El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational.
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Artículo de método
Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational
En este artículo
Resumen
Resumen
El tráfico intracelular de receptores es una colección de procesos complejos y altamente controlados. El tráfico de receptores modula la señalización y la capacidad de respuesta general de las células a los ligandos y, a su vez, está influenciado por las condiciones intra y extracelulares, incluida la señalización inducida por ligandos. Optimizado para su uso con células cultivadas con placa monocapa, pero extensible a cortes de tejido que flotan libremente, este protocolo utiliza el inmunomarcaje y el análisis de colocalización para rastrear los cambios en el tráfico de receptores intracelulares después de intervenciones crónicas/prolongadas y agudas, incluido el tratamiento con medicamentos exógenos. Después del tratamiento farmacológico, las células se inmunomarcan dos veces para el receptor y para los marcadores de los compartimentos intracelulares de interés. A continuación, se utiliza la microscopía confocal secuencial para capturar fotomicrografías de dos canales de células individuales, que se someten a un análisis de colocalización computarizado para obtener puntuaciones cuantitativas de colocalización. Estas puntuaciones se normalizan para permitir la agrupación de réplicas independientes antes del análisis estadístico. También se pueden procesar fotomicrografías representativas para generar figuras ilustrativas. Aquí, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico de receptores inducido.
Introducción
Los receptores, en particular receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), son objeto de tráfico rutinaria intracelularmente, hacia y desde la superficie de la célula 1. Estos procesos complejamente orquestadas y estrechamente controlados dictan complementos del receptor de células disponibles 'y regulan la actividad del receptor temporal, la desensibilización y resensibilización 2-4. Es importante destacar que estos procesos son sensibles a ambientes celulares, incluyendo la actividad del receptor inducida por fármacos o inactividad. Es decir, las acciones de los ligandos en los receptores pueden alterar el tráfico intracelular de estos rece....
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Protocolo
Nota: Este protocolo es ampliamente compatible con varios modelos monocapa chapado célula / tejido de cultivo, los regímenes de tratamiento de drogas, y las metas en materia de etiquetado. Así, en el uso real, muchos parámetros específicos variarán según el diseño experimental. Aquí, las referencias a estos parámetros definidos por el usuario son genéricos. Condiciones de ejemplo, tal como se utiliza para obtener los resultados representativos, se incluyen en cursiva.
1. Soluciones
- Preparar tampón de lavado mediante la mezcla de 0,1 M Tris-Buffered hipertónica (300 mM) solución salina y 0,05% de polisorbato 20; pH 7,4 a TA.
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Resultados
Usando esta técnica, es posible cuantificar los cambios en el tráfico de receptor post-internalización siguientes ambos tratamientos crónicos / prolongada y agudas de drogas. Después de los tratamientos farmacológicos, la fijación y el etiquetado, de alta resolución microfotografías de dos canales son capturados de cada célula de interés. Imágenes representativas pueden combinarse con colocalización de color falso para generar figuras ilustrativas (Figura 1). Colocalizational análisis subsiguiente, como.......
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Discusión
Hemos optimizado el protocolo para el análisis de cultivos primarios de neuronas adultas ganglionares de la raíz dorsal (neuronas sensoriales primarias). También se puede utilizar, con poca o ninguna modificación, para células cultivadas en monocapa chapado ampliamente. El análisis colocalizational también es posible en cortes de tejido y otros tales preparaciones 11, sin embargo los componentes de tratamiento de drogas y la fijación del tejido / de preparación no sería apropiado.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de CIHR (MOP394808) y una Cátedra de Investigación de Canadá para CMCEWO era el beneficiario de una Beca de Postgrado de NSERC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Cloruro de Sodio | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ácido Clorhídrico | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albúmina de Suero Bovino | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatina de pescado de agua fría piel | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Placas de cultivo de células: 24 pocillos | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 círculos Microscopio Cubierta de vidrio | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Fosfato de Sodio Monobásico | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodio Fosfato Dibásico | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehído | Polysciences | 00380-1 | |
| Pinzas Dumont #5 - Estándar/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Anticuerpo anti-DOR para conejos | MyBioSource | MBS316175 | Utilizado a 1:1.500 |
| Anticuerpo anti-Rab5 de ratón | Sigma Aldrich | R7904 | Usado a 1:750 |
| Anticuerpo anti-Rab11 de ratón | Millipore | 05-853 | Usado a 1:500 |
| Anticuerpo anti-LAMP1 de cabra | Santa Cruz | SC8098 | Usado a 1:750 |
| Anticuerpo conjugado anti-conejo Alexa 488 | Technologies | A-21206 | Utilizado a 1:200 a 1:2.000 |
| Anticuerpo conjugado anti-ratón de cabra Alexa 594 | Life Technologies | A-11005 | Utilizado a 1:200 a 1:2.000 |
| Anti-cabra de burro Alexa 594 anticuerpo conjugado | Life Technologies | A-11058 | Utilizado a 1:200 a 1:2.000 |
Referencias
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. T....
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Reimpresiones y permisos
