La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución In Situ La hibridación

El objetivo general del siguiente experimento es detectar ARNm localizados accidentalmente en muestras de cerebro adulto. Esto se logra mediante el pretratamiento. Las muestras por ebullición y digestión de proteasa para desenmascarar las moléculas de ARNm como segundo paso Se realiza la hibridación, seguida de etapas de amplificación y detección, que permiten la visualización del ARNm de interés.

Los siguientes axones se tiñen con anticuerpos o colorantes para verificar que el ARNm de interés está localizado en los axones. Los resultados muestran la presencia de un ARNm de TF 4 en muestras de cerebro utilizando diferentes procedimientos de desenmascaramiento y contadores, métodos de tinción basados en análisis de microscopía. Este método puede ayudar a responder preguntas en neurociencia, como qué ARNm se localizan y traducen sin exones.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la síntesis de proteínas intracon, también se puede aplicar a otros sistemas, como las dendritas y las células y tejidos no neuronales en los que se produce la localización del ARNm. Después de fijar las rodajas de cerebro, de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito, prepare un frasco de copin que contenga 60 mililitros de solución de recuperación de antígenos y sumerja los portaobjetos en la solución. A continuación, llene un vaso de precipitados de un litro con agua destilada y colóquelo en el microondas para amortiguar el calor.

Al realizar el desenmascaramiento, coloque el frasco de coplan que contiene los portaobjetos y la solución de recuperación en el microondas. Hervir los portaobjetos a alta potencia durante cinco minutos. Inmediatamente después de que la solución haya dejado de hervir, caliente los portaobjetos nuevamente a alta potencia durante cinco minutos más.

Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente Después de enfriarlos, sumerja los portaobjetos en un plato que contenga PBS para lavarlos y luego repita el lavado dos veces más Después del lavado, coloque los portaobjetos sobre una superficie plana y agregue dos o tres gotas o 100 microlitros de DAP B.Probe a dos o tres secciones del cerebro como control. Para evaluar la tinción de fondo, agregue dos o tres gotas de la sonda de orientación a las secciones experimentales Para detectar el ARN de interés, aquí se utiliza una sonda dirigida a los residuos 20 a 1381 de ARN TF cuatro de ratón. Use pinzas para colocar el param sobre los portaobjetos para evitar la evaporación de la sonda.

A continuación, coloque los portaobjetos en la caja de portaobjetos humidificada dentro del horno de hibridación e incube a 40 grados centígrados durante dos horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, lave los portaobjetos en un plato con un tampón de lavado durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue dos o tres gotas de reactivo de amplificación un MP un fl a cada corte de cerebro.

A continuación, cubrir con film para fresco, colocar en la caja de portaobjetos e incubar a 40 grados centígrados durante 15 minutos en el horno de hibridación. Después de lavar los portaobjetos como antes, agregue dos o tres gotas de reactivo de amplificación A MP 4 fl a cada corte de cerebro y cubra con perfil. Incubar los portaobjetos en la caja de portaobjetos a 40 grados centígrados durante 15 minutos en el horno de hibridación.

Lave los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante dos minutos cada uno a temperatura ambiente. Al igual que antes, después del último lavado, cubra cada rebanada con 100 a 200 microlitros de solución de bloqueo que contenga tres miligramos por mililitro, BSA 100 milimolar glicina y 0.25%Triton X 100 en PBS, cubra cada portaobjetos con paraform e incube durante 30 minutos. A temperatura ambiente después de la incubación, agregue de 100 a 200 microlitros de anticuerpo diluido en solución de bloqueo a los portaobjetos. Aquí se utiliza un anticuerpo anti colina acetiltransferasa después de cubrir los portaobjetos con perfil incubado durante dos días a cuatro grados centígrados.

Asegúrese de que los cortes de cerebro no se sequen si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpos anti CHATT a los cortes de cerebro 24 horas después de la incubación. Después de lavar los portaobjetos tres veces en un XPBS durante cinco minutos. A temperatura ambiente, agregue de 100 a 200 microlitros del anticuerpo secundario conjugado Alexa apropiado a los portaobjetos.

Cubrir con param e incubar durante una hora a temperatura ambiente mientras se protege de la luz una vez transcurrida la hora. Lave los portaobjetos tres veces en un XPBS durante cinco minutos cada uno como antes, y luego lávelos una vez con agua destilada. Monte los portaobjetos con un medio de montaje que contenga DPI y luego visualice los cortes de cerebro bajo el microscopio de fluorescencia.

Después de preparar muestras de cerebro humano integradas en parafina formales y fijas, de acuerdo con las instrucciones de la parte escrita del protocolo, realice el desenmascaramiento de antígenos inducido por calor sumergiendo los portaobjetos en una solución de pretratamiento caliente y ebulliéndolos durante 15 minutos. Después de lavar de tres a cinco veces en agua destilada y de tres a cinco veces en etanol fresco al 100%, deje que los portaobjetos se sequen durante cinco minutos a temperatura ambiente para realizar el desenmascaramiento de antígenos inducido por proteasa. Añadir cuatro gotas de pretratamiento, tres tapar con perfil e incubar durante 30 minutos a 40 grados centígrados en el horno de hibridación, después de lavar de tres a cinco veces en agua destilada.

Al igual que antes, agregue cuatro gotas del conjunto de sondas DAP B para controlar cortes de cerebro para evaluar la tinción de fondo y cuatro gotas de la sonda de orientación configurada para las secciones experimentales. Coloque el par de portaobjetos cubiertos de película en la caja de portaobjetos e incube durante dos horas a 40 grados centígrados en el horno de hibridación. Después de seguir los pasos del protocolo escrito para desarrollar la señal DAB para el ARNm de interés, verifique la presencia de una señal bajo un microscopio de campo claro.

Defina las áreas de referencia en las muestras de cerebro en las que se controlará la presencia de puntos durante todo el procedimiento de contramancha. Para contrarrestar la mancha. Primero coloque los portaobjetos en luxal fast blue precalentados a 60 grados centígrados e incube durante 30 minutos a 60 grados centígrados.

Después de la incubación, enjuague los portaobjetos varias veces en agua destilada y luego sumerja los portaobjetos en una solución de carbonato de litio al 0,05% varias veces para iniciar la diferenciación. A continuación, sumerja los portaobjetos dos veces en etanol fresco al 75% y enjuague con agua destilada. Revise los cortes de cerebro con un microscopio de campo brillante.

Tenga en cuenta que la materia gris y blanca deben comenzar a distinguirse y los gránulos de ARN aún visibles como puntos negros de color azul oscuro. Verifique que los axones comiencen a aparecer como fibras de color azul claro, repita el procedimiento de tinción de azul luxal, incubando con azul luxal en pasos de 10 a 20 minutos y monitoree cuidadosamente la contratinción y la presencia de gránulos de ARN cuando se haya logrado una tinción óptima. Coloque los portaobjetos de enjuague en una solución violeta crestal e incube durante 10 minutos después de la incubación.

Enjuague los portaobjetos con agua destilada. Sumerja los portaobjetos en etanol al 70% de cinco a 10 veces y luego deshidrate a través de tres cambios rápidos de etanol al 100% en una campana extractora. Limpie los cortes de cerebro incubándolos dos veces en xileno.

Agente de compensación alternativo durante dos minutos y una tercera vez durante cinco minutos. A temperatura ambiente, monte las rodajas de cerebro en un medio de montaje permanente a base de xileno y analícelas bajo un microscopio de campo claro. El pescado se realizó utilizando el desenmascaramiento inducido por proteasa seguido de la detección de anticuerpos de colina acetiltransferasa que se muestra en rojo.

El anticuerpo no reconoció el chat cuando se realizó el tratamiento con proteasa. Se muestran ejemplos de resultados obtenidos con una sonda no objetivo y una sonda de orientación TF cuatro utilizando la misma configuración de microscopio y ajustes de imagen. Los cuatro gránulos positivos de ATF verde con localización axonal poco clara están indicados con signos de interrogación.

Las áreas azules son núcleos teñidos de color pegajoso cuando se realizó el uso de antígeno inducido por calor. El desenmascaramiento, la tinción inmunofluorescente que se muestra de nuevo en rojo, fue exitosa. Un TF cuatro gránulos positivos localizados en los axones aparecen de color naranja y se marcan como correctos, después de que los axones se contratiñan con luxal.

El azul rápido y el SOTA neuronal se contratiñeron con luxal subóptimo de violeta crestal. Puede producirse una tinción azul rápida si se disminuye la temperatura. Aquí, las muestras se tiñeron con luxal fast blue a 40 grados centígrados durante cuatro horas.

Un TF cuatro gránulos positivos con localización accidental poco clara están indicados con signos de interrogación. La tinción subóptima también se produce cuando no se comprueba la intensidad de la contratinción después de períodos de incubación cortos, como se ve aquí. Aquí se muestran ejemplos de tinción óptima de LFB combinada con ish utilizando una sonda no objetivo o una sonda de cuatro objetivos TF.

La adquisición de imágenes se ajustó automáticamente para obtener la mejor relación señal/ruido. Axón localizado a TF cuatro gránulos están marcados como correctos. Una vez dominado.

Esta técnica se puede realizar en uno a tres días, dependiendo del método de contratinción elegido después de su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los neurocientíficos exploren la traducción y localización del ARNm en matices.