Disparo reactiva Gliosis<em&gt; En Vivo</em&gt; Por un Prosencéfalo Lesiones Puñalada

Resumen

Este artículo describe un protocolo detallado para producir una lesión por apuñalamiento en el prosencéfalo en ratones adultos. La lesión por arma blanca induce una gliosis reactiva grave y formación de cicatrices gliales que pueden examinarse posteriormente mediante métodos inmunohistoquímicos estándar.

Resumen

Después de una lesión en el SNC, los astrocitos experimentan una amplia gama de cambios bioquímicos, morfológicos y moleculares denominados colectivamente astrogliosis reactiva. Los astrocitos reactivos ejercen efectos inflamatorios y protectores que inhiben y promueven, respectivamente, la reparación neuronal. Los mecanismos que subyacen a las diversas propiedades funcionales de la astrogliosis reactiva no se conocen bien. Lograr una mayor comprensión de estos mecanismos es fundamental para desarrollar estrategias terapéuticas para tratar el SNC lesionado. Aquí demostramos un método para desencadenar astrogliosis reactiva en el prosencéfalo de ratón adulto utilizando una lesión de apuñalamiento en el prosencéfalo. Este modelo de lesión es sencillo, fiable y sólo requiere un dispositivo estereotáxico y una hoja de bisturí para producir la lesión. El uso de lesiones por arma blanca como modelo de lesión en el prosencéfalo está bien establecido y es susceptible de estudios que aborden una amplia gama de resultados neuropatológicos, como la degeneración neuronal, la neuroinflamación y las alteraciones en la barrera hematoencefálica (BBB). Por lo tanto, el modelo de lesión por puñalada en el prosencéfalo sirve como una herramienta poderosa que se puede aplicar a una amplia gama de estudios sobre la respuesta del SNC al trauma.

Introducción

Un desafío importante para desarrollar terapias exitosas para tratar el SNC lesionado es una comprensión incompleta de los eventos multicelulares complejos que se desencadenan por el trauma. Los astrocitos reactivos están ganando cada vez más reconocimiento como un objetivo prometedor para nuevas terapias¹. Aunque históricamente se han considerado hostiles a la reparación neuronal, los astrocitos reactivos ahora se reconocen como componentes críticos de una respuesta neuroprotectora compleja y multicelular que incluye la atenuación de los procesos inflamatorios y la limitación del daño secundario y la neurodegeneración^2-6. Aunque las características neuropatológicas de la gliosis reactiva han sido bien definidas desde hace mucho tiempo, los mecanismos celulares y moleculares que regulan la gliosis reactiva y la diversa gama de consecuencias posteriores siguen siendo poco conocidos. Comprender los mecanismos que impulsan la gliosis reactiva, así como los eventos celulares y moleculares posteriores, es un paso importante hacia el desarrollo de estrategias destinadas a promover las propiedades neuroprotectoras de la gliosis reactiva, al tiempo que se atenúan los efectos perjudiciales.

Aquí demostramos un método para inducir astrogliosis reactiva severa en el prosencéfalo de ratones adultos utilizando una herida por arma blanca. A diferencia de otros modelos de lesiones cerebrales traumáticas (TBI), como el impacto cortical controlado (CCI) o la lesión por percusión de fluidos (FPI), que requieren un equipo especializado para producir una lesión, la puñalada del prosencéfalo solo requiere un dispositivo estereotáxico para estabilizar la cabeza y una hoja de bisturí No. 11. Por lo tanto, el modelo de lesión por puñalada en el prosencéfalo es más accesible para una amplia gama de laboratorios que no tienen acceso a los dispositivos especializados necesarios para crear una lesión FPI o CCI. El método descrito aquí permite a los investigadores desencadenar de forma fiable y reproducible una respuesta de gliosis robusta para investigar eventos celulares y moleculares posteriores. Una vez recuperados de la cirugía, los animales que han recibido una lesión por arma blanca en el prosencéfalo pueden sobrevivir durante períodos prolongados sin necesidad de atención especializada y pueden ser devueltos a la colonia para estudios agudos, intermedios o crónicos. Aunque menos traducible clínicamente que los modelos FPI o CCI de TCE, una lesión del prosencéfalo producida por una lesión por arma blanca sirve como un modelo experimental simple pero útil para investigar los mecanismos biológicos básicos que subyacen a la gliosis reactiva y otros eventos neuropatológicos después de un traumatismo en el SNC.

Protocolo

Adultos (3-4 meses de edad) los ratones macho en una mixta C57BL / 6 antecedentes fueron utilizados en este protocolo. Los animales se mantuvieron en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo, y se les permite el acceso libre a comida y agua. Todos los procedimientos realizados en este protocolo se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional Universidad Drexel.

1. Preparación Área Quirúrgica

1. Desinfectar mesa quirúrgica con etanol al 70%, y luego cubrir todo el banco quirúrgica con almohadillas absorbentes y organizar instrumentos quirúrgicos adyacente a estereotáxica.
2. Configurar equipos estereotáxica sin brazo manipulador. Organizar la almohadilla térmica en el estereotáxica y se puso a 37 ° C. Evite el sobrecalentamiento del animal mediante la colocación de un pequeño pedazo de toalla de papel o almohadilla quirúrgica entre el animal y la resistencia de calentamiento.
3. Con unas tijeras en autoclave, cortar pequeñas piezas de espuma de gel en autoclave en una placa Petri estéril que contiene solución salina al 0,9% estéril hasta ready para su uso.
   Nota: Mantener entorno de trabajo estéril utilizando instrumentos autoclave y suministros quirúrgicos estériles. Re-esterilizar instrumentos quirúrgicos durante el procedimiento o en medio de animales por inmersión en un esterilizador de cuentas de 10 a 15 segundos, según sea necesario. Mantener guantes limpios durante todo el procedimiento por el roce de las manos con etanol al 70%, según sea necesario, de desinfectar.

2. Prepping ratón de Cirugía

1. Retire del ratón de jaula y pesar (g).
2. Coloque el ratón en la cámara de inducción isoflurano y oxígeno a establecer 2 L / min y vaporizador de isoflurano a 5 para inducir un plano quirúrgico de anestesia, aproximadamente 3-5 min. Vigile la respiración lenta e inmovilización. Compruebe que el ratón está completamente sedado utilizando el reflejo pizca dedo del pie.
3. Cuando el ratón está completamente sedado, coloque en el marco estereotáxico, asegure la nariz en el cono de la nariz, que se adjunta con la tubería al isoflurano. Inserte barras de oído en el canal auditivo y ajuste, asegurando la cabeza es estable.
4. Afeitarse la cabeza de oreja a oreja, y de entre los ojos de detrás de las orejas.
5. Esterilizar la piel con alternancia de toallitas de alcohol isopropílico y solución de yodo betadine, 3 veces cada una.
6. Aplicar lágrimas artificiales para los dos ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento quirúrgico.

3. Procedimiento Quirúrgico

1. Supervisar la profundidad de la anestesia pellizcando la punta o la cola. El ratón es en el plano quirúrgico apropiado cuando no hay respuesta, y la respiración es lenta y uniforme.
2. Hacer una incisión en la piel parasagital desde justo detrás de los ojos hasta casi entre las orejas en un solo movimiento firme utilizando una hoja de bisturí No. 11. Mueva la piel a un lado y el clip lado derecho con pinza hemostática.
3. Claro cráneo de la membrana que recubre utilizando el lado opaco de la N º 11 bisturí y punta de algodón aplicadores. Opcionalmente, limpie el cráneo con algodón aplicador con punta sumergida en solución salina al 0,9%. Deje que se seque por completo.
4. Nosotrosing una pequeña regla, marcar el borde anterior de la craneotomía en 1 mm de caudal a la sutura coronal, y el borde izquierdo de la craneotomía en 1 mm lateral a la sutura sagital (Figura 1), con un marcador permanente. A continuación, marque los bordes derecho e caudales del craneotomía en 4 mm de las suturas sagital y coronal, respectivamente (Figura 1).
5. Con una broca de 0,5 mm, comenzar a hacer craneotomía perforando lentamente siguiendo el esquema marcador permanente. Asegúrese de no romper el cráneo completo. Presione suavemente en la pieza aislada del hueso parietal con el número 5 pinzas, áreas de debilidad dará paso a la presión. Cuando el hueso adelgazado es suficientemente débil en todo el perímetro, la pieza ósea está listo para el retiro.
   NOTA: Si la dificultad experiencias investigador retirar el hueso en una sola pieza, esto sugiere que el hueso no se ha adelgazado lo suficiente durante la perforación. Considere la perforación del cráneo aún más en los animales posteriores a FACILITAretiro fácil te de la pieza ósea.
6. Usando una jeringa de 10 ml equipado con una aguja de 23 G, aplicar una pequeña cantidad de 0,9% de solución salina para empapar el hueso aislado y el área perforado.
7. Fije el brazo manipulador al equipo estereotáxica. Adjunte una nueva hoja de bisturí No. 11 en el soporte de la sonda con el lado afilado de la hoja hacia rostral.
   NOTA: Aunque los tejidos rostral y caudal experimentan los bordes afilados y romos de la hoja, respectivamente, el daño mecánico inducido por la lesión penetrante es comparable en toda la extensión de la lesión. Observamos diferencias apreciables en las principales características de gliosis reactiva incluyendo la regulación positiva de la expresión de GFAP o proliferación, entre las secciones rostral y caudal.
8. Mantener el brazo manipulador fuera del camino, levante con cuidado el hueso aislado utilizando 5/45 fórceps en ángulo. Inserte la punta de la pinza en el lado del hueso y ascensor aislado, el uso de apalancamiento de sacar el trozo de hueso dejado atrás en una full movimiento.
   NOTA: Tenga cuidado de no apuñalar el cerebro o perturbar la dura debajo del cráneo.
9. Tome un pequeño pedazo de la espuma de gel absorbible empapado y colocarlo sobre el cerebro al descubierto para evitar que se reseque y disfrutar de sangre que pueda estar presente.
10. Una vez que la espuma de gel está en su lugar, hacer pivotar el brazo manipulador en su lugar y ajustar la cuchilla hacia el centro de la craneotomía sobre la espuma de gel. Retire la espuma de gel y baje la hoja hasta que la punta toca la duramadre sin perforación de la duramadre. Marcos dorsal / ventral coordenadas utilizando la escala vernier en el brazo vertical de la estereotáxica.
11. Utilizando el brazo manipulador, baje lentamente la hoja exactamente 3 mm en el cerebro. Esto se logra mediante el uso de las marcas de escala vernier en el brazo manipulador. Permita que la cuchilla para permanecer en el lugar durante 5-10 seg. Mueva el brazo estereotáxica con rostral acoplamiento a la hoja a caudal tres veces lo que permite que la hoja alcance los límites rostral y caudal de la craneotomía antes de pasar al opposite final.
    NOTA: La duramadre no se elimina antes de insertar la cuchilla. En contraste con la duramadre de rata, que es de ~ 80 m de espesor ^7, la duramadre ratón es considerablemente más delgada (sólo unas pocas capas de células de espesor) y no produce una resistencia apreciable a la hoja de bisturí durante la inserción. Utilice una nueva hoja de bisturí para cada ratón para asegurar que cada animal recibe una lesión consistente.
12. Lentamente levante el brazo estereotáxica, la eliminación de la hoja desde el cerebro. Después de la eliminación de la hoja, colocar inmediatamente otra pieza de espuma de gel en la superficie del cerebro para absorber cualquier exceso de sangre o fluido.
13. Mientras tanto, retire el brazo estereotáxica y disponer de la hoja de bisturí No. 11. Una vez que el sangrado se ha detenido, quitar la espuma de gel.
14. Cierre de la herida mediante sutura la piel con sutura no absorbible, tal como Ethilon o prolene. Las suturas deben ser retirados de 9-10 días después de la cirugía.
15. Devuelva el ratón a su jaula, y permitir que el ratón para recuperar lentamente en un heating almohadilla y el monitor para detectar cualquier signo de malestar. Recuperación de la anestesia inducida por isofluorano-ocurre típicamente dentro de 2-5 min después de la eliminación de la isofluorano. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado recumbancy esternal.
16. Administrar 0,5-1 ml de lactato por vía subcutánea solución de Ringer para asegurar la hidratación.

Cuidado 4. Post-quirúrgica

1. Seguir de cerca los animales después de la operación hasta que la recuperación de la anestesia antes de regresar a la colonia.
   1. Para reducir el dolor y las molestias después de la operación, administrar 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección ip inmediatamente después del procedimiento.
   2. Observar los animales durante 2-3 días después de la operación de signos graves de angustia como los movimientos restringidos, falta de aseo, o pérdida de peso. La eutanasia a los animales que demuestran cualquiera de estos síntomas de angustia y retirar del estudio.
2. Para examinar la histopatología de los tejidos lesionados, la eutanasia de animales por stanperfusión intracardiaca dard.
   1. Brevemente, anestesiar los animales con una sobredosis de ketamina / xilazina, a continuación, intracardially perfundido con 15-20 ml de NaCl al 0,9%, o hasta que el hígado se borra de la sangre, seguido de 60 ml de paraformaldehído al 4% en la conclusión del experimento.
3. Diseccionar los cerebros y post-corrección para 2-4 h en paraformaldehído al 4% antes de ser transferido a la solución de sacarosa al 30%. Sección cerebros en un criostato de 40 a 60 micras, y el proceso mediante procedimientos histológicos o inmunohistoquímicos estándar, o como se describe en Garcia ^8,9.

Resultados

Porque los animales sometidos a este procedimiento no requieren períodos de supervivencia especializados cuidados postoperatorios, cortos o de tiempo a largo plazo se incorporan fácilmente en el estudio, en función de la necesidad de investigar la patología aguda o crónica después de una lesión. Principales características de gliosis reactiva, como la regulación positiva de GFAP y la hipertrofia del soma, se pueden observar ya en 2-3 días después de la lesión. La fase pico de la proliferación de astrocitos reactivos es ...

Discusión

Es fundamental que el cráneo o dura subyacente no se dañen durante la perforación. Utilice una ligera presión durante la perforación para asegurar el cráneo no está pinchado. Además, se debe tener cuidado al levantar la pieza del cráneo para asegurar la duramadre no se levanta con el hueso.

La lesión de arma blanca del cerebro anterior describe aquí los modelos de una lesión penetrante en el SNC. Aunque menos clínicamente traducible que los modelos de TBI como FPI o CCI, el modelo de lesión ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
Micro taladro de alta velocidad	Harvard Apparatus	724950
bisturí de acero inoxidable, #11	MedVet	JOR581S
pinzas angulares 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Esponja de espuma de gel 12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	DAKO	Dilución Z033429-2	- 1:20.000 (campo claro); 1:1.000 (fluorescencia)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	Dilución - 1:20.000 (campo claro); 1:500 (fluorescencia)
Cabra biotinilada anti-conejo	Laboratorios Vector	BA-1000	Dilución - 1:400 (campo claro)
Conejo biotinilado anti-ovejas	Vector Laboratories	BA-6000	Dilución - 1:400 (campo claro)
Alexafluor 488 cabra anti-conejo	Life Technologies	A-11008	Dilución - 1:400 (campo claro)
Alexafluor 568 burro anti-ovejas	Life Technologies	A-21099	Dilución - 1:1.000 (fluorescencia)
DAPI Tinción de ácido nucleico Life	Technologies	D3571	Dilución - 1:1.000 (fluorescencia)
Cresyl Acetato Violeta Sigma	Aldrich	C5042-10G	Dilución - 1% (campo claro)

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