Abstract
Электрофизиологические свойства клеток часто изучаются в пробирке, после оторвать их от родных средах. Тем не менее, исследование электрической передачи между удаленными клеток в организме требуется в естественных условиях, без артефактов записи ячеек, встроенных в их родной среде. Передачи электрических сигналов от раненых разматывать районах на заводе Уже давно пробудили интерес ботаников. Флоэмы, живой частью растения сосудистой, который распространяется по всему растению, был постулируется как основной ткани в электрической передачи в растениях. Отсутствие подходящих электрофизиологических методов создает много проблем для исследования электрических свойств клеток флоэмы в естественных условиях. Здесь мы представляем новый подход к внутриклеточной электрофизиологии сит элементов (СЭС), который использует живые тли, или другие флоэмы вскармливания hemipteran насекомых, интегрированной в электрической проникновения грател (EPG), схема. Универсальность, надежность и точность этого метода стало возможным записывать и изучать в деталях рану индуцированных электрических сигналов в МП центральных вен модель завода Arabidopsis THALIANA 1. Здесь показано, что EPG-электроды могут быть легко реализованы на внутриклеточных электрофизиологических записей СЭС в маргинальных вен, а также изучить способность реагировать МП с электрическими сигналами с несколькими внешними стимулами. Подход EPG применяется к внутриклеточной электрофизиологии МП могут быть реализованы в самых разнообразных видов растений, в большом количестве комбинаций растений / насекомых, и многие исследования направлены.
Introduction
Способность продуцировать междугородные электрические сигналы является выгодным черта многоклеточных организмов, что позволяет эффективно в ответ на внешние раздражители. Эта черта развилась независимо в растениях и животных, и, таким образом, представляет собой случай конвергентной эволюции. Учитывая, что электрические сигналы в сочетании с важных функций в организме животных, таких как нейронные передачи и сокращение мышц, молекулярной основы, механизма передачи, и функции стимул-индуцированной электрических сигналов у животных являются объектами интенсивных исследований. В отличие от этого, стимул-индуцированной электрической сигнализации в растениях получил небольшое исследование внимания. Хотя растения не имеют нервы или мышцы, там, кажется, достаточно доказательств, чтобы предположить, что стимул-индуцированной электрические сигналы в растения играют ключевую роль в их ответах на факторы окружающей среды.
Флоэмы, живой компонент растительного сосудистой, было постулировано в качестве основного субзали для передачи стимула-индуцированной электрических сигналов, из стимулированных / повреждены в нестимулированных / неповрежденные участки 2. Основные клетки в флоэмы являются сито элементы (СЭС), относительно простые, удлиненные клетки. Концы Сес подключены к другой МП, образуя непрерывный, низким сопротивлением, системы сито трубка, которая распространилась по всему растению. Есть, однако, очень мало исследований на электрических свойствах этих узкоспециализированных клеток. В этих предыдущих исследованиях, ученые обращались МП либо с стеклянные микро-электродов 3 или стеклянными электродами, которые были соединены, чтобы привить-вставленные стилеты тлей, после stylectomy (резка) 4. Стеклянные микроэлектродов изготовлены из стеклянных капилляров, что тянутся на одном конце с тепла в тонкий кончик менее 1 мкм в диаметре, а затем заполняют раствором KCl. Ag / AgCl или платиновой проволоки, вставляются в KCl-заполненной стеклянного электрода затем подключен к входу усилителя, а референтомЭлектрод вставляется в ванну окружающей клетку интерес, замыкая цепь. Эта установка записывает разность потенциалов между внеклеточной референтного электрода и внутриклеточной измерительного электрода, т.е. мембранного потенциала клетки 5. С помощью этого метода, Umrath сделал первый внутриклеточный запись из растительной клетке, с использованием водорослей Nitella 6,7. Nitella является относительно простой организм, крупных клеток, и, следовательно, поддаются внутриклеточных электрофизиологических экспериментов. В отличие от этого, введение внутриклеточных стеклянных электродов в небольших клетках многоклеточных, трехмерных наземных растений технически сложных, требует высокой квалификации исследователя, а также сложную визуализацию, микроманипуляции, и анти-вибрации оборудования. Хотя стеклянные электроды пригодны для записи из поверхностных клеток в растениях, таких как корень клеток эпидермиса 8, внутриклеточный recordinGS из клеток глубоко укоренились в ткани растения, такие как МП, повреждение индуцированных ответов очень вероятная причина, путая результаты. В 1989 году Фромм и Eschrich сообщили об использовании альтернативного метода, который называется «метод тли ', в котором стеклянные электроды, соединенный с тлей стилетами после stylectomy 4. Метод тля является минимально инвазивной, потому что гибкие стилеты не вызывают тканей или клеток повреждения также, как стеклянные электроды. Тли стилеты являются великое изобретение природы для проникновения растений и тлей значительно более опытный, чем люди в поиске МП. К сожалению, этот метод тля также весьма требовательны в плане технической экспертизы и оборудования. Кроме того, успех каждого эксперимента, который реализует этот метод полностью зависит от тли, находящегося в режиме подачи - с стилета стабильно, вставленной в SE, во время stylectomy. Думая в ретроспективе, можно увидеть, что шансы на успех этого метода можно было бы Improved путем добавления к экспериментальной установки инструмент, который позволяет идентифицировать или не тля стилет в SE при применении stylectomy.
В 1964 году, Маклин и Кинси описал "электронную систему контроля" для изучения пищевого поведения тлей в режиме реального времени 9,10. В этой системе, тля и стилет-проник растений были интегрированы в электрической цепи. Позже, в 1978 году, Tjallingii разработали модифицированную версию системы, называется "Электрические Проникновение График" (EPG) системы 11,12. В то время как оригинальный электронная система контроля был чувствителен к сопротивлению, исходящих потенциалов только с системой EPG, электродвижущая сила (ЭДС) возникла потенциалы, т.е. генерироваться на заводе или в насекомого, может быть записан в дополнение к потенциалам, вытекающих из сопротивление (R) в насекомого. Это представляет собой значительное улучшение, потому что как компоненты сигнала, ЭДС и R,обеспечить биологическую соответствующую информацию о событиях во время проникновения растений тлей. Что делает EPG предварительного усилителя чувствительны к R-компонентов является его относительно низкая входное сопротивление 1 ГОм, что близко к среднему значению сопротивления растений / тли. Небольшое напряжение смещения (Рисунок 1, V) приблизительно +100 мВ подается на заводе, который затем разделяется по растений и насекомых, с одной стороны, и входным сопротивлением, с другой стороны. Напряжения и их изменения измеряются в точке (рис 1а, б) между насекомым и входного резистора. Таким образом, R-компоненты представляют растительные тли сопротивления модуляции напряжения смещения, в то время как ЭДС-компоненты некоторая доля растений потенциалов на кончике стилета и потенциалов, вызванных в насекомое. Растительные потенциалы - наиболее значимые здесь - в основном мембранные потенциалы клеток растений проколоты тли стилетами. Насекомое потенциалы появляются, в основном,Потоковое потенциалы, вызванные движениями жидкости в течение двух стилета каналов, то есть, еда и слюнные каналы; никаких внутренних нервных или мышечных потенциалов не отражаются в EPG. На практике стилет наконечник функционирует как кончиком электрода. Все растительные клетки отрицательно заряженные внутри по отношению к положительному вне клетки. Электрический ток (т.е. движение ионов в водном растворе), вытекающих из внутренней во внешнюю и наоборот очень ограничено из-за высокой стойкости к клеточной мембране. Обычно потенциал покоя поддерживается постоянным. Однако, когда отрицательные ионы выйти или положительные ионы перемещаются через клеточную мембрану, мембранный потенциал уменьшается, т.е., это деполяризует '. Деполяризация происходит в случае возбуждения клеток. Ионы затем перейти в систему или, когда конкретные ионные каналы в мембране открываются или когда мембрана повреждена и ионы течь в и. Все клетки имеют ионные каналы и насосы в тон плазматической мембраны, которые приносят мембранный потенциал к уровню покоя, восстанавливая исходную концентрацию различных ионов внутри клетки. Потенциал покоя его изменения ЭДС компоненты, и, следовательно, метод EPG подходит для измерения их.
Рисунок 1. EPG-электроды. EPG-электрод является живым тли интегрированы в электрическую Проникновение График (EPG) цепи, чьи стилет вставлен в сито элемента (СЭ) в стабильном режиме подачи. Если стилет-пронзил SE находится в состоянии покоя (панель А), напряжения в цепи, записанного EPG, является стабильным и в покоящейся потенциального уровня (Панель C, отдых). Если SE возбуждается, его мембрана деполяризует (панель B), который визуализируется в EPG, как постепенное увеличение напряжения (панель C, деполяризации). Как ионного баланса в SE возвращает отдохнуть, то есть, это repolarзует, напряжение регистрируется EPG постепенно уменьшается до отдыха потенциального уровня (Панель C, реполяризации). В панели С, "А" и "Б" относятся к сценариям, представленным на панелях А и В, соответственно. V = Регулируемый источник напряжения смещения. Ri = вход резистор. Параллельно с внешним резистором 1 ГОм, усилитель имеет внутренний (в ОУ) высокая 1.5 ТОм резистор (панели А и В, в серый). По дистанционного управления выключателем EPG предварительного усилителя может быть изменена от нормальной до ЭДС-режим, который позволяет получить очень точные значения напряжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В следующем разделе мы предоставляем читателю базового протокола проведения экспериментов EPG, которая действует для обоих насекомых и растений сосредоточена ориентированных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. тля Разведение
Примечание: выбор растений и тлей видов для записей EPG зависит от научно-исследовательской целью. Для исследований на Arabidopsis THALIANA, тля капустная тля является целесообразным.
- Задняя Б. brassicae тли в теплице на капуста огородная. Держите растения, используемые для выращивания тли в клетках, для того, чтобы избежать загрязнения других растений. Держите тли воспитанию растений и экспериментальных заводов (в нашем случае В.oleracea, и А. THALIANA) в отдельных помещениях, чтобы избежать загрязнения экспериментальных установок с тлей.
- Перевести тлей на свежих растений каждые 2 недели, прежде, чем вызвать значительный ущерб растений, или перенаселение достижения. Трансфер 10-20 взрослых тлей на свежий выращивания растений, чтобы начать новую колонию.
- Монитор регулярно воспитанию растений на загрязнение нежелательных видов тлей, растительноядных насекомых других, тли паразитоидов, и Fungя, которые могут повлиять на здоровье тли колонии.
- Соберите взрослых, бескрылых тлей до одной недели после их окончательного линьки для записи EPG.
- После экспериментов, верните экспериментальные заводы, которые не были использованы в камеру роста, так как они часто имеют потомство, которое был произведен во время записи, которые могут непреднамеренно загрязнять другие растения.
2. Насекомые Проводка для EPG запись
- Для того, чтобы электроды насекомых, получить булавки латуни разъем (гвозди, Ø 1,2 мм), тонкой медной проволоки (диаметром 0,2 мм), очень тонкая золотая проволока (диаметр около 20 мкм), на водной основе серебра клей, простой маленький пайки болт с пайки жидкости и смолы порошковая проволока, Стереомикроскоп с 10-кратным увеличением, маленькими ножницами или скальпелем, два тонких щипцов, и пенополистирола листа или коробку. Примечание: Вортекс может быть полезным. Примечание: шаг за шагом протокол, чтобы электроды указано на рисунке 2.
- Для тлиобработка и нанесения клея, получим: маленький и мягкий акварель кисти camelhair (размер 2 или меньше) и штифты насекомых, таких как те, которые используются для коллекций насекомых, хотя прекрасно швейная игла или зубочистка может работать также. Шаг 4 показывает, как начать запись EPG.
- Шаг 1.
Примечание: Шаги 1 и 2 ниже показано, как подготовить электроды насекомых минус тля. Шаг 3 показывает, как подключить тля к электроду. Вакуумный фиксация тли рекомендуется во время монтажа, но не всегда требуется для тихоходных видов (например, Б. brassicae).- Включите пайки болт и расплавить некоторые проволока на его кончик (рис 2А). Смочите голову латунь соединительного пальца с некоторым пайки жидкости (рис 2B) и опустите его в расплавленный металл для пайки (рис 2С).
- Применение оболочку из расплавленного металла припоя на одном конце 1-2 см длиной кусок тонкой медной проволоки с (рис2D). Затем довести контактный и медный провод вместе против горячей болта (рис 2E) и переместить их вместе, чтобы от остыть и затвердеть (рис 2F).
- Шаг 2.
- Тщательно встряхните (или вихрь) флакон с серебряным клеем в течение нескольких минут, пока гладкая эмульсия не показано. Вырезать (ножницы или скальпель) несколько штук в золотой проволоки (около 1,5 см в длину) на объекте пластины стереомикроскопом (рис 2G).
- Возьмите медную булавку с пайкой медным проводом (сделано в разделе 2.3) и опустите свободный конец медного провода в маленькой серебряной резервуара клея, который будет собрались на внутренней стороне крышки флакона после его открытия (рис 2H). Примечание: Только небольшой капли необходимо.
- Перемещение клей-погружают конец медного провода к части золотой проволоки, во время подъема один конец, чтобы избежать размазывания клея на Стереомикроскоп объекта пластины. Попробуйте перекрываются Coppeг и золотая проволока на несколько мм (рис 2I), распределяющей клей вдоль перекрытия двух проводов.
- Подождите, пока клей не был высушен достаточно, чтобы держать провода едины. Проверьте клей контакт после сушки и добавить немного свежего клея с помощью булавки или другого куска медного провода, если некоторые части соединяемых проводов показать бесклеевыми части.
- После электрод готов насекомых, хранить его, например, вставленной в кусок пенопласта.
Примечание: длина золотой проволоки будет определять свободу передвижения тли: если он слишком короткий (менее 5 мм), тля может чувствовать себя скованными и не будет вести себя нормально; если он слишком длинный (> 2 см), тля будет двигаться свободно. Тли, как правило, чтобы перейти к адаксиальной стороне листьев, если это разрешено. Если золотая проволока коснется лист, сигнал будет короткое замыкание.
- Шаг 3.
- Тли может быть закреплена на месте с помощью легкого всасывания, с использованием вакуума; в этом случае, установите тон всасывающего устройства под стереомикроскопа. Поместите всасывающее отверстие в центре области.
- Тщательно встряхнуть флакон с серебряным клеем в течение нескольких минут (или до тех пор, вихря) гладкая эмульсия не образуется. Соберите тля с маленькой кистью.
- Включение всасывающего устройства и устанавливать тля на всасывающее отверстие (рис 2J), с задней части живота обратился к экспериментатору. С тонкой кистью, удалить любой поверхности воск от живота (обильные тлей капустные).
- Откройте флакон клея и смочить булавку с очень маленькой капли серебра клея (рис 2K). Нанесите капельку серебра клей на задней части брюшка тли (рисунок 2L-M). Пусть это капля полностью сухой в течение нескольких минут, энергично встряхните флакон клея снова и добавить второй капли серебра клея на верхней части первой. Примечание: В то время как серебро клей электрический проводник, она не вызывает значительноеповреждение кутикулы насекомого.
- После закрытия клей пузырек, вставки свободный конец золотой проволоки в мокром капли и держать провод еще позволяя клею полностью высохнуть (рисунок 2а). Избегайте размазывая клей на ногах или антенн и отбрасывать тля, если это произошло.
- Выключите устройство всасывания фиксации и осторожно поднимите насекомое (рис 2O). Если необходимо, используйте тонкую кисть, чтобы помочь в снятии тли от всасывающего устройства.
Примечание: Электропроводка В. brassicae не требует вакуума, так как они могут быть соединены на листе точного лабораторного ткани, шероховатая поверхность, которая обеспечивает тля с достаточно сцепления таким образом, чтобы он не будет отменен после нанесения капли влажной клея, чтобы его животе. После высыхания клея можно снять тля из ткани с помощью тонкой кистью. - Вставьте латунный штифт с проводной насекомого в пенополистирола и, при необходимости, продолжитьпроводки все другие насекомые, которые будут использоваться для записи сессии EPG.
Примечание: Эти протоколы проводки тлей хорошо работать для нас. Пользователь может найти его / ее собственный метод проводки тлей.
- Шаг 4.
- Положите растения в клетке Фарадея (рис 2P) на непроводящей поддержки: использовать чашки Петри или тарелку из стекла или пластика.
- Вставка растений электрода в почву в каждом горшке. Вставьте латунный штифт проводной насекомого во входной разъем на EPG предварительного усилителя (рис 2Q). Примечание: электрод почва не соответствуют первом электрода, используемого в других электрофизиологических методов. Он имеет напряжение смещения, необходимое для настройки и компенсации напряжений поляризации электрода.
- На интерфейсе программного обеспечения приобретение Стилет +, с фиксированной частотой дискретизации 100 Гц, введите имя файла, указать время записи, и написать текст, чтобы задать подробности эксперимента (лечение, завод / InSe КТ виды и т.д.) в комментарий линий 2 и 3.
- Опустите насекомых на подходящем месте посадки растения и начать сеанс записи, нажав на кнопку Пуск приобретения программного обеспечения интерфейса (Стилет +).
Примечание 1: максимум 8 каналов могут быть использованы одновременно в EPG создан. Один EPG-электрод или несколько электродов EPG-за завода могут быть использованы.
Примечание 2: когда предметом изучения является поведение тля, начать запись перед доступом завод тлей, чтобы не пропустить первые мероприятия проникновение растений. - Для изучения электрофизиологических ответов СЭС на раздражители, подождите не менее 10 минут после тля вступила в фазу флоэмы, для того, чтобы гарантировать, что тля находится в устойчивой фазе флоэмы проглатывании, и что сигнал стабильность базовой линии. Только тогда, запустить любую стимуляции растений эксперимент.
tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Создание EPG-электроды с тлей и других насекомых hemipteran для электрического проникновения графике (EPG) записей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Панели А.И., шаги, необходимые для подготовки EPG-электроды минус тля. Во-первых, расплавить кусок пайки металла на кончике пайки болт (A). Затем опустите голову духового штифт в капле жидкости пайки (B), и связаться с ним с расплавленным металлом на кончике пайки болт (C). Сразу после этого шага, обратитесь конец медного провода с наконечником паяльника болта, для того, чтобы приклеить ее к голове латунной штифта (EF). С помощью скальпеля или лезвия, вырезать кусок золотой проволоки (G). ПадениеСвободный конец медного провода (вступил в другой конец медной булавкой) на серебряной клея (H), и быстро присоединиться к золотой проволоки к нему (I), прежде чем серебро высыхает. Золотая проволока является отличным проводником, и может быть поляризован. В действительности, в большинстве случаев поляризация слишком мал, чтобы быть обнаружены, и если это так, то может быть компенсировано с напряжением смещения (V).
Панели JO, шаги, необходимые для подключения тля (или другой hemipteran насекомое) к электроду. Во-первых, тщательно поднять тля с тонкой акварельной кисточкой и поместить его на открытии вакуумный устройства (J). Включите вакуумный насос и крышка воздушного клапана отверстие в листе бумаги, чтобы применить всасывание. Опустите кончик пальца насекомых в серебряной клея (K), и положить небольшой клей капли на вершине брюшка тли, в соответствии с стереомикроскопа (LM). Вследующий ~ 20 сек, до серебра клея капли на тли высохнет, вставьте конец золотой проволоки насекомого электрода в мокрой капли серебра клей, и держать его на месте в течение 1-3 мин, пока серебро клей не имеет полностью высушивают на воздухе (N). В этот момент, отключить всасывания, удалив бумагу, которая охватывает воздушного клапана отверстие всасывающего устройства и аккуратно удалить тля, от всасывающего устройства: подъем тля после проводки часто требует помощи со стороны тонкой кистью (О).
Панель Р показывает обзор всей EPG создан в клетке Фарадея, и панель Вопрос показывает обзор комбинации растений тлей на EPG. Смотрите раздел 2 выше для более подробного объяснения этого процесса.
Маленькие буквы этикетки со ссылкой на пункты, которые нужно сделать EPG-электроды: с: пайка болт б: плавится металл пайки;C: пайки жидкость; d: латунь контактный разъем (ногтей); е: медный провод; F: Ø 18 мкм золотая проволока; г: устройство всасывания; ч: тля; я: на водной основе серебра клей, J: Клетка Фарадея; K: Завод Электрод; л: входной разъем (BNC) на EPG предварительного усилителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В предыдущем исследовании, мы внедрили методику EPG-электрода с целью характеризующие электрические сигналы, произведенные в СЭС midvein во гусеничного атаки 1. Midvein является предпочтительным местом введения для обычных стеклянных электродов, а также для стекла стилета электродов, потому что это SE-плотным и относительно высоким, следовательно, поддаются фиксации, необходимого для реализации этих методов. Здесь мы воспользовались универсальности электрода EPG с целью сбора информации от электрофизиологического труднее получить доступ к поисковикам, в частности, тех, в маргинальных вен листьев. Рисунок 3 показывает типичные EPG записи с SE в предельной вены А. THALIANA растение, которое содержит электрический сигнал, индуцированный дистальной ранения. В отличие от МП в крупных венах, МП в маргинальных вен ответил на удаленном повреждения с одной, медленно волны деполяризации, что может соответствоватьмедленно волна деполяризации в Центральной СЭС. В среднем, это удаленно индуцированной медленно деполяризации в СЭС краю листа имели среднюю продолжительность 61 ± 27 сек, и средняя амплитуда 37 ± 2 мВ (п = 3, означает ± SEM). Эти данные, получаемые с легкостью EPG-электродов, предполагают, что рана, вызванной электрические сигналы в единой раны листьями у распространилась из крупных сосудистого пучка в флоэмы в незначительных вен.
Здесь мы также использована надежность EPG электродов, чтобы исследовать, может ли SE реагировать на различных повреждающих стимулов, поставляемых в течение временного интервала порядка минут. Когда два листа вырезали ножницами на черешка-пластинка перехода, EPG-электрод помещается в неповрежденной листа обнаружены аналогичные ответы от той же SE в этих ран (рис 4а). В другом эксперименте, гусеница был использован в качестве агента ранении. Гусеница сначала вырезать не соседа лист, а затем, через несколько минут, он переехал тоа сосед листьев и вырезать его. В то время как первая рана в не-соседа листа индуцированной только медленный переходный деполяризацию, второй ранение в соседней лист индуцированной полный электрический сигнал, который содержит медленно и быстро деполяризацию, последовательно с ранних экспериментах 1. Эти данные показывают, что сито элемент можно обнаружить несколько событий ранив нанесенные другим листьев, поставляемые в течение нескольких минут друг от друга.
Рисунок 3. Внутриклеточные записи раны, вызванной электрических сигналов от сит элементов (SES) в маргинальных вен с EPG-электродов. Электрический Проникновение График передач (EPG) сегмента сигнала флоэмы вскармливания фазы тля капустная тля. EPG записанные тля кормит из SE находится в маргинальной вены листьев # 8 (Arabidopsis THALIANAДикого типа), как показано в мультфильме слева. Сигнал EPG показывает медленное волна деполяризации в краевой SE вскоре после резки проксимальный соседний лист (лист # 3). Ритмичные, маленькие, быстрые вниз компоненты сигнала представляют потоковых потенциалы, возникающие из ритмической вознесения сока по пищевой канал стилета на этапе проглатывании (сигнал Е2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Несколько электрические ответы на ранив стимулы в сит элементов (СЭС), приобретенные с EPG-электродов устойчивость к тли-завода (капустная тля - Резуховидка Таля). Взаимодействия и стабильность SE-вставленных тли стилетами важные свойства EPG-Элеctrodes, которые позволяют приобретение длинных записей (EPG часов). Здесь мы воспользовались этим, чтобы исследовать свойства, может ли SE ответить на два удаленных стимулов нанесения увечий. Панель показывает ответы на SE в двух искусственных событий нанесения увечий (лист резки ножницами) последовательно нанесенных на два разных сосед уходит. Существует интервал примерно 17 мин между двумя стимулами. Панель В показывает ответы на SE в двух последовательных событий естественно нанесения увечий. 4-й возрастной стадии гусеницы бабочки капусты (Капустница) был использован в этом эксперименте. Гусеница сначала вырезать не соседа лист (в отношении с EPG записанного листа), вызывая медленное, переходные деполяризации. Затем, примерно в 7 минут спустя, гусеница сократить еще соседний лист, который срабатывает сигнал двойной деполяризации (т.е., содержащий медленно и быстрые переходные деполяризации) в тлей записанные SE. Стрелки указывают время, когда раныбыли нанесены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья предусматривает подробный протокол для создания электрического Проникновение график (EPG) записей. Техника EPG хорошо известна, с 100-200 активных пользователей по всему миру, и это было осуществлено в течение многих исследований по различным темам, например:) Сопротивление растения-хозяина, чтобы тлей и других стилетоносных насекомых 13; б) растительных вирусов и патогенных механизмов передачи 14; в) инсектициды способ действия (токсичность и изменения поведения) 15; г) EPGs даже полезно, чтобы продемонстрировать, что тля бои выгодно для победителя, поскольку это увеличивает его эффективность кормления 16.
Обучение для подключения насекомых для записи EPG не трудно, но требует терпения и практический опыт в освоении. От изготовления электродов в конечном проводной насекомого, практика период одного или двух недель рекомендуется. В течение этого времени, исследователь ознакомиться себя / себя с обработкой выбраливидов насекомых и пройти через все шаги успешно. Критические шаги: пайка правильно, тщательно встряхивая серебро клей пузырек, прежде чем принимать клей капельку нужного размера - ни, ни слишком маленьким слишком большой - обеспечение надлежащего электрического и механического соединения, а также размещение золотую проволоку в серебряной капли на живот насекомого таким образом, чтобы не ограничивать движение насекомых. Неспособность правильно выполнить эти действия приведут к ухудшению электрического подключения, что приведет к данным плохой или неприемлемого качества. При подаче проводной доступ к насекомым растений, важно, чтобы визуально контролировать их в течение первого получаса записи. В течение этого периода, тлей привыкают к проводу, и может уйти от желаемого места записи, или упасть завода. Таким образом, один, возможно, потребуется повторно позиционировать тли в течение этого периода. В случае поведенческих целей, без повторного позиционирования не должно быть сделано после первого часаАльф час, чтобы предотвратить большие различия между повторами. Плохо расположенный или отброшены-офф лица должны быть отброшены.
В дополнение к предоставлению протокола для записи EPG, эта статья повторяет черты схемы EPG, которые важны для его применения в качестве способа в растениеводстве внутриклеточного электрофизиологии (рис 1). Главной особенностью EPG-электродов, что они очень соты электроды, которые позволяют для точных внутриклеточных записей из МП. В регулярном усилителя EPG, входное сопротивление является относительно низким, 1 ГОм (10 9 Ω). На практике это означает, что изменения сопротивления во время записи влияет на измеренный потенциал. Это не проблема в обычной внутриклеточного электрофизиологии со стеклянными электродами, которые, как правило, используют более высокие усилители входного сопротивления. Можно скорректировать изменения в сопротивлении, возникающих из плазматической мембраны и из других источников, используя Calibrвания импульсов, как в Сальвадоре-Recatalà др. 1. Другой вариант заключается в увеличении входного сопротивления регулярного EPG предусилителя, с 1 ГОм до 1,5 ТОм (1,5 х 10 12 Ω) или даже до 1 P (10 15 Ω, в зависимости от операционного усилителя заранее усилителя), что соответствует входным сопротивлением в обычных усилителей для внутриклеточной регистрации. Усилитель EPG с высшим входным сопротивлением называют здесь как система "ЭДС-режим EPG". В усилителе, переключатель отключает усилитель EPG нормально режима (рисунок 1). В ЭДС-режиме, метод EPG-электрод записывает растительной клетки потенциалы, как точно, как регулярные усилители, используемые в внутриклеточного электрофизиологии. Только нарушение оставили в EPG в ЭДС-режиме возникает из ЭДС компонентов тли во время кормления SE, но это довольно низкий и не повлиять на точность измерений. Если исследователь хочет, чтобы одновременной записиРеакция тлей в стрессовых факторов среды (например, изменения слюноотделения и приема) и информации мембранного потенциала SE, то нормально-режим EPG рекомендуется. В этом случае, применяя калиброванный импульс обеспечивает приемлемые, приближенные значения мембранного потенциала.
Отсутствие надлежащих методов для приобретения электрических ответов флоэмы сосудистой естественных настоящее время ограничения тип и количество вопросов, связанных с ответами экологического стресса растений. Исследователи внедрили электроды стеклянные 3 и стекло-стилет электроды 4 для приобретения внутриклеточных записей в МП в midvein. В отличие от этих двух типов электродов, EPG-электроды могут быть расположены практически на любой надземной части растения (и даже на корнях, с помощью корневых тлей). Таким образом, EPG-электроды будут способствовать более комплексные исследования на заводе электрофизиологии. Anotее преимущество EPG-электродов по сравнению с традиционными электродами, которые позволяют бывший в течение длительных периодов записи, что делает возможным расследование ответов одиночных МП на различные раздражители. Это важный биофизических функция, и может обеспечить интересующую информацию о том, как МП интегрировать информацию из различных внешних стимулов. В самом деле, данные, показанные здесь, доказывает, что МП реагируют на различного повреждения стимулов (рисунок 4), что оправдывает дальнейшее исследование этого важного биофизического функции СЭС.
Количество электрофизиологических исследований СЭС слишком мал, чтобы провести сравнение между данными, полученными с EPG-электродами и полученных с традиционными стеклянными электродами данных. На самом деле, насколько нам известно, нет данных в литературе по стимулированию индуцированных электрических сигналов в МП в Arabidopsis, приобретенных с традиционным методом, будет стеклянные электроды или стекло-стилета электроды. Использование стеклянные электроды, Родос иСотрудники обнаружили, что 3 тепла вызывает потенциал действия-как шипы в СЭС томатов. Быстро деполяризации, что они показали имело магнитуду около 70 мВ, происходящих на вершине небольшого, медленными деполяризации. Это согласуется с нашими электрических сигналов, полученных с помощью EPG-электродов 1, хотя следует соблюдать осторожность при сравнении электрических сигналов от двух разных видов растений, и индуцированные различными типами стимулов.
Электрод ЭПГ универсальный и элегантный инструмент для изучения электрофизиологических ответы клетках флоэмы различных видов стимулов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
VSR была поддержана IIF Мари Кюри Грант (ранение в землю, акроним для: Рана индуцированных электрических сигналов в Arabidopsis THALIANA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A.
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
