Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

Resumen

Cultivaron interferón-γ ensayo inmunospot ligado a enzimas a largo plazo se utiliza como una medida de respuestas de memoria centrales y se correlaciona con respuestas a la vacuna anti-micobacterianas protectoras. Con este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica son estimulados con antígenos de micobacterias y la interleucina-2 durante 14 días, permitiendo la diferenciación y expansión de las células T de memoria centrales.

Resumen

Las células efectoras y T de memoria se generan a través de la programación del desarrollo de las células ingenuas tras el reconocimiento de antígenos. Si la infección se controla hasta el 95% de las células T generados durante la fase de expansión son eliminadas (es decir., Fase de contracción) y las células T de memoria siguen siendo, a veces durante toda la vida. En los seres humanos, dos subconjuntos funcionalmente distintos de células T de memoria se han descrito sobre la base de la expresión de receptores homing de ganglios linfáticos. Las células T de memoria central expresan receptores de quimioquinas CC 7 y CD45RO y se encuentran principalmente en las zonas de células T de los órganos linfoides secundarios. Las células T efectoras de memoria expresan CD45RO, carecen de receptores CCR7 y visualización asociados a homing de los linfocitos a los tejidos periféricos o inflamadas. Células T efectoras no expresan ya sea CCR7 o CD45RO pero al encuentro con citocinas efectoras producen antígeno, tales como el interferón-γ. Ensayos de liberación de interferón-γ se utilizan para el diagnóstico de la tuberculosis bovina y humana ydetectar principalmente efector y efectoras de memoria las respuestas de células T. Respuestas de las células T de memoria central por las células T CD4 ⁺ a la vacunación, por otra parte, se pueden usar para predecir la eficacia de la vacuna, como se ha demostrado con la infección por virus de la inmunodeficiencia del simio de primates no humanos, la tuberculosis en ratones, y la malaria en los seres humanos. Varios estudios con ratones y seres humanos, así como datos no publicados sobre el ganado, han demostrado que los ensayos ELISPOT interferón-γ miden memoria central respuestas de células T. Con este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica se cultivan en la disminución de la concentración del antígeno durante 10 a 14 días (a largo plazo) de cultivo, lo que permite respuestas efectoras de pico y disminuyen; facilitando las células T de memoria centrales para diferenciar y ampliar dentro de la cultura.

Introducción

Las células efectoras y T de memoria se generan a través de la programación del desarrollo de las células T CD4 + vírgenes después del reconocimiento de antígeno. La diferenciación de las células T ingenuas CD4 + en las células productoras de citoquinas requiere el reconocimiento de patógenos por las células inmunes innatas, presentación de antígenos a las células T, co-estimulación y transcripcional cambios resultantes en la producción de citoquinas polarizada. Por ejemplo: las células presentadoras de antígenos producen interleuquina (IL) -12 en respuesta a patógenos intracelulares, que, junto con el reconocimiento del antígeno, promueve la diferenciación de las células T en células T helper 1 (Th1) ^1,2 por señalización a través de transductor de señal y activador de la la transcripción 4 (STAT4) y T-box expresada en células T (T-bet), que conduce a la activación celular, la producción de IL-2, la expansión clonal y el interferón (IFN) producción -γ ^3,4. Si se controla la infección, hasta 95% de las células T generadas durante la fase de expansión se eliminan (es decir, la contraccióncélulas en fase) y T de memoria siguen siendo, a veces durante toda la vida ^5. Sallusto et al. ^6, reveló dos subconjuntos funcionalmente distintos de células T de memoria en los seres humanos basado en la expresión de receptores homing de ganglios linfáticos. Células T de memoria central (MTC) expresan receptores de quimioquinas CC (CCR) -7 y CD45RO y se encuentran principalmente en las zonas de células T de los órganos linfoides secundarios. Tcm haber función efectora, un umbral de activación baja y mantener una alta producción de IL-2 y la capacidad proliferativa limitada. Las células T efectoras de memoria (TEM) expresan CD45RO, carecen de receptores CCR7 y visualización para homing a los tejidos periféricos o inflamadas. Las células efectoras no expresan ya sea CCR7 o CD45RO pero con prontitud producen citocinas efectoras, tales como IFN-γ, a partir del reconocimiento de antígeno.

Ensayos de liberación de IFN-γ (IGRA) se utilizan para el diagnóstico de la tuberculosis bovina y humana ^7. Mycobacterium bovis es el principal agente de la tuberculosis bovina (BTB), mientras que ca humanases de la tuberculosis son causados ​​principalmente por Mycobacterium tuberculosis. Con estas pruebas, sangre entera o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son estimuladas con antígenos de micobacterias durante 16 a 24 horas y la producción de IFN-γ en el sobrenadante se mide por ELISA o mediante la detección de células productoras de IFN-γ utilizando técnicas ELISPOT. Como resultado de la breve periodo de estimulación (es decir., De 16 a 24 h) y la producción rápida de citoquinas, ensayos ex vivo detectan principalmente respuestas efectoras y TEM. Esto ha sido confirmado por el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células en estos cultivos ^8-10.

Ex vivo respuestas de IFN-γ se incluyen habitualmente en el panel de evaluación de la respuesta inmune de las vacunas contra la tuberculosis, incluidos los que se utilizan para evaluar las respuestas de ganado. La mayoría de las vacunas contra la tuberculosis bovina eficaces provocan respuestas de IFN-γ específicas, pero no todas las vacunas que inducen respuestas de IFN-γ son protective. Además, los niveles de IFN-γ inducida por la vacunación, medida antes de la infección, no se correlaciona necesariamente con la protección. Por ejemplo, diferentes cepas de BCG pueden tener diferentes capacidades para inducir la respuesta ex vivo IFN-γ, a pesar de niveles similares de protección ^11. Por lo tanto, ex vivo IGRA son valiosos para el diagnóstico de la tuberculosis y para el acceso a la inmunogenicidad de la vacuna; Sin embargo, su uso como predictores de eficacia de la vacuna es limitada. Respuestas TCM para la vacunación, por otra parte, se pueden usar para predecir la eficacia de la vacuna, como se ha demostrado con la infección por virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV) en los primates no humanos, ^12,13 tuberculosis en ratones ¹⁴ y la malaria en seres humanos ^15,16.

Después de una respuesta inmune efectiva que resulta en la remoción de patógenos, Tcm se mantienen y proporcionar protección a una segunda infección eventual por el mismo agente. Una notable excepción a este escenario es M. infe tuberculosiscción de los seres humanos en los que los pacientes que reciben terapia anti-micobacteriana curativo son susceptibles a la re-infección ^17,18. Además, eventos que regulan la memoria inmunológica durante las infecciones crónicas, en el que la estimulación antigénica persiste, no están bien entendidas ^19. Durante las infecciones crónicas, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la tuberculosis, una respuesta significativa Tcm está asociada con un resultado favorable (por ejemplo, la latencia con la tuberculosis y la enfermedad subclínica con el VIH) ^20,21. Varios estudios con ratones y seres humanos han demostrado que los ensayos ELISPOT de IFN-γ en cultivo a largo plazo miden respuestas Tcm ^16,20-22. Con este ensayo, las PBMC se cultivan en la disminución de la concentración de antígeno para 10 a 14 días, lo que permite respuestas efectoras de pico y disminuyen; facilitando Tcm diferenciar y ampliar dentro de la cultura.

Ensayos de ELISPOT de IFN-γ cultivadas a largo plazo también se han utilizado en veterinariainvestigación, sin embargo, el fenotipo de células que responden ha sido difícil de evaluar debido a la falta de reactivos críticos, especialmente un anticuerpo para CCR7. Vacunas contra la tuberculosis bovina eficaces [por ejemplo. usando una dosis única de M. bovis bacilo de Calmette Guerin (BCG), seguido por BCG vacuna de subunidad Antígeno 85A-viral vectorizada, o M atenuada. bovis ΔRD1] provocar respuestas de ELISPOT cultivadas a largo plazo de IFN-γ después de la vacunación que se correlacionan con la protección (es decir, la carga micobacteriana inferior y disminuyó TB asociada a la patología) en contra de la estimulación subsiguiente con virulenta M. bovis ^23,24. Además, el número de células IFN-γ secretoras específicas de antígeno dentro de cultivos de PBMC a largo plazo son superiores a los 12 meses pero disminuyen a los 24 meses después de la vacunación BCG de terneros neonatales, se correlaciona con el grado de protección poste detectable M. desafío bovis ^25. En este escenario, el cultivaron ELISPOT de IFN-γ es unan herramienta importante para predecir la eficacia de la vacuna, proporcionando un medio para dar prioridad a los candidatos de vacunas para los ensayos de eficacia de alto costo. Adicionalmente, las técnicas de ELISPOT cultivadas se pueden adaptar para diversos huéspedes, patógenos y citoquinas mediante la alteración de antígenos o anticuerpos para una variedad de propósitos en diferentes campos de investigación.

Protocolo

1. Prepare las soluciones Siguiendo

1. Preparar RPMI completo (cRMPI) mediante la adición de suero bovino fetal (FBS) a una concentración de 10% (volumen / volumen), glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 M), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), penicilina -streptomycin (100 unidades / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina) y 2-mercaptoetanol (50 mM) en RPMI 1640.
2. Preparar 2 X dextrosa citrato ácido, mediante la mezcla de citrato de sodio (77 mM), ácido cítrico (38 mM), y dextrosa (122 mM), en agua destilada.
3. Preparar Ca ^{2 +} Mg ²⁺ fosfato libre de solución salina tamponada (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na ₂ HPO ₄ (dibásico, 10 mM), KH ₂ PO ₄ (monobásico, 2 mM) en agua destilada; ajustar el pH a 7,2.
4. Preparar PBS 1% (PBS 1% BSA) mediante la adición de albúmina de suero bovino en PBS (volumen / peso, 1 g / 100 ml de PBS).
5. Preparar PBS + 0,05% de Tween 20(PBST) mediante la adición de 0,05% de Tween 20 en PBS (volumen / volumen, 500 l de tween 20/1 L de PBS).
6. Preparar 100 mM tampón Tris HCL pH 8,2 mediante la mezcla de Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) en agua destilada.
7. Preparar solución de etanol al 35% por dilución de alcohol etílico (pureza ≥99.5%) en agua destilada (volumen / volumen, 35 ml de alcohol etílico / 100 ml de agua destilada).
8. Filtrar esterilizar cRPMI, 2 x dextrosa citrato ácido, PBS, PBS 1% BSA utilizando 0,22 micras filtros.

2. Las células cultivadas a largo plazo (14 Protocolo Día)

(Día uno)

1. Preparar soluciones de antígeno a dos veces la concentración final en cRPMI. Antígeno elección es crítico y debe adaptarse a la finalidad del estudio.
2. Diluir M. recombinante tuberculosis antígenos TB10.4 y el antígeno Ag85A a 2 g / ml (de cada antígeno; la concentración final es 1 mg / ml).
3. Diluir M. bovis derivado proteico purificado(PPD-B, Prionics Ag) a 10 mg / ml (la concentración final es de 5 g / ml).
4. Diluir la temprana secretora recombinante diana antigénica 6 (ESAT-6) y la proteína de filtrado de cultivo 10 (CFP-10) proteína de fusión (Reşat-6: CFP10) a 2 mg / ml (concentración final de 1 mg / ml).
   NOTA: Estos antígenos son inmunodominante IFN-γ la inducción de antígenos de micobacterias tuberculosa y se pueden incluir para estimular PBMC de M. bovis animales infectados. BCG o M. bovis ΔRD1 vacunado animales no responden a Reşat-6: CFP10, como la región que codifica estos antígenos (es decir, RD1) se suprime en estas cepas. Reşat-6: CFP10 utilizado en estos estudios fue una especie de regalo del doctor C. Minion, de la Universidad Estatal de Iowa. TB10.4 y Ag85A antígenos son antígenos inmunodominantes presentes en la vacuna virulenta y M. bovis cepas ^37. PPDB, como un derivado de proteína purificada, es un complejo de varios antígenos, incluyendo antígenos compartidos con micobacterias no tuberculosas. Infecanimales ted serán potencialmente responder a todos los antígenos (a saber: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: CFP10 y PPDb), mientras que los animales vacunados no deben responder a Reşat-6: CFP10 ^11.
5. Placa 500 l / pocillo de solución de antígeno por cuadruplicado para cada animal en una placa de 24 pocillos. Para este protocolo, utilice antígenos como una piscina; por lo tanto utilizan todos los pocillos contienen todos los antígenos y no hay controles (tales como, null o mitógeno) este paso. Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO _2. La temperatura normal del ganado es de 39 ° C; por lo tanto, algunos investigadores utilizan 39 ° C para el cultivo de células bovinas. Además, en ciertos casos con células humanas, de cultivo celular a 39 ° C proporciona un beneficio ^26,30 añadió.
6. Jeringas pre-carga acoplada con 16 o 18 G agujas hipodérmicas con 6 ml de 2 X ácido-citrato-dextrosa; y recoger 60 ml de sangre bovina por punción venosa yugular.
7. Aislar PBMC por centrifugación en gradiente de densidad estándar de las fracciones de sangre periférica capa leucocitariaAjuste de la concentración celular a 4 X 10 ⁶ células / ml como se describe por Maue et al. ²⁷
8. Añadir células (500 l / pocillo) en el antígeno precargado placa de 24 pocillos, en cuatro ejemplares de cada animal (paso 2.5). Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO _2.

(Días tres y siete)

9. Utilizando una técnica estéril, retire cuidadosamente 500 l del sobrenadante de cada pocillo sin alterar la capa de células.
10. Reponer volumen bien mediante la adición de 500 l / pocillo de cRPMI que contiene IL-2 (30 U / l, es decir, 15 U / pocillo; IL-2 humana recombinante Sigma I7908). Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO _2.

(Días 10 y 12)

11. Utilizando una técnica estéril, retire 750 l de sobrenadante de cada pocillo. Reponer el volumen con 750 l / pocillo de cRPMI (sin IL-2). Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO _2.

3. Ensayo ELISPOT (Protocolo de tres días)

(El primer día (12 ^días del protocolo de cultivo a largo plazo))

1. Etiqueta de la placa de ELISPOT adecuadamente para cada conjunto de muestras, para evitar errores cuando chapado células: las células a largo plazo, además de las células presentadoras de antígenos (APC), células a largo plazo sin APC y ex vivo células / corto plazo (Figura 1). Replica para cada tratamiento (es decir, la estimulación antigénica) que se debe hacer al menos por duplicado.
2. Preparar la solución de anticuerpo de captura mediante la dilución de ratón anti-bovina anticuerpo IFN-γ (MCA2112, CC330 clon) en PBS (8 g / ml).
3. Usando una pipeta multicanal pre-humedecer los pocillos de la placa de ELISPOT con 15 l / pocillo de etanol 35% durante 1 min. Para evitar daños en la membrana, no toque el fondo de los pozos con puntas de pipeta en cualquier momento durante el ensayo.
4. Lave la placa seis veces con 300 l / pocillo de PBS. Fluido de lavado debe ser desechada por inversión placa. Lava debe hacerse rápidamente, no permitir que se sequen los pozos de la placa.
5. Pipetear 100 l / pocillo de anticuerpo de captura anti-IFN-γ (del paso 1 anterior). Se incuba a 4 ° CO / N (mantener la placa en el interior de una bolsa de almacenamiento con cremallera).

(El segundo día (13 ^días del protocolo de cultivo a largo plazo))

6. Preparar soluciones de antígeno a dos veces la concentración final. Los tratamientos son: sin estimulación (cRPMI), PPD-B (20 mg / ml, concentración final: 10 mg / ml), cóctel de proteína de TB10.4 y Ag85A (2 mg / ml de cada proteína, concentración final: 1 mg / ml de cada proteína), Reşat-6: CFP10 (para la infección por M. bovis, 2 g / ml, concentración final: 1 mg / ml), y un control positivo, tal como hierba carmín (20 g / ml, concentración final: 10 g / ml). Otros mitógeno se pueden utilizar en lugar de PWM (por ejemplo, Concanavalina A).
   NOTA: para este paso antígenos componen cuatro tratamientos diferentes y son not utiliza como una piscina (como en el paso 2.5). Los cuatro tratamientos son: NS, PPDb, cóctel de proteínas (TB10.4 y Ag85A constituyen un tratamiento) y PWM.

Cultivo celular 4. corto plazo y adherente celular (APC) Aislamiento

1. Recoger 60 ml de sangre de los mismos animales desangrados en el día 1 (en: cultivo a largo plazo, 14 protocolo de día) y aislar PBMCs como antes.
2. Ajustar la concentración de células a 2 x 10 ⁶ células / ml. Tubos etiqueta claramente para evitar una mala asignación cuando chapado células. Estas células se utilizan para el aislamiento APCs y también como cultivo de células a corto plazo (paso 6.5). Tubos Label tanto con el número de animales y el tipo de cultura (en este caso: ex vivo, a corto plazo o células frescas).
3. Retire el exceso de anticuerpo de captura desde el ELISPOT por inversión plato. Lavar las placas 6 veces con 300 l de PBST.
4. Retire la mayor cantidad PBST posible. Pipeta 50 l de suspensiones de células a los pocillos etiquetados como células a largo plazo, además de vehículos blindados. Bloquear otra wells con 200 l / pocillo de cRPMI. Incubar 90 minutos a 39 ^° C o Pre-caliente cRPMI o 39 ^° C (necesaria para las etapas subsiguientes). Serán necesarios PBMCs frescas no utilizados para células adherentes (APCs) aislamiento en pasos posteriores y deben ser almacenados.

5. Las células cultivadas

1. Durante la incubación 90 min (etapa 4.4, cultivo a corto plazo y adherente etapa de aislamiento de células), las células cultivadas a largo plazo de la cosecha.
2. El uso de 5 o 10 l pipetas, medios de pipeta con células arriba y abajo para separar las células, se combinan la cuadruplicado replica de cada animal en un solo tubo de 15 ml. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 400 g.
3. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante por inversión del tubo. Desalojar el sedimento celular. Añadir 5 ml de PBS, volver a suspender suavemente pellet, si es necesario. Repetir la centrifugación. Repita el paso de lavado dos veces. Desechar el sobrenadante por inversión del tubo y suavemente las células en 1 ml cRPMI volver a suspender. Ajustar la concentración de célulasa 2 X 10 ⁵ células / ml.

6. Revestimiento del fresco y PBMCs cultivadas

1. Después de la incubación de 90 min, agitar las placas en la placa agitador durante 30 seg. Retire las células no adherentes por inversión plato. Pipetear 150 l / pocillo de tibia cRPMI (del paso 4, en: células de corto plazo y de células adherentes (APC) etapa de aislamiento).
2. Agite placas y deseche el fluido de lavado. Repita el lavado 3 veces. Añadir 100 l / pocillo de cada antígeno en pocillos apropiados (pre-marcado).
3. Para placa células, pipeta 100 l / pocillo de la suspensión de células cultivadas a largo plazo (2 x 10 ⁵ células / ml) en los pocillos etiquetados como células a largo plazo, además de vehículos blindados. Asegúrese de que las células a largo plazo añadido en este paso son del mismo animal como la APC ya está en el pozo. No mezcle las células cultivadas de largo plazo de APC y de diferentes animales.
4. Pipetear 100 l / pocillo de la suspensión a largo plazo de células cultivadas (2 x 10 ⁵ células / ml) en los pocillos sin APCs para la evaluación de las necesidades de APC a la respuesta de cultivo a largo plazo.
5. Añadir 100 l / pocillo de células a corto plazo (recién aisladas y se ajustaron a 2 x 10 ⁶ células / ml) para la evaluación de la respuesta ex vivo. Incubar las placas O / N a 39 ^° C / 5% de CO ₂ incubadora. Asegúrese de que las placas están mintiendo plana y no se apilan platos.
   NOTA: Si se desea el análisis del fenotipo celular, citometría de flujo se puede realizar como un ensayo auxiliar. Las células se sembraron en 96 placas de pocillos de fondo U (en lugar de ELISPOT placas) como se describe para el ensayo de ELISPOT. Adsorción de anticuerpos de captura (pasos 3.4 hasta 3.5) debe ser omitido. Las células se incubaron a continuación O / N a 39 ° C / 5% de CO2 y un protocolo de tinción celular estándar realizada. Reactivos de tinción celular se incluyen en la tabla de reactivos.

El tercer día (14 ^días del protocolo de cultivo a largo plazo)

6. Diluir anticuerpo de detección (ratón anti-bovina IFN-γ, CC3 clon02) a 5 g / ml en PBS 1% BSA. Desechar los fluidos de pocillos y lavar las placas: seis veces con PBST (300 l / pocillo), colocando en un agitador cada vez por 10 seg antes y en-entre lavados, una vez con dH ₂ O (300 l / pocillo), un adicional de 6 veces con PBST (300 l / pocillo) y dos veces con PBS (300 l / pocillo). Después las células se retiran de las placas, y si no se aplican las preocupaciones de bioseguridad, los procedimientos pueden realizarse fuera de cabinas de seguridad biológica.
7. Fluido de lavado Descartar. Retire la mayor cantidad de líquido de lavado como sea posible tocando la placa sobre papel de cocina. Añadir anticuerpo de detección (100 l / pocillo).
8. Incubar las placas durante 120 minutos a 39 ^° o C. Durante esta etapa de incubación, preparar la solución de fosfatasa alcalina siguiendo las instrucciones del fabricante. Treinta minutos antes de su uso (es decir, 90 min después de la adición de anticuerpo de detección a los pocillos) diluir el reactivo en PBST. Invierta el tubo suavemente para mezclar los reactivos y se incubaron a temperatura ambiente.
9. Después de la 120 min de incubación, desechar el exceso de anticuerpo de detección por inversión plato. Lave la placa 6 veces con PBST (300 l / pocillo). Retire la mayor cantidad de líquido de lavado como sea posible tocando la placa sobre papel de cocina.
10. Añadir 100 l / pocillo de solución de fosfatasa alcalina (del paso 3 arriba). Incubar las placas durante 45 min a RT. Deseche el fluido y lavar cada placa 6 veces con PBST (300 l / pocillo).
11. Prepare la solución de sustrato siguiendo las instrucciones del fabricante (Vector Azul AP sustrato III): Diluir reactivos en 100 mM Tris HCL pH 8,2. Pipetear 50 l / pocillo de la solución de sustrato.
12. Incubar a RT hasta que el color azul comienza a desarrollar (aproximadamente 30 min). Deseche el fluido y lavar platos con abundante cantidad de dH ₂ O. Retire la placa inferior para exponer la membrana, lavado posterior de pozos y permitir que la placa se seque al aire.
13. Leer las placas en el analizador inmunospot imagen o ELISPOT lector (Tabla 1), o manualmente, utilizando un estereomicroscopio. Alternativamente, mantenga placasen la oscuridad a temperatura ambiente hasta que la lectura. Debido a la alta estabilidad del sustrato de reacción, la calidad se conserva durante varios años.
    Nota: las concentraciones de antígeno y se optimizaron para evitar pozos con manchas incontables ^23,24,27,37. Es posible que la formación de manchas incontables ocurren en diferentes entornos o debido a la variación biológica. Si ese es el caso, la concentración de células debe ser optimizado de manera que se obtiene una respuesta de conteo punto legible.

7. Placas Lectura y análisis de datos

1. Realizar análisis según la guía lector Celular Technology Limited (CTL) placa ELISPOT (Tabla 1). Después de los recuentos de manchas se obtienen para cada uno de los pozos, calcular el promedio entre los duplicados. La respuesta inmune específica para cada estímulo antigénico se calcula restando el número medio de manchas en los pocillos no estimulados de la de los pozos estimulados por antígenos.

Resultados

Aproximadamente un mes después de la infección-aerosol con M. bovis (10 ⁴ unidades formadoras de colonias), PBMCs de infectada (n = 8) y los animales de control (n = 8) se cultivaron en presencia de antígenos y IL-2 durante 13 días. Desarrollo de respuestas Tcm después de la infección se determinó usando el ensayo de ELISPOT de IFN-γ. Representante Tcm (en presencia o ausencia de APC) y ex vivo IFN-γ respuestas de ELISPOT de animales infectados (tres animales) y un animal no infectado (un animal) se muestran en la Figura 1. Un éxito a largo plazo IFN-γ ELISPOT resultados del ensayo en células productoras de IFN-γ (SPOT-células formadoras, SFC) en condiciones estimuladas y cerca de la ausencia de una respuesta de los animales no infectados y en condiciones no estimuladas. Además, una fuerte respuesta de células T debería ocurrir en respuesta a PWM. Respuestas específicas a M. bovis fueron evaluados por PPD-B o Reşat-6: CFP10 estimulación antigénica. Como se muestra en la figura1, robusto Tcm y ex vivo respuestas a PPD-B y Reşat-6: CFP10 se detectaron desde los tres M. bovis infectados con animales. Un mínimo o ningún Tcm y ex vivo respuestas fueron detectados a partir del animal control. Además, se requiere la presencia de APCs para las respuestas óptimas Tcm por animales infectados, como se demuestra por las respuestas muy reducidos por las células a largo plazo cultivadas en ausencia de APC autólogas. Respuesta de IFN-γ por PBMCs de M. bovis infectados y los animales no infectados se presentan en la Figura 2. El número de SFCs de cada animal se calculó como el número medio de SFC en duplicados de las muestras en respuesta a PPD-B menos la respuesta respectiva al medio solo. Las respuestas fueron estimados por 10 ⁶ células. Las respuestas fueron diferentes (P <0.05) con base en el estado de infección, la presencia o ausencia de APC y la duración de cultivo (por ejemplo., A largo plazo la cultura frente al ex vivo la cultura).

La adquisición de imagen de las placas
1.	Encienda la máquina
2.	Abrir "Inmuno captura" software versión 6.3.
3.	Paso 1: seleccione el tipo de plato.
4.	Paso 2: placa de carga.
5.	Paso 3: seleccionar opciones de análisis.
6.	Paso 4: iniciar la exploración.
7.	Obtener imagen general de la placa.
8.	Expulsar placa.
9.	Salga de software "Captura Inmuno".
Contando las unidades formadoras de contado
1.	Abra el software de "Captura Inmuno Spot" Versión 5.0.
2.	Seleccione objec tipo t: normal.
3.	Seleccionar módulo de conteo: conteo inteligente.
4.	Paso 1: placa de carga.
5.	Paso 2: definir los parámetros de conteo: exactitud de la prueba de reconocimiento lugar en pozos con diferentes puntos.
6.	Iniciar recuento automático.
Control de calidad
1.	Abrir "inmunoensayo de captura" software versión 5.0.
2.	Seleccionar módulo de conteo: control de calidad.
3.	Paso 1: placa de carga.
4.	Paso 2: Analizar los pozos resaltados individualmente.
5.	Termine el control de calidad.

Tabla 1 - adquisición de imágenes lector Autoimmun Diagnostika ELISPOT y celular contando procedimiento.

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Figura 1. Imagen de pozos de un IFN-cultivadas a largo plazo γ ensayo ELISPOT. Ensayo de IFN-γ cultivadas de ELISPOT se realizó meses approximatelyone después del desafío con virulenta M. bovis (tres animales). Animales no infectados se incluyeron como controles (un animal) líneas celulares a largo plazo se generaron mediante la estimulación de PBMC con un cóctel de Ag85A recombinante (1 mg / ml), TB10.4 (1 g / ml), Reşat-6.: CFP10 (1 mg / ml) y PPD-B (5 g / ml) durante 13 días, seguido de transferencia a placas de ELISPOT en presencia o ausencia de APC autólogas. Células corto plazo consistían en PBMC aislado en días 13 y chapada directamente en placas ELISPOT. Células a largo plazo y corto plazo fueron estimuladas con PPD-B (10 mg / ml), Reşat-6: CFP10 (1 mg / ml), medio solo o hierba carmín mitógeno (5 &# 956; g / ml) durante 24 h.

Figura 2. Los resultados representativos de un IFN-cultivadas a largo plazo γ ELISPOT respuesta a M. bovis derivado proteico purificado (PPD-B). ensayo cultivadas de IFN-γELISPOT se realizó meses approximatelyone después del desafío con virulenta M. bovis (ocho animales). Animales no infectados se incluyeron como controles (células ocho animales a largo plazo se generaron mediante la estimulación de PBMC con un cóctel de Ag85A recombinante (1 mg / ml), TB10.4 (1 g / ml), Reşat-6: CFP10 (1 g / ml) y PPD-B (5 g / ml) durante 13 días, seguido de transferencia a placas de ELISPOT en la presencia o ausencia de APC autólogas. células a corto plazo consistían en PBMC aislado en día 13 y se sembraron directamente en la placa de ELISPOT . A largo plazo y shocélulas rt plazo fueron estimuladas con PPD-B (10 g / ml) o medio solo durante 24 h. Respuestas específicas de cada animal ^(10/6 células SFC) se presentan como respuesta a PPD-B (promedio de muestras por duplicado), menos la respuesta a medio solo.

Discusión

La producción de IFN-γ en ensayos de ELISPOT cultivadas a largo plazo se debe generalmente a Tcm en los seres humanos, pero ¿cómo esta respuesta se desarrolla en la cultura es poco conocida. Ya sea Tcm están presentes en la circulación y expandir in vitro, o si las respuestas Tcm el resultado de la diferenciación de las células efectoras y Tem en Tcm durante el cultivo no se conoce. Sin embargo, los estudios con muestras de seres humanos han encontrado que las células T CD4 ⁺ de ex vivo y ensayos de ELISPOT cultivado IFN-γ a largo plazo tienen especificidades de epítopo no relacionados, lo que implica que las respuestas Tcm no se desarrollan a partir de células efectoras ^28. Obviamente, la duración de la respuesta puede variar, pero si se logra aclaramiento de patógenos, con el tiempo, tanto ex vivo y las respuestas Tcm declinar. Además, las respuestas de los cultivos a largo plazo medidos temprano y mucho después de cebado antigénica (cuando la respuesta efectora es inferior) está demostrado que se correlaciona, lo que indica que circula poblaciones Tcm temprano y mucho después contracebado génica sigue siendo relacionada in vivo. Por otra parte, la magnitud de la respuesta ex vivo no parece estar relacionado con la magnitud de la respuesta de memoria ^29. Estos resultados sugieren que cultivadas respuestas de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo como resultado de la expansión in vitro de la MTC y una disminución asociada de respuestas efectoras en la muestra, en lugar de la diferenciación de las células efectoras en Tcm fenotipo.

Con el ganado, no se conoce la contribución relativa de efectoras y de memoria subconjuntos a las respuestas detectada por los ensayos de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo. Estudios recientes indican una correlación entre la vacuna suscitó cultivadas respuestas de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo y protección contra la infección experimental posterior con M. bovis ^23-24. Se ha informado de que la debilidad de las respuestas de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo a la vacunación están asociados con la ausencia de protección ^30. Ambos viven y matared vacunas inducen IFN-γ in vivo respuestas similares ex ELISPOT, pero la vacunación con BCG vivo provoca respuestas ELISPOT más fuertes a largo plazo cultivadas IFN-γ que hacer preparaciones de vacunas muertas. Curiosamente, las vacunas vivas son protectores mientras que las formulaciones muertos no pueden proporcionar protección contra el desafío con micobacterias virulentas tuberculosa ^{31-32, 33.}

Evaluación de las respuestas Tcm también es factible por la clasificación de estas células a partir de PBMC. Enriquecimiento directo de la MTC a partir de PBMC, sin embargo, requiere dispositivos caros, altamente capacitados personal y es difícil, ya que estas células no son numerosos en el torrente sanguíneo. La cultura a largo plazo de PBMC ofrece enriquecimiento de Tcm sobre Tem y células efectoras sin dispositivos caros; sin embargo, debido a que estas poblaciones de células T se expanden in vitro pueden ser menos representativa in vivo de respuestas de memoria. Es posible acceder a las respuestas de memoria IFN-γ (utilizando el cultivo a largo plazo o Tcm especieing estrategias) por ensayos distintos del ELISPOT como: pruebas ELISA de citoquinas ^34, arreglos de cuentas de citoquinas (CBA), tinción intracelular (ICS), o arrays de proteínas de citoquinas (CPA). Estos métodos; sin embargo, son generalmente menos sensibles que ELISPOT Ensayos ^35.

Una ventaja de ELISPOT es su capacidad para detectar la captura inmediata de la citoquina poco después de su liberación de la prevención de la dilución en el sobrenadante y la degradación por escisión enzimática o captación de citoquinas por otras células. ELISPOT ensayos detectan células individuales que producen citoquinas que proporcionan resultados precisos incluso con poca señal a escenarios de ruido (es decir, respuestas específicas bajo) ^35. También, con el ICS, la detección de citocinas antes de su liberación puede resultar en la falsa identificación de células productoras de citoquinas (por ejemplo., Debido a la modulación post-traduccional antes o durante el proceso de secreción) ^34. Los inhibidores del transporte de empleadas con ICS ensayos para minimizar la secreción de citoquinasdurante la estimulación de antígeno (conocido como proteínas de parada de Golgi) limitar la duración de la estimulación de células debido a la toxicidad celular de estas proteínas en última instancia afectan a la producción de citocinas ^35.

Con eso dicho - CBA, CPA y ICS son técnicas útiles para la medición de múltiples citocinas simultáneamente y / o para la determinación de la superficie celular de expresión de marcador (es decir, con ICS.). Por lo tanto, estos métodos se pueden utilizar en combinación con el ensayo ELISPOT de IFN-γ ^36. Mientras que los estudios de eficacia de vacunas de tuberculosis bovina anteriores midieron las respuestas Tcm a través de ensayo de ELISPOT, la detección de las respuestas Tcm por otras técnicas probable que dar resultados comparables. Es importante destacar que el ensayo ELISPOT es menos costoso y más sencillo de realizar que la CBA, CPA y análisis de ICS técnicas ^34. Recuento manual de la SFC es una alternativa a recuento automatizado, y las placas de ELISPOT se puede almacenar a TA durante largo período de tiempo con una mínima pérdida de calidad, antes o después de punto contaje ^37.

A largo plazo, la respuesta de IFN-γ culta ELISPOT se ha aplicado para evaluar las respuestas de memoria por humanos, y el ganado en la evaluación de las respuestas de la vacuna de la tuberculosis ^{14-16,31-32,33.} Respuestas Tcm también se supone que desempeñar un papel importante en las respuestas de acogida a varios otros agentes infecciosos de ganado, tales como:. Mycoides ⁴² Mycoplasma mycoides subsp, Anaplasma marginale ³⁸ y el virus sincitial respiratorio bovino ^39. Potencialmente, el ensayo ELISPOT a largo plazo podría ser adaptado para otras especies animales, citoquinas e infecciones. Estas aplicaciones más amplias serán especialmente útiles para aplicaciones de medicina veterinaria inmunológica debido a la corriente limitada disponibilidad de reactivos específicos.

Tcm respuestas son cruciales para la protección contra varias infecciones, pero medirlos temprano después de la infección / inmunización (para la predicción de evolución de la enfermedad o la eficacia de la vacuna) may ser engorroso. Análisis de la respuesta inmune bajo condiciones ex vivo y la estimulación antigénica cortos será más a menudo representan respuestas efectoras, debido a la superposición de las respuestas de memoria y efectoras, especialmente durante el comienzo de la formación de la memoria inmunológica. En el contexto de las enfermedades crónicas en la que la carga antigénica es continua, ex vivo respuestas evaluarán las respuestas de células efectoras o una combinación de memoria y células efectoras respuestas. El largo plazo ensayo de IFN-γ culta ELISPOT, descrito aquí, probablemente permite la medición de respuestas Tcm en lugar de las células T efectoras o respuestas de células T CD4 ⁺ combinados. En resumen, el ensayo ELISPOT de IFN-γ cultivadas a largo plazo ofrece un enfoque valioso para la estimación de respuestas de memoria de células T y ha sido empleado con éxito para evaluar las respuestas de memoria de varias especies a una variedad de agentes infecciones ^{12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Citrato de sodio (dihidratado)	Varios
Ácido cítrico (monohidrato)	Varios
Dextrosa	Varios
ELISPOT Placa de PVDF	Varios
Vectastain ABC – AP KIT Vector	Laboratories estándar	AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatasa Substrate	Kit Vector Laboratories	SK-5300
Ag85A	Lionex	LRP-0004.3	23, 24, 25, 37
TB 10.4	Lionex	LRP-0061.6	23, 24, 25, 37
PPDb	Prionics AG	7600055
rESAT-6:CFP10	Amable regalo Dr. Minion, Iastate		23, 24, 25, 27,  37
Ratón antibovino IFN-γ Clon CC302	Serotec	MCA1783B	23, 24, 25, 27,  37
Ratón anti-bovino IFN-γ Clon biotinilado CC330	Serotec	MCA2112	23, 24, 25, 27,  37
Ratón antibovino CD4 Clon CC8	Serotec	MCA1653GA
Ratón antibovino CD45RO Clon IL116A	Serotec	MCA2434GA
Rata antihumana CCR7 Clon 3D12	Abcam	ab95665
Ratón antibovino IFN-γ-Pe Clon CC302	Serotec	MCA1783PE
Antiratón caprino IgG2a- Alexa Fluor 350	Invitrogen	A-21130
Antiratón caprino IgG3 APC-CY7	SouthernBiotechnology	1080-193
Antirata caprina IgG-APC	Invitrogen	A10540
BD Cytofix/Cytoperm™	BD Biosciences	554714
BrefeldinA	Sigma-Aldrich	B7651
Pokeweed Mitogen	Sigma-Aldrich	L8777
Interleucina 2 humana recombinante	Sigma-Aldrich	I7908