Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Las vacunas son uno de los mayores logros de la humanidad y han salvado millones de vidas durante el último siglo. Paradójicamente, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos que median las respuestas inmunitarias a las vacunas, tal vez debido al éxito general de la vacunación, que ha reducido el interés en los mecanismos moleculares y fisiológicos de la inmunidad de las vacunas. Sin embargo, varios patógenos humanos importantes, incluido el virus de la gripe, siguen planteando un reto para la vacunación, y pueden beneficiarse de estrategias basadas en el sistema inmunitario.
Aunque la genética inversa de la influenza se ha aplicado con éxito a la generación de vacunas contra la influenza vivas atenuadas (LAIV), no se ha abordado la adición de herramientas moleculares en las preparaciones de vacunas, como componentes trazadores para seguir la cinética de la vacunación in vivo. Además, la reciente generación de modelos de ratón que permiten el agotamiento específico de los leucocitos durante los estudios cinéticos ha abierto una ventana de oportunidad para comprender los mecanismos inmunitarios básicos que subyacen a la protección provocada por la vacuna. Aquí, describimos cómo la combinación de genética inversa y modelos de ratones quiméricos puede ayudar a proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo funcionan las vacunas a nivel fisiológico y molecular, utilizando como ejemplo una vacuna contra la influenza recombinante, adaptada al frío y con virus vivos atenuados (LAIV). Utilizamos LAIVs generadas en laboratorio que albergan trazadores celulares, así como quimeras competitivas de la médula ósea (BMC) para determinar la cinética temprana de la inmunidad de la vacuna y los principales mecanismos fisiológicos responsables del inicio de la inmunidad adaptativa específica de la vacuna. Además, mostramos cómo esta técnica puede facilitar los estudios de la función génica en animales individuales durante las respuestas inmunitarias a las vacunas. Proponemos que esta técnica se puede aplicar para mejorar las estrategias profilácticas actuales contra patógenos para los que se necesitan contramedidas médicas urgentes, por ejemplo, la gripe, el VIH, el Plasmodium y los virus de la fiebre hemorrágica como el virus del Ébola.
Introducción
La generación de memoria inmunológica en ausencia de enfermedad es la base fisiológica de la vacunación eficiente 1. Recientemente, los sistemas de enfoques basados en la biología han revelado que las vacunas exitosas, como la vacuna contra la fiebre amarilla, inducen una fuerte inducción de la respuesta inmune innata y la activación de varios subconjuntos de células dendríticas (DC), que a su vez, conducen a la activación del antígeno multilinaje células T específicas 2,3. Desde los DC son la única población de células inmunes con la capacidad de activar las células T vírgenes de antígenos específicos de 4, el estudio de su función....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados y siguiendo las directrices de la ley alemana de protección de los animales. Todo el personal que llevan a cabo experimentos con animales pasaron los programas de capacitación de acuerdo a la categoría B o C de la Federación de Asociaciones Europeas de animales de laboratorio de ciencias.
1. Generación de recombinante viva atenuada Vacunas contra la Influenza por genética inversa
NOTA: El protocolo detallado para la generación de virus de la gripe recombinantes mediante genética inversa ha sido descrito por estudios anteriores
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Generación de vacunas de la gripe vivos atenuados recombinantes puede conseguirse mediante la transfección de plásmidos que codifican los ocho segmentos del virus de la gripe bajo el control de promotores bidireccionales 5. Una vacuna de la gripe adaptada al frío por lo general contiene seis segmentos de una cepa adaptada al frío, así como el HA y NA de la cepa de la gripe de elección (por ejemplo, H1N1) (Figura 1A). El principio de adaptación al frío se basa en la replicación del vi.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este estudio se describe cómo la genética y modelos de ratones quiméricos inversa puede ser utilizado para dilucidar los mecanismos fisiológicos y moleculares de la inmunidad inducida por la vacuna. Genética inversa influenza se establece en muchos laboratorios y ha jugado un papel principal en la comprensión de la patogénesis de la gripe, la replicación y la transmisión 17. Un punto clave en nuestro protocolo es el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío que expresan epítopos extraños. Aunqu.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Sergio Gómez-Medina por su excelente apoyo técnico con experimentos con ratones. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Asociación Leibniz y el Centro de Infección Leibniz. A.L. es beneficiario de una beca predoctoral de la Escuela de Graduados Leibniz.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco&agudo; s Medio Eagle modificado (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Huevos embrionados | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μ M Filtros de nylon | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Tampón de lisado de glóbulos rojos (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| Ratón CD16/CD32 BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-ratón SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-ratón CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-ratón MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-ratón CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-ratón CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-ratón CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-ratón CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-ratón CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-ratón CD3&épsilon; (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-ratón CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Colorante de proliferación | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dimethil-Sulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovoalbúmina | Sondas moleculares | O23020 | |
| Toxina diftérica (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Tripsina-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Citómetro de flujo | BD Biosciences | ||
| análisis celular 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Mancha azul de tripano (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Contador de células automático Countess | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
Referencias
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Explorar más artículos
Administración intranasal de vacunasvacuna contra la influenza viva atenuadagenética inversaquimera competitiva de médula óseaanálisis por citometría de flujomigración de células dendríticasproliferación de células T CD8amplificación viral en embriones de polloaislamiento de células de ganglios linfáticosdepleción de médula ósea
