Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

Resumen

Este protocolo describe en detalle el método para generar progenitores neurales a partir de células madre embrionarias utilizando un método de monocapa sin suero. Estos progenitores se pueden utilizar para derivar tipos de células neuronales maduras o para estudiar el proceso de especificación neuronal y son susceptibles de escalado en formato multipocillo para el cribado de compuestos.

Resumen

La capacidad para diferenciar las células madre embrionarias de ratón (ESC) a progenitores neurales permite el estudio de los mecanismos que controlan la especificación neural, así como la generación de tipos de células neuronales maduros para el estudio adicional. En este protocolo se describe un método para la diferenciación de ESC para progenitores neurales utilizando suero libre, la cultura monocapa. El método es escalable, eficaz y resulta en la producción de ~ 70% de células progenitoras neurales dentro de 4 - 6 días. Se puede aplicar a ESC de diversas cepas cultivadas bajo una variedad de condiciones. Progenitores neurales se puede permitir que diferenciar aún más en neuronas funcionales y glía o analizado mediante microscopía, citometría de flujo o técnicas moleculares. El proceso de diferenciación es susceptible de microscopía de lapso de tiempo y se puede combinar con el uso de líneas de reportero para supervisar el proceso de especificación neural. Proporcionamos instrucciones detalladas acerca de la preparación de los medios de comunicación y la optimización de la densidad celular para permitir que el proceso de abe aplica a la mayoría de las líneas de la ESC y una variedad de recipientes de cultivo celular.

Introducción

Las células madre embrionarias son células pluripotentes derivadas de embrión temprano con la capacidad de proliferar indefinidamente in vitro conservando la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares adulto siguientes reintroducción en un embrión etapa apropiada (mediante la formación de una quimera), la inyección en singénicos o inmunocomprometidos hosts (mediante la formación de un teratoma) o in vitro sujetos a las señales apropiadas ^1. La diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales fue descrita por primera vez en 1995 y consistió en la formación de agregados de suspensión multicelulares (cuerpos embrionarios, EBS) en medios que contienen suero complementado con el ácido retinoico morfógeno ^2-4. Desde entonces una variedad de protocolos han sido desarrollados para permitir la diferenciación neural ^5. Muchos todavía utilizar la agregación, otros co-cultivo con la inducción de tipos de células y varios implican el uso de medios libres de suero. Todos los protocolos tienen ventajas unasnd desventajas y la naturaleza precisa de neural o células neuronales producidas también varía de acuerdo con el protocolo utilizado.

El protocolo ideal sería que robusto, escalable y hacer uso de los medios de comunicación y sustratos completamente definidos, ser susceptibles de monitorización no invasiva del proceso de diferenciación y el resultado en la generación de poblaciones puras de progenitores neurales capaz de ser modelada por las señales externas y para diferenciar en todos los subtipos neuronales y gliales con alta eficiencia y rendimiento en un tiempo relativamente corto. En los últimos doce años hemos estado utilizando un método para generar células progenitoras neuronales y neuronas de ratón CES en una baja densidad, la cultura monocapa adherente sin suero ^6-10. Este protocolo cumple muchos de los criterios establecidos anteriormente: en nuestras manos la eficiencia de diferenciación ha sido bastante constante durante muchos años y una variedad de líneas celulares, se puede escalar hacia arriba o hacia abajo (que utilizamos con éxito buques de placas de 96 pocillos a 15 cm de diámetro diella es) y los medios utilizados están bien definidos. El proceso es susceptible de microscopía timelapse para el seguimiento de la diferenciación y una variedad de señales de modelado puede ser añadido para inducir la generación de distintos tipos de subtipos neuronales (por ejemplo, Shh y Fgf8 para las neuronas dopaminérgicas ^6).

Sin embargo, hay algunos retos para la aplicación exitosa de este protocolo. Uno de los aspectos clave es la preparación cuidadosa de los medios de comunicación. Siempre nos preparamos los medios de comunicación en la empresa a pesar de la disponibilidad de alternativas comerciales. Uno de los suplementos utilizados (N2; véase el Protocolo) tiene modificaciones sobre el estándar versiones disponibles en el mercado. Por último, uno de los pasos más importantes para la aplicación exitosa de este método es la densidad celular óptima en chapado. Esto es principalmente porque mientras que la naturaleza autocrina de una de las señales que inducen (Fgf4 ¹¹⁾ requiere que las células están presentes suficientes para permitir viabil óptimadad y la diferenciación, a muy altas densidades de diferenciación se deteriora (posiblemente en parte debido a la producción autocrina de LIF ^12). Por ello es importante que la preparación tanto de los medios y chapado celular se realizan con cuidado y consistentemente para asegurar resultados óptimos.

Protocolo

1. Preparación de Medios

NOTA: El protocolo se basa en el uso de una mezcla de dos por separado medios de comunicación: DMEM / F12 suplementado con suplemento N2 modificado y Neurobasal suplementado con suplemento B27, típicamente en una relación 1: 1.

1. Preparar el suplemento N2 modificado por mezcla de los componentes en un tubo de 15 ml. No vórtice o filtrar esto; mezclar invirtiendo el tubo hasta que la solución es clara.
   1. Comience con la pipeta 7,2 ml de DMEM / F12, a continuación, añadir 1 ml de 25 mg / ml de insulina (compuesto en HCl 0,01 M) y mezclar bien invirtiendo el tubo. Se tarda un par de minutos hasta que la solución es clara.
   2. Añadir 1 ml de 100 mg / ml, apo-transferrina (compuesto en agua), 33 l de 0,6 mg / ml progesternone (compuestos en etanol), 100 l de 160 mg / ml (1 M) putrescina (compuesto en el agua ), 10 l de selenito de sodio 3 mM (compuesto en agua) y 666 l de 7,5% de albúmina de suero bovino y mezclar bien el tubo. Alícuota en 2,5 ml y se almacena a -20 °C durante un máximo de 2 meses.
2. Preparar los medios de comunicación.
   1. Para 250 ml de DMEM / F12 añadir 2,5 ml de N2. Mezclar bien pero no sacuda o filtro.
   2. Para 250 ml de Neurobasal noticias agregar 5 ml de suplemento de B27. Mezclar bien pero no sacuda o filtro.
   3. Mezclar los medios de comunicación de los pasos 1.2.1 y 1.2.2 en una proporción de 1: 1. En algunos casos una mezcla 1: 3 puede ser necesaria (complementado como la mezcla 1: 1 en el paso 1.2.4).
   4. Para la mezcla de añadir 0,5 ml de L-glutamina (concentración final 0,2 mM) y 3,5 l de 2-mercaptoetanol (concentración final 0,1 mM) y mezclar bien sin agitación. Almacene el papel a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas y evitar la exposición a la luz. Esta mezcla final se llama N2B27.
3. Preparar la solución de gelatina.
   1. Preparar una solución de gelatina al 1% en agua ultrapura y autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. Es importante que la botella se utiliza para esto es completamente limpio de los detergentes o desinfectantes, por lo que se recomienda que una nueva botella esutilizado para esto y es sólo alguna vez se enjuaga en agua ultrapura entre usos. Alícuota la solución al 1% en 50 ml alícuotas y mantenga a 4 ° C durante meses.
   2. Calentar una alícuota del 1% de gelatina en un baño de agua a 37 ° C hasta que se disuelva y añadir a 500 ml de solución salina tamponada con fosfato caliente (PBS). Mezclar bien y pipetear suficiente para cubrir el fondo de cada pocillo o placa. Permitir la gelatina para recubrir la superficie de al menos 30 minutos.

2. Plating las células

NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC de ratón cultivadas en 10% de suero con el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la sustitución de suero con LIF o medio libre de suero con LIF y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) o inhibidores de MEK y GSK3 (medios 2i) con o sin LIF. Sin embargo, el momento y la eficiencia de la diferenciación pueden variar en función de los medios de comunicación y las células (véase la discusión). Para los experimentos que se muestran aquí utilizamos la línea 46C ratón ESC (que tiene un reportero EGFP noqueó en one de los alelos Sox1 endógenos), que se cultiva en GMEM con 10% de suero y LIF. Para obtener resultados óptimos es importante que las células se disocian y se volvieron a sembrar en los medios N2B27; simplemente cambiando de medios de comunicación de GMEM / suero / LIF a N2B27 siempre resulta en una eficiencia de diferenciación reducida en comparación con resiembra las células.

1. Cultivar las células en GMEM con 10% de suero, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanol, y 100 unidades / LIF ¹³ ml. Para conseguir una cultura subconfluente de ratón CES, la placa 1 x 10 ⁶ células en un cultivo en matraz T25 que se llevará a 2-3 días.
2. Observar las células bajo el microscopio de campo claro. Cuando las células son subconfluent y listo para pasaje, enjuagarlos dos veces en PBS. Añadir 1 ml de reactivo de disociación de células y volver a la incubadora durante 2 - 5 min. Aunque la tripsina y otras enzimas también pueden ser utilizados para la disociación celular, que pueden tener un impacto negativo en la unión de células de modo que las densidades de chapado tendrán que ser Adjusted.
3. Una vez que las células están empezando a levantar de la placa, toque el recipiente para desalojar en una sola suspensión celular. Recoger las células en un total de 10 ml de medios de comunicación y de disociación celular reactivo y pipeta en un tubo de centrífuga de 15 ml.
4. Girar las células a 300 xg durante 3 min a TA.
5. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de pre-calentado N2B27 pipeteando arriba y abajo de 3 - 5 veces. Cuando pipeteando la suspensión hacia abajo, pipeta contra el lado del tubo para evitar la creación de burbujas. Contar las células con un contador de células automatizado o un hemocitómetro y registrar la concentración.
6. Preparar una suspensión de células que contiene el número deseado de células por unidad de volumen que se plateado por pocillo en pre-calentado N2B27. Una densidad de 10.500 células por cm ² en una placa de 6 pocillos (es decir, 1 x 10 ⁵ células por pocillo de una placa de 6 pocillos) es óptima. Ver Tabla 1 para sugerido número de células por cm ² y plavolúmenes de medios ting para una variedad de recipientes de cultivo celular.
7. Aspirar la gelatina del recipiente de cultivo y la placa la suspensión celular de acuerdo con la densidad y el volumen sugerido en la Tabla 1. No agitar las placas ya que esto concentrar las células hasta el centro. Coloque las culturas en una incubadora húmeda a 37 ° C, 5% de CO _2.
8. Cambie medios cada 1 - 2 días reemplazando todos los medios de comunicación con N2B27 fresco. Pipeta suavemente como el lavado de las células podría afectar la densidad y disminuir la eficiencia de la diferenciación en los siguientes días. Dónde viabilidad inicial después de la siembra es pobre, la placa de las células en una mezcla 1: 3 de los medios de comunicación N2 y complementados-B27 y cambiarlo a N2B27 después de los dos primeros días. Las células se empiezan a diferenciar y deben mostrar la expresión Sox1 (visible por fluorescencia verde del reportero en la línea celular 46C utilizado aquí) dentro de 4-6 días.

3. La tinción de inmunofluorescencia

NOTE: El protocolo se puede aplicar a cualquier tipo de recipiente. El volumen de cada reactivo se describe por pocillo de placa de 6 pocillos y se puede escalar a cualquier superficie. Replating no se recomienda debido a la viabilidad baja después.

1. Quitar medio de diferenciación y fijar las células mediante la adición de 500 l de 4% (v / v) paraformaldehído, dejar durante 15 min.
2. Lavar y permeabilizar las células con 2 ml de PBS-T (solución salina tamponada con fosfato con 0,5% (v / v) de Tween-20) dos veces. Las células se pueden mantener en PBS-T para un máximo de 2 meses a 4 ° C.
3. Reemplazar PBS-T con 1 ml de PBS-T con 10% (v / v) de suero (de la misma especie que el anticuerpo secundario). Incubar 1 hora en el balancín placa a temperatura ambiente para bloquear cualquier unión no específica.
4. Después de 1 hora, se lavan las células dos veces con 2 ml de PBS-T, y se incuban en 500 l de IgG de ratón contra βIII-tubulina (diluido 1: 1000 en PBS-T con 10% de suero). Poner en el plato oscilante, y dejar de O / N a 4 ° C.
5. Desde este paso, siempre proteger el buquede la luz. Lavar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia (diluido a 2 g / ml en PBS-T con 10% de suero). Póngalo en la placa oscilante durante 1 hora a temperatura ambiente.
6. Enjuagar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de DAPI (diluido a 0,5 mg / ml en PBS-T) y se deja durante 5 min.
7. Lavar las células de nuevo y mantenerlos en PBS-T. Las células están listas para ser fotografiados y se pueden mantener durante un máximo de 2 semanas a 4 ° C. Tenga en cuenta que la señal de las buenas prácticas agrarias se desvanece con el tiempo por lo que es inapropiado comparar la intensidad de las buenas prácticas agrarias de células fijadas y en directo o de células fijadas en diferentes momentos.

Resultados

En este experimento, se utilizó la línea celular 46C ^14, las células madre embrionarias de ratón con un reportero Sox1-GFP endógeno, para rastrear la diferenciación neuronal. Mediante el uso de esta línea celular, la expresión de Sox1, un marcador de progenitor neural, puede ser detectado por fluorescencia verde. Revestimiento de densidad es un factor crítico para lograr la diferenciación neuronal. Las células madre embrionarias de ratón se sembraron en placa de 6 pocillos a diferentes densidades que varían d...

Discusión

El protocolo de diferenciación neural monocapa ha estado en uso durante más de una década ^6. El protocolo es altamente eficiente, compuesto de medio definido, y hecho en un sistema monocapa que hace que el sistema sea más aplicable para preclínica (por ejemplo, detección de drogas) utiliza. Sin embargo, hay algunos factores críticos que determinan la eficiencia de diferenciación. Este artículo señala los factores y la solución para cada obstáculo.

Densidad de las células ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero fetal bovino	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Medio neurobasal	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Reactivo de disociación celular	Life Technologies	A11105-01
B-27 Suplemento, sin suero	Life Technologies	17504-044
Insulina	Sigma	I6634	Reconstituir con HCl estéril 0,01 M
Apo-transferrina	Sigma	T1147	Reconstituir con agua estéril
Progesterona	Sigma	P8783	Reconstituir con etanol
Putrescina	Sigma	P5780	Reconstituir con agua estéril
Selenito de sodio	Sigma	S5261	Reconstituir con agua estéril
Fracción de albúmina bovina V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamina	Life Technologies	25030-081	Asegúrese de que esté completamente disuelto antes de usarlo, ya que la glutamina suele estar sedimentada
Gelatina	Sigma	G1890
Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Thermo Scientific	140675
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos	Thermo Scientific	142475
placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Solución de aminoácidos no esenciales	Life Technologies	11140-050
Piruvato de sodio	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoetanol	Sigma	M7522
Factor inhibidor de la leucemia	preparado internamente como en Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)	Sigma	D9542	Proteger de la luz
Ratón anti y beta; III anticuerpo IgG de tubulina	Covance	MMS-435P
Anticuerpo IgG antiratón marcado con fluorescencia	Life Technologies	A31571	Proteger de la luz
Matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2	Thermo Scientific	156367