en las secciones cerebrales uso de alta resolución<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

ARNm se localizan con frecuencia a los axones de vertebrados y de su traducción locales se requiere para pathfinding axón o ramificación durante el desarrollo y para el mantenimiento, la reparación o la neurodegeneración en períodos postdevelopmental. Análisis de alto rendimiento han revelado recientemente que los axones tienen un transcriptoma más dinámico y complejo de lo esperado. Estos análisis, sin embargo se han realizado principalmente en neuronas cultivadas, donde los axones pueden ser aislados de los compartimentos somato-dendrítica. Es prácticamente imposible de conseguir tal aislamiento en tejidos enteros en vivo. Por lo tanto, con el fin de verificar el reclutamiento de mRNAs y su relevancia funcional en un animal entero, los análisis del transcriptoma idealmente deben ser combinados con técnicas que permiten la visualización de mRNAs in situ. Recientemente, las tecnologías ISH novedosos que detectan ARN a nivel de una sola molécula se han desarrollado. Esto es especialmente importante cuando se analiza la localización subcelular de mRNA, ARN ya localizados se encuentran típicamente en niveles bajos. Aquí se describen dos protocolos para la detección de mRNAs axón localizadas utilizando un nuevo ultrasensible tecnología de ARN ISH. Hemos combinado RNAscope ISH con contratinción axonal mediante inmunohistoquímica de fluorescencia o colorantes histológicos para verificar el reclutamiento de ATF4 mRNA a los axones in vivo en el ratón madura y los cerebros humanos.

Un breve resumen de los procedimientos descritos anteriormente se muestra en la Figura 1. Detección óptima de ATF4 ARNm gránulos en los axones colinérgicos usando desenmascaramiento inducida por calor Al evaluar la localización axonal de los ARNm, es fundamental para poder identificar a los axones y ser capaz de visualizar los ARN abundantes bajas. La tecnología de ARN ISH descrito aquí permite la detección de ARN a una resolución de una...

situ (ISH) > 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar ARN mensajeros localizados accidentalmente en muestras de cerebro adulto. Esto se logra mediante un pretratamiento de las muestras con ebullición y digestión con proteasa para desenmascarar las moléculas de ARNm, como segundo paso se realiza la hibridación, seguida de etapas de amplificación y detección, que permiten la visualización del ARNm de interés.A continuación, los axones se tiñen con anticuerpos o colorantes para verificar que el ARNm de interés se localiza en los axones. Los resultados muestran la presencia de un ARNm de TF cuatro en muestras cerebrales utilizando diferentes procedimientos de desenmascaramiento y contadores, así como métodos de tinción basados en análisis microscópicos. Este método puede ayudar a responder preguntas en neurociencia, como qué ARNm se localizan y traducen sin exones.Aunque este método puede proporcionar información sobre la síntesis de proteínas intracelulares, también puede aplicarse a otros sistemas, como las dendritas y las células y tejidos no neuronales en los que ocurre la localización de ARNm. Después de fijar los cortes de cerebro, según las instrucciones del protocolo escrito, prepare un frasco Coplin que contenga 60 mililitros de solución de recuperación de antígenos e introduzca las laminillas en la solución. A continuación, llene un vaso de un litro con agua destilada y colóquelo en el microondas para amortiguar el calor.Al realizar la desenmascaramiento, coloque el frasco coplan que contiene los portaobjetos y la solución de recuperación en el microondas. Hierva los portaobjetos a potencia alta durante cinco minutos. Inmediatamente después de que la solución haya dejado de hervir, caliente nuevamente los portaobjetos a potencia alta durante cinco minutos adicionales.Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente. Después del enfriamiento, sumerja los portaobjetos en un recipiente que contenga PBS para lavarlos y luego repita el lavado dos veces más. Después del lavado, coloque los portaobjetos sobre una superficie plana y agregue de dos a tres gotas o 100 microlitros de DAP B.Probe a dos o tres secciones cerebrales como control. Para evaluar la tinción de fondo, agregue de dos a tres gotas de la sonda dirigida a las secciones experimentales. Para detectar el ARN de interés, aquí se utiliza una sonda dirigida a los residuos 20 a 1381 del ARN de ratón a TF four. Utilice pinzas para colocar parafina sobre los portaobjetos y evitar la evaporación de la sonda.Luego, coloque las laminillas en la caja de laminillas humidificada dentro del horno de hibridación e incube durante dos horas a 40 grados Celsius. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, lave las laminillas en un recipiente con tampón de lavado 1x durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue de dos a tres gotas del reactivo de amplificación a MP uno fl a cada sección de cerebro.Luego, cúbralo con una película de parafina fresca, colóquelo en la caja para portaobjetos e incube a 40 grados Celsius durante 15 minutos en el horno de hibridación. Después de lavar los portaobjetos como antes, agregue de dos a tres gotas del reactivo de amplificación A MP cuatro fl a cada sección cerebral y cúbralo con perfil. Incube los portaobjetos en la caja a 40 grados Celsius durante 15 minutos en el horno de hibridación.Lave las laminillas dos veces con un tampón de lavado 1x durante dos minutos cada una a temperatura ambiente. Como antes, tras el último lavado, cubra cada sección con 100 a 200 microlitros de solución bloqueante que contenga 3 miligramos por mililitro de BSA, 100 milimolar de glicina y 0,25 % de Triton X-100 en PBS, cubra cada laminilla con parafina y incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, añada 100 a 200 microlitros de anticuerpo diluido en la solución bloqueante sobre las laminillas. Aquí se utiliza un anticuerpo anti-colina acetiltransferasa; tras cubrir las laminillas con parafina, incube durante dos días a cuatro grados Celsius.Asegúrese de que las secciones del cerebro no se sequen; si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpo anti-CHATT a las secciones cerebrales 24 horas después de la incubación. Después de lavar los portaobjetos tres veces en PBS 1X durante cinco minutos, agregue 100 a 200 microlitros del anticuerpo secundario conjugado con Alexa, apropiado, a los portaobjetos a temperatura ambiente.Cubra con param e incube durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz, tras transcurrida la hora. Lave las laminillas tres veces en XPBS 1X durante cinco minutos cada vez, como antes, y luego lávelas una vez con agua destilada. Monte las laminillas con medio de montaje que contenga DPI y luego visualice las secciones cerebrales bajo el microscopio de fluorescencia.Después de preparar muestras de cerebro humano en parafina formalina fijada, según las instrucciones de la parte escrita del protocolo, realice la exposición de antígenos inducida por calor sumergiendo los portaobjetos en solución caliente de pretratamiento dos y hirviendo durante 15 minutos. Después de lavar de tres a cinco veces con agua destilada y de tres a cinco veces con etanol fresco al 100 %, deje secar los portaobjetos durante cinco minutos a temperatura ambiente para realizar la exposición de antígenos inducida por proteasa. Añada cuatro gotas de pretratamiento tres, cúbralo con perfil e incube durante 30 minutos a 40 grados Celsius en el horno de hibridación tras lavar de tres a cinco veces con agua destilada.Como antes, agregue cuatro gotas del conjunto de sondas DAP B a las secciones cerebrales de control para evaluar la tinción de fondo y cuatro gotas del conjunto de sondas dirigidas a las secciones experimentales. Coloque el par de portaobjetos cubiertos con película en la caja para portaobjetos e incube durante dos horas a 40 grados Celsius en el horno de hibridación. Después de seguir los pasos del protocolo escrito para desarrollar la señal DAB para el ARNm de interés, verifique la presencia de una señal bajo un microscopio de campo claro.Defina áreas de referencia en las muestras cerebrales en las que monitorear la presencia de puntos durante todo el procedimiento de contraste. Para contraste, primero coloque los portaobjetos en azul rápido luxal precalentado a 60 grados Celsius e incube durante 30 minutos a 60 grados Celsius.Después de la incubación, enjuague las laminillas varias veces con agua destilada y luego sumérjalas varias veces en una solución de carbonato de litio al 0,05% para iniciar la diferenciación. A continuación, sumerja las laminillas dos veces en etanol al 75% fresco y enjuáguelas con agua destilada. Examine las secciones cerebrales bajo un microscopio de campo brillante.Tenga en cuenta que la materia gris y blanca deben comenzar a ser distinguibles y que los gránulos de ARN aún deben ser visibles como puntos oscuros azul negruzco. Verifique que los axones comiencen a aparecer como fibras de color azul claro; repita el procedimiento de tinción con azul luxol, incubando con azul luxol en intervalos de 10 a 20 minutos y monitoreando cuidadosamente la contratincción y la presencia de gránulos de ARN hasta lograr una tinción óptima. Coloque los portaobjetos enjuagados en solución de violeta cresta y oxide durante 10 minutos tras la incubación.Lave las laminillas con agua destilada. Sumerja las laminillas en etanol al 70 % de cinco a diez veces y luego deshidrate mediante tres cambios rápidos de etanol al 100 % en una campana extractora. Limpie las secciones cerebrales incubando dos veces en xileno.Agente de clarificación alternativo durante dos minutos y por tercera vez durante cinco minutos. Monte las secciones cerebrales a temperatura ambiente en un medio de montaje permanente a base de xileno y analice al microscopio de campo brillante. La técnica de pesca se realizó mediante enmascaramiento inducido por proteasa seguido de la detección con anticuerpo de la colina acetil transferasa mostrada en rojo.El anticuerpo no logró reconocer chat cuando se realizó el tratamiento con proteasa. Se muestran ejemplos de resultados obtenidos con una sonda no dirigida y con la sonda dirigida contra TF cuatro utilizando los mismos ajustes del microscopio y las mismas correcciones de imagen. Las gránulos verdes positivos para ATF cuatro con localización axonal poco clara se indican con signos de interrogación.Las áreas azules son núcleos teñidos con DAPI cuando el pescado se procesó utilizando la exposición al calor para revelar el antígeno. La tinción inmunofluorescente, nuevamente mostrada en rojo, fue exitosa. Granulos positivos para TF4 localizados en axones aparecen en color naranja y se marcan como correctos; a continuación, los axones ISH fueron contrateñidos con Luxol.La tinción rápida azul y la SOTA neuronal se contratiñeron con violeta cresta luxal subóptimo. La tinción rápida azul puede producirse si la temperatura disminuye. Aquí, las muestras se tiñeron con azul rápido luxal a 40 grados Celsius durante cuatro horas.Los gránulos positivos de TF cuatro con localización accidental poco clara se indican con signos de interrogación. La tinción subóptima también ocurre cuando no se verifica la intensidad de la contratincción tras períodos cortos de incubación, como se observa aquí. Aquí se muestran ejemplos de tinción óptima con LFB combinada con hibridación in situ utilizando una sonda no diana o la sonda diana para TF cuatro.La adquisición de imágenes se ajustó automáticamente para obtener la mejor relación señal-ruido. Se localizó un TF de axón con cuatro gránulos marcados como correctos. Una vez dominado.Esta técnica puede realizarse en uno a tres días, dependiendo del método de contraste elegido tras su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los neurocientíficos exploren la traducción y localización de ARNm con mayor matices.

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Este video describe una estrategia de hibridación secuencial que implica la hibridación de sondas de ARNm con ARNm objetivo específico. Después de la hibridación de la sonda, se realiza una amplificación de la señal para mejorar la resolución a través de la reducción de la relación señal-ruido durante el ARN-CISH de las muestras histológicas.

Hibridación de sonda y amplificación de señal en ARN Hibridación in situ: una técnica para detectar secuencias específicas de ARN en secciones de tejido

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Fuente: Baleriola, J., et. al., Detección de ARNm localizados axonalmente en secciones cerebrales mediante hibridación in situ de alta resolución.  J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la detección de ARNm dentro de axones colinérgicos en cortes fijos de hipocampo de ratón utilizando hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos. La microscopía de fluorescencia revela la localización espacial de los ARNm marcados con sonda y la colina acetiltransferasa en las neuronas...

Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

Este protocolo describe un método de hibridación in situ rápido y simplificado ideal para el cerebro con prefijo de paraformaldehído, reduciendo así la necesidad de pasos complejos prolongados mientras se utilizan tejidos frescos congelados.  El método se valida mediante la identificación del gen del receptor de serotonina 5-HT2A htr2a en ratas.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Establecimos un ensayo de hibridación in situ dúplex para mapear las isoformas de los receptores de insulina IR-A e IR-B en el plexo coroideo murino, superando las limitaciones de los métodos tradicionales. Este enfoque de alta resolución revela la expresión específica de isoformas, ofreciendo nuevos conocimientos sobre la señalización de la insulina en el cerebro y posibles terapias dirigidas a isoformas para trastornos neurológicos.

Visualización precisa de los receptores de insulina A y B en el cerebro murino con un ensayo de hibridación in situ de ARN

Este estudio presenta un método robusto para aislar ARNm axonales utilizando inserciones de membrana porosas, permitiendo la separación total de neuronas frente a neuritas y la purificación de ARN. Combinado con RTddPCR, el enfoque permite la cuantificación absoluta de transcritos de baja copia, facilitando estudios sobre el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad, reproducibilidad y amplia aplicabilidad experimental.

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

Aprende a detectar ARNm localizado en axones de tejido cerebral mediante hibridación in situ de alta resolución combinada con inmunohistoquímica. Este método permite visualizar la distribución espacial de moléculas de ARN en neuronas de ratón y humano.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución

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