Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Resumen

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Resumen

Las vacunas son uno de los mayores logros de la humanidad y han salvado millones de vidas durante el último siglo. Paradójicamente, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos que median las respuestas inmunitarias a las vacunas, tal vez debido al éxito general de la vacunación, que ha reducido el interés en los mecanismos moleculares y fisiológicos de la inmunidad de las vacunas. Sin embargo, varios patógenos humanos importantes, incluido el virus de la gripe, siguen planteando un reto para la vacunación, y pueden beneficiarse de estrategias basadas en el sistema inmunitario.

Aunque la genética inversa de la influenza se ha aplicado con éxito a la generación de vacunas contra la influenza vivas atenuadas (LAIV), no se ha abordado la adición de herramientas moleculares en las preparaciones de vacunas, como componentes trazadores para seguir la cinética de la vacunación in vivo. Además, la reciente generación de modelos de ratón que permiten el agotamiento específico de los leucocitos durante los estudios cinéticos ha abierto una ventana de oportunidad para comprender los mecanismos inmunitarios básicos que subyacen a la protección provocada por la vacuna. Aquí, describimos cómo la combinación de genética inversa y modelos de ratones quiméricos puede ayudar a proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo funcionan las vacunas a nivel fisiológico y molecular, utilizando como ejemplo una vacuna contra la influenza recombinante, adaptada al frío y con virus vivos atenuados (LAIV). Utilizamos LAIVs generadas en laboratorio que albergan trazadores celulares, así como quimeras competitivas de la médula ósea (BMC) para determinar la cinética temprana de la inmunidad de la vacuna y los principales mecanismos fisiológicos responsables del inicio de la inmunidad adaptativa específica de la vacuna. Además, mostramos cómo esta técnica puede facilitar los estudios de la función génica en animales individuales durante las respuestas inmunitarias a las vacunas. Proponemos que esta técnica se puede aplicar para mejorar las estrategias profilácticas actuales contra patógenos para los que se necesitan contramedidas médicas urgentes, por ejemplo, la gripe, el VIH, el Plasmodium y los virus de la fiebre hemorrágica como el virus del Ébola.

Introducción

La generación de memoria inmunológica en ausencia de enfermedad es la base fisiológica de la vacunación eficiente ^1. Recientemente, los sistemas de enfoques basados ​​en la biología han revelado que las vacunas exitosas, como la vacuna contra la fiebre amarilla, inducen una fuerte inducción de la respuesta inmune innata y la activación de varios subconjuntos de células dendríticas (DC), que a su vez, conducen a la activación del antígeno multilinaje células T específicas ^2,3. Desde los DC son la única población de células inmunes con la capacidad de activar las células T vírgenes de antígenos específicos de ^4, el estudio de su función durante la vacunación es fundamental para entender la respuesta inmune a las vacunas y diseñar estrategias de futuro frente a patógenos desafiantes.

Un sistema que permita el seguimiento de diferentes subconjuntos DCs durante las respuestas inmunes a las vacunas sería deseable con el fin de establecer una cinética precisos de la migración DC a los tejidos linfoides, y por lo tanto para proporcionarinformación sobre los mecanismos fisiológicos responsables de la iniciación de la inmunidad adaptativa-vacuna específica. Genética basada inversas enfoques ofrecen la posibilidad de generar modificado, las vacunas vivas atenuadas que se pueden utilizar experimentalmente con este propósito. Desde su puesta en práctica en la investigación de la gripe, la genética inversa basada en plásmidos se ha empleado ampliamente para generar cepas de la gripe recombinantes incluyendo LAIVs. Los protocolos estándar para rescatar virus de la gripe recombinantes requieren multi-transfección de líneas celulares altamente transfectables con plásmidos ambisense (produciendo tanto ARN de sentido positivo y negativo) que contienen los segmentos virales de la influenza ocho, así como la amplificación en un sistema permisivo tal como Madin-Darby de riñón canino ( células MDCK) y / o de pollo huevos embrionados ^5. Sin embargo, la aplicación de genética inversa para generar herramientas moleculares con el fin de estudiar los mecanismos inmunes de la vacunación permanece sin explorar.

La generaciónde nuevos modelos de ratón que permite el agotamiento específico de subconjuntos de células inmunes, incluyendo las DC, ha abierto nuevas posibilidades para comprender los mecanismos inmunológicos básicos subyacentes protección de la vacuna-suscitó. La comparación entre las funciones de subconjuntos de DC en ratones y seres humanos ha revelado que, en gran medida, ratón y humanos DCs son funcionalmente homóloga ^6,7, estos hallazgos, fuertemente sugieren que el desarrollo de modelos de ratón que permite el agotamiento específico de DCs en el estado estacionario y durante condiciones inflamatorias, puede servir para entender la fisiología de las respuestas de CC en los seres humanos. En los últimos años una serie de modelos de ratones se han generado que llevan transgenes que expresan el receptor de la toxina de la difteria de simio (DT) (DTR) bajo el control de la región promotora de un gen de interés ^8,9. Desde tejidos de ratón no expresan naturalmente DTR, estos modelos permiten el agotamiento condicional de subconjuntos de células que portan el gen diana de interés sobre la inoculación al ratón con DT. Por lo tanto, nuestra ability para agotar DCs específicos y otros leucocitos en vivo durante los procesos fisiológicos, se ha mejorado en gran medida por el desarrollo de ro a base de DTR. Sin embargo, mientras que estos modelos de ratones transgénicos se han utilizado ampliamente para entender la ontogenia del sistema inmune, su aplicación para el desarrollo de vacunas ha sido apenas probado. Aquí, mediante la combinación de genética inversa de la gripe y quimeras de médula ósea competitivos basados-DTR, proponemos un método para estudiar la cinética de la inmunidad de la vacuna, así como la función del gen individual durante la respuesta inmune a las vacunas en vivo. La aplicación de esta tecnología para la evaluación preclínica de nuevas vacunas contra enfermedades infecciosas desafiantes podría ayudar a racionalizar el diseño de vacunas y probar vacunas candidatas en vivo.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados y siguiendo las directrices de la ley alemana de protección de los animales. Todo el personal que llevan a cabo experimentos con animales pasaron los programas de capacitación de acuerdo a la categoría B o C de la Federación de Asociaciones Europeas de animales de laboratorio de ciencias.

1. Generación de recombinante viva atenuada Vacunas contra la Influenza por genética inversa

NOTA: El protocolo detallado para la generación de virus de la gripe recombinantes mediante genética inversa ha sido descrito por estudios anteriores ⁵ y está fuera del alcance de este informe. En pocas palabras, el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío (CAV) se lleva a cabo en un gabinete de seguridad biológica de clase II bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) contención, e implica los pasos que se detallan a continuación. El protocolo de transfección y la infección se deduce que de Martínez-Sobrido et al. ^5.

1. Generar una gripe adaptada al frío reassortantvacuna utilizando como fondo la cepa adaptada al frío A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), así como la hemaglutinina (HA) y neuraminidasa un modificado (NA) de la / PR / 8/34 (H1N1) cepa A ( Figura 1A). La modificación en el gen de NA consiste en una sustitución basada en PCR de una secuencia conservada en el tallo de la proteína (residuos 65 a 72) por una secuencia de ADNc corto que codifica la ovoalbúmina de pollo (OVA) péptido SIINFEKL -derivado (Figura 1B). El péptido SIINFEKL es un péptido altamente inmunodominante en el contexto de la H-2b MHC de clase de respuesta de ratones C57BL / 6 ¹² I-restringido.
2. Placa 10 ⁶ 293T células por pocillo en placas de 6 pocillos utilizando DMEM 10% de suero bovino fetal (FBS) suplementado con 1% de penicilina / estreptomicina (P / E).
3. Preparar la mezcla de transfección del plásmido: Añadir 1 g de cada uno de los plásmidos que codifican los ADNc de PB2, PB1, PA, NP, M, NS de la gripe A / Ann Arbor / 6/60 cepa y 1 g de los plásmidos que codifican para la NA -SIINFEKL yHA de la gripe A / PR / 8/34. Agregar pre-calentado OptiMEM (15 l para un volumen final de 100 l / pocillo).
4. Incubar la mezcla de transfección durante 30 min a TA.
5. Añadir 100 l de mezcla de transfección / pocillo y se incuba durante 16 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.
6. Cambie medio celular por DMEM 0,3% de BSA 1% P / E a 33 ° C y 5% de CO ₂ durante 5 horas.
7. Añadir 10 ⁶ influenza células MDCK permisivas en DMSO que contiene 1 mg / ml de tripsina de páncreas bovino tratado con L-1-tosilamida-2-feniletil clorometil cetona (TPCK-tripsina). Mantener los co-cultivos 293T-MDCK de 2 - 3 días a 33 ° C y 5% de CO _2.
8. Recoger los sobrenadantes de células MDCK-293T co-cultivos y clara por centrifugación a 260 xg durante 5 min.
9. Inocular 9-10 días de edad huevos embrionados de pollo en condiciones estériles. Para ello, hacer un agujero en la parte superior de la cáscara del huevo, como se indica por Martínez-Sobrido et al. ^5.
10. Cubra el ingenio de la cáscara de huevoh derritió la cera utilizando un hisopo de algodón e incubar los huevos de gallina inoculados durante 3 días a 33 ° C.
11. Recoger el líquido alantoideo de los huevos embrionados infectados: Lávese las cáscaras de huevo con 70% de etanol. Abra el huevo con una grieta muy suavemente en la parte superior y retirar la membrana alantoideo usando pinzas estériles. Utilice una pipeta de 10 ml para recoger la mayor cantidad de líquido posible (normalmente 6-10 ml). Centrifugar a 260 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir el fluido alantoideo aclarado a tubos nuevos.

Inmunidad 2. Seguimiento de Vacunas específicas

1. Seguimiento de las células dendríticas péptido-cojinete (PED)
   1. Para la vacunación de ratón, anestesiar los ratones con 5% de isoflurano en oxígeno utilizando un vaporizador de precisión. Usar una pipeta de 200 l para administrar 50 l de PBS que contienen 10 ³ unidades formadoras de placa (pfu) de la vacuna que expresa el péptido SIINFEKL a través de gotitas directamente a las fosas nasales del ratón.
   2. Tres días después de la vacunación, euthanizratones E a través de la anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical.
   3. Levante la piel del ratón en la línea media justo debajo de la caja torácica con pinzas y cortar una pequeña incisión a través de la piel con unas tijeras. Desde el punto de incisión, hacen unos 3-5 cm de largo cortar a través de la piel hacia la cabeza y la cola, a continuación, dos incisiones 2 cm de la línea media lateralmente desde cada extremo. Pele la piel para revelar las cavidades peritoneal y torácica. Corte cuidadosamente a través de las membranas que rodean el peritoneo para exponer el tórax.
   4. Para acceder a la mediastino cortó el diafragma y la parte inferior de la caja torácica. Encontrar y eliminar 2 ganglios linfáticos mediastínicos (MLN), ligeramente dorsal y lateralmente adyacente a la timo, medialmente adyacente a la arteria braquiocefálica, cerca del lado ventral de la tráquea.
   5. Para cosechar los MLNs utilizan pinzas curvas. Coloque fórceps debajo de los ganglios linfáticos y tirar de ellos suavemente. Coloca los ganglios linfáticos en una placa de 6 pocillos que contienen 1 ml de DMEM y quitar cualquier connecticinco o tejido graso que rodea el nodo.
      1. Se burlan de cada muestra a fondo con dos agujas 26 G unidas a 1 ml jeringas. Para burlarse de los ganglios linfáticos, mantenga hacia abajo con una aguja mientras que romper abierto el ganglio linfático con la otra aguja. Cuando esto se hace correctamente, las células concentradas de ruptura del ganglio linfático se observan fácilmente en los medios. Pasar todo el material de tejido a través de un filtro de nylon de 70 micras para obtener suspensiones de células individuales.
   6. Suspensiones de células individuales Centrifugar durante 10 min a 260 xg en una centrífuga refrigerada. Resuspender el pellet de células en 2 ml de glóbulos rojos lisis (RbCl) Buffer para lisar las células rojas de la sangre. Permitir la lisis de proceder durante 3 min a RT.
   7. Neutralizar tampón rbcL a través de centrifugación y resuspensión de células en 2 ml de PBS enfriado en hielo.
   8. Células de la placa en placas de 96 pocillos en forma de U a una concentración de 10 ⁷ células / ml en un volumen final de 100 microlitros.
   9. Para el análisis de citometría de flujo, teléfonos bloque de receptores Fc usando1 g de anticuerpos anti-ratón CD16 / CD32 por 10 ⁶ células para 15 min en hielo.
   10. Placas de centrífuga y descartan los sobrenadantes por placa parpadeo. Incubar los pocillos individuales con la combinación anticuerpo de superficie de la elección. Típicamente, para la detección de células dendríticas en los ganglios linfáticos, el cóctel de anticuerpos debe incluir: 0,25 g de anti-CD11c, 0,25 g de CD11b, 0,5 g de MHC de clase II, 0,25 g de CD103 y 0,15 g de CD8a en un volumen final de 100 l.
   11. Para gating negativo, añadir 0,25 g de anti-CD3, CD19, NK1.1 o un cóctel linaje (Figura 2A). Estrategias de compuerta alternativos, así como los protocolos de indemnización adecuada de múltiples tintes fluorescentes se pueden encontrar en la página web del Proyecto Genoma inmunológica. Además de los marcadores de superficie de elección, añadir 1 g de un anticuerpo contra H-2K ^b unido a SIINFEKL al cóctel. Este anticuerpo disponible comercialmente permitirá la visualización de países en desarrollo in el que el péptido SIINFEKL se une a la superficie de MHC de clase I.
   12. Se incuban las células con anticuerpos de superficie durante 30 min en hielo. Proteja la placa de la luz. Placas centrifugar a 260 xg durante 5 minutos y lavar con 2 ml de PBS dos veces. Transferir las células a tubos de citometría de flujo para el análisis.
2. Evaluación de la vacuna específica de la proliferación de células T
   1. Obtener células T del donante disponible comercialmente a partir de ratones transgénicos TCR (ratones OT-I) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) en la que todas las células T CD8 generados son específicos para el péptido SIINFEKL. La eutanasia a los ratones por la anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. Cosecha bazo mediante la realización de una incisión en la cavidad abdominal. Coloque bazo / s en 2 ml de DMEM / bazo y eliminar el tejido conectivo y grasa.
   2. Generar suspensiones de células individuales de bazo tras el procedimiento descrito en 2.1.2 y 2.1.3.
   3. Para enriquecer aún más la suspensión de células individuales en las células T, aplicar protocolos de separación de cuentas magnéticautilizando cualquiera de los procedimientos de selección positivos o negativos ^12. Para diferenciar donante de células receptoras, utilice congenic ratones modo que por ejemplo los ratones receptores expresan el marcador leucocitario CD45.1 mientras que las células T del donante expresan CD45.2 ^12.
   4. Para etiquetar las células T, se incuban en 1 ml de PBS que contenía 5 mM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) en una densidad óptima de la célula de 5 x 10 ⁶ células / ml. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C protegido de la exposición a la luz. Después de la incubación, centrifugar las células a 260 xg durante 5 min, el sobrenadante de descarte, y Resuspender las células en 3 ml de suero fetal bovino (FBS) para neutralizar CFSE.
   5. Centrifugar las células a 260 xg durante 10 min y resuspender en el volumen adecuado de PBS de manera que 100 l de solución contiene 2 x 10 ⁶ células. Infundir congenic ratones receptores con 2 x 10 ⁶ células / ratón a través de la inyección seno retro-orbital ^13.
   6. La eutanasia a los ratones receptores en los días 3, 4 y 5 post-vacunación usando anestesia con isoflurano, seguido por dislocación cervical. Cosecha de los ganglios linfáticos del mediastino y preparar suspensiones de células individuales para citometría de flujo como se indica en 2.1.2-2.1.5.
   7. Identificar las células del donante por tinción de las suspensiones de células individuales en 100 l de un cóctel de anticuerpos que contiene: 0,25 g de anti-CD3 de ratón, anticuerpos CD4 y CD8; 0,5 g de anti-ratón CD45.1 o anticuerpo CD45.2 (dependiendo del fenotipo de las células del donante). Deje el canal FL-1 del citómetro de flujo abierto (FITC) para determinar el perfil de dilución de CFSE ¹² (Figura 2B).

3. Los ratones quiméricos para diseccionar Respuestas vacuna-Gene específica

NOTA: La generación de quimeras de médula ósea competitivos utilizando modelos de ratón con sede en DTR permite la discriminación de las funciones de las células específicas durante la respuesta inmune a las vacunas. Aquí mostramos una estrategia adicional por el cual combinación de DTR-expresión de los donantes cells con células de ratones knockout permisos para estudiar las funciones específicas de genes durante la inmunidad en compartimentos celulares específicos. En el ejemplo que generamos ratones con deleción específica de Toll-like receptor 3 (TLR3) en Langerin ⁺ CD103 ⁺ DC.

1. Preparación de células de donante de médula ósea
   1. Trabajar bajo un gabinete de bioseguridad de nivel II. Evite la contaminación mediante el uso de instrumentos autoclave exclusivamente.
   2. Para generar ratones quiméricos de la médula ósea, utilizar CD45.1 ⁺ congenic C57BL / 6 ratones hembra como receptores, y el uso de TLR3 ^{- / -,} Langerin-DTR / EGFP, o peso de los ratones que expresan CD45.2 ⁺ como donantes. El uso de donantes y receptores ratones congenic permite la diferenciación de las células donantes y receptores a través de citometría de flujo y esto permite que el injerto a ser evaluado.
   3. Para obtener células de médula ósea de donantes, la eutanasia a los ratones donantes con anestesia con isoflurano seguido por dislocación cervical. Con unas tijeras afiladas realizan incisiones alrededor de los tobillos para que el mmusculatura ouse está expuesto.
   4. Uso de fórceps romos tirar la piel del ratón y de la piel con suavidad desde el tobillo hacia las caderas de manera que los músculos de las piernas son visibles.
   5. Con unas tijeras afiladas cortar las piernas del ratón a la altura de las caderas y por encima de la cabeza del fémur.
   6. Coloque las piernas en una placa de Petri y en hielo. Trabaja rápido y eliminar todos los músculos para exponer los huesos.
   7. Fémures y tibias independientes. Coloque los huesos en una solución de etanol al 70% durante 5 min para eliminar posibles bacterias y colocarlos inmediatamente en otra placa de Petri que contiene 5 ml de DMEM libre de suero. Termina el hueso Cortar con unas tijeras afiladas y lave la médula ósea en el DMEM. Para ello, a ras 1 ml de DMEM en el hueso mediante la inserción de una aguja de 26 G unida a una jeringa de 5 ml. Asegúrese de que los huesos se ven de color blanco (vacío) después de lavado.
   8. Recoger todas las células de médula ósea de ratones donantes en 10 ml de DMEM. Generar suspensiones de células individuales de células de médula ósea pasando la cosecha a través de un filtro de células de 70 micras.
   9. Cloído suspensiones de células individuales de células de médula ósea por centrifugación a 260 xg durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga refrigerada. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de PBS. Agotar las células rojas de la sangre utilizando solución RbCl como se describe en 2.1.3 y 2.1.4.
   10. Recuento de células de médula ósea utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Evaluar la viabilidad celular mediante la determinación de las células muertas mediante tinción con azul de tripano ^13. De manera óptima, los rendimientos de uno de los animales individuales alrededor de 3 x 10 ⁷ células blancas de la sangre / ratón con una viabilidad de por lo menos 80%.
   11. En el caso de quimeras de médula ósea totales, preparar TLR-3 ^- células o en peso de donantes ^{- /.} La concentración celular óptima es de 2 x 10 ⁷ células / ml desde 2 x 10 ⁶ células en 100 l de PBS serán utilizados para el trasplante. Si no se utiliza inmediatamente, conservar las células del donante a -80 ° C, utilizando técnicas de congelación lenta y FBS con DMSO al 10%. Para el modelo quimérico mixta, mezclar células Langerin-DTR-donantes y TLR3 ^{- / -} Células del donante en una relación de 75:25. Preparar una mezcla de 75: 25 Langerin-DTR: wt células de médula ósea para generar ratones de control.
2. Irradiación del ratón y el trasplante
   1. Irradiar ratones hembras entre 6-8 semanas de edad en un irradiador fuente de Cesio-137. Dé ratones dos dosis de 550 rad 4 horas de diferencia. Irradiación de Split minimiza la toxicidad hepática aguda y por lo tanto reduce la letalidad del ratón debido al protocolo de irradiación.
   2. Después de la irradiación, mantener los ratones bajo tratamiento con antibióticos durante dos semanas. Dar antibióticos con el agua de bebida a 2,5-5 mg de Baytril / kg.
   3. 2-4 horas después de la segunda irradiación, los ratones trasplantados con células de la médula ósea del donante por vía intravenosa. Realizar la inyección de células del donante a través de inyección seno retro-orbital ¹³ y bajo anestesia con isoflurano usando volumen máximo de 100 l de PBS que contenía 2 x 10 ⁶ células.
   4. Cuatro semanas después del trasplante, injerto evaluar en una muestra de 100l de sangre periférica mediante citometría de flujo utilizando una máquina capaz de leer al menos dos colores. Para distinguir entre el donante y las células receptoras de radio-resistentes, utilizar comercialmente disponible CD45.1 marcado con fluorescencia y CD45.2 anticuerpos anti-ratón utilizando diluciones entre 1/100 y 1/200. Injerto óptimo de las células del donante debe ser de al menos el 80% de las células hematopoyéticas totales en sangre periférica.
3. Agotamiento de Vacunación y específica
   1. Vacunar a los ratones con la vacuna de la influenza viva atenuada recombinante vía intranasal. Para la vacunación de ratón, anestesiar los ratones con 5% de isoflurano en oxígeno utilizando un vaporizador de precisión. Usar una pipeta de 200 l para administrar 50 l de PBS que contienen 10 ³ unidades formadoras de placa (pfu) de la vacuna.
   2. Para generar el modelo final ratón, el tratamiento de ratones con 50 ng de DT diluido en 50 l de PBS por vía intranasal. Administrar gota a gota DT directamente a las fosas nasales de los ratones anestesiados como se describe en 3.3.1. Mi Tratarce con dosis diarias que comienzan el tratamiento en días -2 antes de la vacunación hasta el día 2 después de la vacunación (Figura 3B).

Resultados

Generación de vacunas de la gripe vivos atenuados recombinantes puede conseguirse mediante la transfección de plásmidos que codifican los ocho segmentos del virus de la gripe bajo el control de promotores bidireccionales ^5. Una vacuna de la gripe adaptada al frío por lo general contiene seis segmentos de una cepa adaptada al frío, así como el HA y NA de la cepa de la gripe de elección (por ejemplo, H1N1) (Figura 1A). El principio de adaptación al frío se basa en la replicación del vi...

Discusión

En este estudio se describe cómo la genética y modelos de ratones quiméricos inversa puede ser utilizado para dilucidar los mecanismos fisiológicos y moleculares de la inmunidad inducida por la vacuna. Genética inversa influenza se establece en muchos laboratorios y ha jugado un papel principal en la comprensión de la patogénesis de la gripe, la replicación y la transmisión ^17. Un punto clave en nuestro protocolo es el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío que expresan epítopos extraños. Aunqu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco&agudo; s Medio Eagle modificado (DMEM 1x)	Gibco RL-Life Technologies	41965-039
OptiMEM	Gibco RL-Life Technologies	31985-047
Lipofectamine 2000	Invitrogen-Life Technologies	11668-027
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)	PAA	p11-010
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A2153
Huevos embrionados	Valo biomedia Gmbh
PBS (1x)	Sigma-Aldrich	D8537
70 μ M Filtros de nylon	Greiner-Biorad	542-070
Tampón de lisado de glóbulos rojos (RBCL) 10x	BD Bioscience	555899
Ratón CD16/CD32 BD Fc Block (2.4G2)	BD Pharmigen	553142
APC-Anti-ratón SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)	Biolegend	141605
PE-Anti-ratón CD11c (HLA3)	BD Biosciences	553802
eFluor 450-Anti-ratón MHCII (Md/114.15.2)	eBioscience	48-5321-82
Pe-Cy7-Anti-ratón CD11b (M1/70)	Biolegend	101216
PerCp/Cy5.5-Anti-ratón CD103 (2E7)	Biolegend	121416
PE-Anti-ratón CD45.1 (A20)	eBioscience	12-0453-82
V500-Anti-ratón CD45.2 (1O4)	BD Bioscience	562130
PerCp-eFluor710 -Anti-ratón CD8a (53-6.7)	eBioscience	46-0081-80
APC-Cy7-Anti-ratón CD3&épsilon; (145-2611)	Biolegend	100325
eFluor450-Anti-ratón CD4 (GK 1.5)	eBioscience	48-0041-80
CFSE Colorante de proliferación	eBioscience	65-0850-85
Baytril 2.5%	Bayer	65-0850-85
Dimethil-Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Ovoalbúmina	Sondas moleculares	O23020
Toxina diftérica (DT)	Sigma-Aldrich	D0564
Tripsina-TPCK	Sigma-Aldrich	T1426
BD FACsCanto II Citómetro de flujo	BD Biosciences
análisis celular 9.5	Flowjo inc.
Mancha azul de tripano (0.4%)	Life technologies	T10282
Contador de células automático Countess	Invitrogen-Life Technologies	C10227

FlowJo software de