Riñón murino Trasplante Técnica

Resumen

El objetivo de este manuscrito es describir los pasos necesarios para realizar un trasplante de riñón en un ratón, prestando especial atención a los detalles de la anastomosis arterial.

Resumen

La primera técnica de trasplante de riñón en ratón fue publicada en 1973¹ por el laboratorio Russell. Aunque otros laboratorios tardaron algunos años en dominar y utilizar esta técnica, ahora es ampliamente utilizada por muchos laboratorios de todo el mundo. En 1993 Kalina y Mottram ² desarrollaron y reportaron un importante perfeccionamiento de la técnica original, que utilizaba la aorta donante para formar la anastomosis arterial en lugar de la arteria renal, con un avance posterior procedente del mismo laboratorio en 1999 ³. Si bien uno puede llegar a dominar este modelo, una búsqueda en la literatura revela que muchos laboratorios todavía experimentan una alta proporción de pérdida de injerto debido a la trombosis arterial. Describimos aquí una técnica ideada en nuestro laboratorio que reduce enormemente el trombo arterial reportado por otros ^4,5. Esto se logra mediante la formación de un manguito de talón y punta de la aorta infrarrenal del donante que facilita una anastomosis más grande y un flujo sanguíneo más recto hacia el riñón.

Introducción

Desde 1973 el modelo de trasplante de riñón en ratones ha sido una valiosa herramienta de investigación, pero los problemas técnicos han impedido su uso generalizado. A través de los años, varios trabajos han sido publicados detallando mejoras / mejoras a este procedimiento. Como modelo de trasplante de órganos sólidos principalmente vascularizado este procedimiento es, probablemente, sólo superada por el modelo de trasplante heterotópico de corazón que también fue ideado por el laboratorio Russell en 1973 ^6. Ambos modelos se prestan a la investigación de las respuestas de rechazo alogénico, el desarrollo de la función retardada del injerto y la lesión por reperfusión de la isquemia.

Uno de los problemas más comunes que se informaron con el trasplante de riñón es la relativamente alta incidencia de trombosis arterial ^4,5,7 que también hemos experimentado en nuestro laboratorio. Por lo tanto, nos propusimos realizar una revisión de la literatura de la formación de trombos y posiblemente encontrar la causa de este problema técnico y elaborar también unsolución posible. La causa más probable de la trombosis es el camino algo tortuoso toma la sangre desde la aorta destinatario, en la aorta renal donante luego a la arteria renal del donante. Este camino provoca turbulencia en la arteria renal que puede conducir a la activación plaquetaria y la formación de trombos. Sobre la base de las recientes observaciones y una búsqueda de la literatura relevante ^8-14 se nos ocurrió una nueva técnica que ha reducido la trombosis a 0%.

La técnica descrita aquí varía de técnicas previamente reportados en la formación de un manguito de punta tacón arterial que las instalaciones mejoraron el flujo sanguíneo y reduce significativamente la formación de trombos. El manguito se forma dividiendo la aorta infra-renal través de la cara del ostium arterial renal en un ángulo de menos de 45 ^o al eje longitudinal de la aorta (Figura 1A y 1B). Esto se traduce en un manguito de aproximadamente 2 mm de longitud. Un parche de Carrel venosa está formado por transección de la rvena enal en el IVC aumentando así el diámetro del manguito. El donante abdominal aorta manguito punta tacón infra-renal es de extremo a lado anastomosa a la aorta abdominal destinatario y la vena renal del donante / parche IVC es de extremo a lado anastomosa al destinatario abdominal vena cava inferior (VCI) . El uréter se introduce entonces en y anclado a la vejiga como se ha descrito por Han et al ^3.

Para este estudio los trasplantes no tratados con sólo tiempos de isquemia caliente (es decir., Sin isquemia fría) se comparan. En este caso de isquemia caliente se refiere al tiempo desde el cese del flujo de sangre a través del riñón del donante (paso 1.11 a continuación) y la reperfusión del injerto en el receptor (paso 2.11 a continuación). Isquemia fría se refiere al tiempo que el riñón no se perfunde y se mantiene en almacenamiento en frío hasta el comienzo del procedimiento de implante.

Protocolo

Todos los ratones fueron adquiridos de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos en la Universidad de Colorado en Denver, Fondo Barbara Davis Centro Animal de acuerdo con las directrices del NIH y con la aprobación de la Universidad de Colorado en Denver IACUC.

1. donante de riñón Cosecha

1. Esterilizar todos los instrumentos, usar guantes estériles durante todo el procedimiento y mantener un campo estéril. Realizar todas las cirugías con el uso de un microscopio operativo.
2. Quitar quirúrgicamente riñones de donantes de ratón a partir de (kg 60mg / IP) donantes anestesiado con pentobarbital. Determinar la profundidad de la anestesia por toe-pizca, y observar la frecuencia respiratoria.
3. Clip de la piel luego inmovilizar el ratón por 4 vías restricciones. Preparar la piel con povidona yodada y cubra el ratón de forma estéril.
4. Haga una incisión abdominal vertical de 2 cm de la línea media y entrar en la cavidad abdominal. Retraer el intestino superior y exteriorizarloen el pecho. Mantenga el intestino envuelto en una gasa húmeda estéril durante todo el procedimiento.
5. Identificar los grandes vasos abdominales y movilizarlos, identificar las ramas lumbares y cauterizar o ligar con 10/0 sutura de nylon.
6. Inmediatamente distal a los vasos renales izquierdos burlan de la vena cava inferior (VCI) y la aorta abdominal (AA) de separación mediante disección roma largo de aproximadamente 2 mm. Ligar con nylon 10/0 y dividir pequeña arteriales y venosos ramas de los vasos renales.
7. Ahora separar la vena renal de la arteria renal cuidadosamente por disección roma de estas estructuras. Esto permite la creación precisa de un parche de Carrel en el extremo proximal de la vena renal, que se utiliza para formar una anastomosis de extremo a lado a los destinatarios IVC.
8. Identificar, ligar y dividir los vasos suprarrenal izquierda. Esto permite el acceso a la aorta suprarrenal y una sutura de seda 6-0 se coloca alrededor de la aorta en la preparación para la ligación, pero no ligado en este momento.
9. Movilizar el riñón, los vasos y el uréter desde el salpicadero de los alrededores. Gire el riñón a la derecha y ligar / dividir las ramas posteriores. Luego devuelva el riñón a la izquierda.
10. Ahora dirigir la atención hacia el uréter. Sin perturbar el hilio renal liberar el uréter del salpicadero cuidando circundante para preservar los vasos ureterales. Divida el uréter a nivel de los conductos deferentes. El riñón ya está lista para la recuperación.
11. Inyecte lentamente 300 unidades de heparina en la vena cava inferior distal heparinización así el donante. Amarre la sutura de seda 6-0 colocado alrededor de la AA suprarrenal y perfundir el riñón izquierdo a través de la aorta abdominal distal con 0,8 ml de solución salina de heparina (100 U / ml).
12. Una vez que la perfusión ha dejado de crear un parche venoso Carrel inmediatamente para eliminar el reflujo en el riñón. Retraer la vena renal hacia el riñón revelando la AA y la arteria renal debajo.
13. Divida la aorta adyacente a la arteria renal y la creación de un talón ae manguito como se muestra en la Figura 1. extraer el riñón, los vasos y el uréter del donante.
14. Extraer el riñón directamente a un receptor pre-preparado (0 min tiempo de isquemia fría) o se almacena a 4 ^{° C} en una solución de elección para un tiempo predeterminado hasta el momento de la implantación. Sacrificados los donantes por exsanguanation y dislocación cervical. El tiempo total para recuperar riñón del donante es de aprox. 15-20 min.

2. Riñón Implante Técnica

1. Anestesiar el ratón receptor con pentobarbital (60 mg / kg dosis inicial IP, 25mg dosis suplementaria / kg IP si es necesario). Determinar la profundidad de la anestesia por toe-pizca, y observar la frecuencia respiratoria. Clip de la piel luego inmovilizar el ratón por 4 vías restricciones y aplicar pomada oftálmica para los ojos. Preparar la piel con povidona yodada y cubra el ratón de forma estéril.
2. Haga una incisión abdominal vertical de 2 cm de la línea media y entrar en la cavidad abdominal. Retraer el intestinosuperiormente y exteriorizar en el pecho. Mantenga el intestino envuelto en una gasa húmeda estéril durante todo el procedimiento.
3. En este momento realizar una nefrectomía derecha. Ligar la arteria renal y la vena con suturas de seda 6-0. Extirpar el riñón distal a las suturas. Ligar el uréter con seda 6-0 y luego dividir proximal al riñón.
4. Aislar la aorta abdominal y la vena cava inferior (IVC) por debajo de los vasos renales. Coloca 4-0 lazos de algodón alrededor de la aorta y vena cava inferior superior, luego inferior al sitio de anastomosis. Identificar y ligar los vasos lumbares en el campo con 10-0 sutura de nylon.
5. Nudo de los lazos de algodón, primero el inferior seguido por el superior. De esta manera algo de sangre se retiene en la aorta haciendo que la aortotomía más fácil.
6. Forma la aortotomía con una aguja 30G para entrar en el lumen de la aorta. Extender la incisión con tijeras finas micro a una longitud de aproximadamente 2 mm.
7. Hacer fin a la anastomosis lateral del manguito aórtica donante punta tacón ala aorta destinatario de la siguiente manera. Coloque un nylon 10-0 estancia sutura puntada en la aorta del donante y para el ángulo inferior de la incisión en la aorta destinatario y corbata.
8. Coloque una segunda nylon 10-0 frente a la primera en la aorta del donante y la esquina superior de la incisión en la aorta abdominal y corbata. Hacer una línea de sutura continua de superior a inferior en la pared lateral de la aorta y corbata en contra de la estancia puntada colocado previamente. Entonces suturar la pared medial de manera corriente y corbata.
9. Hacer fin a la anastomosis lateral de la vena renal donante al receptor IVC de la siguiente manera. Perforar el IVC con una aguja 30G y extender la incisión con tijeras finas micro. Ate la vena renal del donante a la esquina inferior de la incisión en la vena cava inferior con nylon 10-0. Hacer una línea de sutura continua entre la vena renal y la vena cava inferior y corbata.
   NOTA: También es de vital importancia que todo el espesor pasa de la aguja de sutura incluyendo la adventit vascularIA y la íntima se logran. La eversión de los bordes también se asegura de que haya contacto-íntima a la íntima, que ayuda en el sellado y la cicatrización de las anastomosis. Mientras que un agente de coagulación hemostática puede ser útil para reducir las fugas, se recomienda que un cirujano en su lugar confiar en una buena técnica.
10. Asegúrese de que las anastomosis son "limpia". Es decir, que las paredes opuestas no queden atrapados al colocar puntos de sutura. Esto hará que una constricción significativa para fluir que se traducirá en un injerto fracasado y en casos extremos a la parálisis de las extremidades posteriores.
    NOTA: Otro factor muy importante es asegurarse de que la tensión de las líneas de sutura anastomótica también es óptima. Demasiado flojo y no habrá fugas irreversible, demasiado apretado y estenosis a fluir resultará. Si en el lado arterial esto dará como resultado una pobre perfusión del injerto, si es en el lado venoso dará como resultado un riñón congestionado.
11. Suelte el flujo venoso 4-0 lazo de algodón restablecer distal. Una vez hemostasis del venonos anastomosis se ha observado gradualmente aflojar proximal el empate 4-0 de algodón y atienda la anastomosis arterial para la hemostasia.
12. Retire los lazos de algodón del ratón una vez que ambas anastomosis se consideran seguros. Pierce la vejiga con una aguja 20 G creando dos agujeros.
13. Pasar la punta de pinzas curvas través de los orificios y tire del uréter donante a través de la vejiga con el fórceps con el extremo proximal del uréter estar anclado a la pared de la vejiga con dos suturas de nylon de 10-0. Recorte el exceso de longitud del uréter que sobresale del segundo orificio que permite el uréter se retraiga dentro de la vejiga y cerrar el agujero con dos suturas de nylon 10-0.
14. Devuelva el intestino en el abdomen. Cierre de la pared abdominal en dos capas usando sutura de seda de 5-0 de una manera corriente.
15. Administrar un bolo de 1,0 ml, cálido solución salina normal estéril en el abdomen como la reanimación con líquidos al cierre, e inyectar 0,8 ml de solución salina normal por vía subcutánea después de la operación. Ningún otro supportiSe requieren medidas VE durante la cirugía.
16. Recuperar el animal en una manta térmica. Tiempo de implante total es de aprox. De 35-45 min. Administrar analgésicos tales como buprenorfina, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml al comienzo del procedimiento y cada 6-12 hr durante 72 h post-op.

3. contralateral Nefrectomía

1. Dependiendo de los requisitos de protocolo, varios días después del procedimiento de implante, llevan a cabo una nefrectomía contralateral bajo anestesia con isoflurano (5% de isoflurano inhalado para la inducción, 1.5-2.0% para mantenimiento).
2. Introduzca la cavidad abdominal y retraer con suavidad el intestino a la derecha del animal. Exponer el riñón izquierdo y la disección roma de la fascia de los alrededores.
3. Ligar la arteria renal, vena y uréter con suturas de seda 6-0 y luego escindir el riñón por encima de las suturas y extraer el riñón. Tiempo operatorio total es de aprox. 10 minutos.

4. Evaluación del injerto

1. Medida creatinina séricay nueve utilizando el método de picrato alcalino (reacción de Jaffe).

Resultados

Esta técnica quirúrgica permite, ya sea para estudios de supervivencia / rechazo del injerto simples, o protocolos experimentales bastante complejas. En las figuras siguientes se demuestra las ventajas de utilizar esta técnica anastomosis arterial mejorada. Usando esta técnica, hemos reducido significativamente la incidencia de la trombosis arterial de 35% a 0% aumentando así la productividad. Hemos utilizado esta técnica durante más de un año con el mismo 0% Resultado trombosis mantenido. La figura 1 describe

Discusión

Dominar esta técnica de trasplante es difícil, pero una vez lograda es una herramienta de investigación muy poderosa. El cirujano/investigador paciente será recompensado por la atención al detalle y la consistencia de la técnica, que es la clave para dominar cualquier procedimiento quirúrgico, más aún en modelos animales pequeños. Las dificultades técnicas para dominar el trasplante de riñón de ratón son múltiples, y es muy probable que se deba adquirir experiencia en otros modelos de trasplante de animales pequeños ante...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Instrumento	Roboz #	Fine Science Tools #	Arosurgical #
Pinza de microdisección recta #5	RS-5015	11295-51
Pinza de microdisección curva #7	RS-5047	11297-00
Pinza dentada curva	RS-5137	11052-10
Tijeras de microdisección Vannas, cortas	RS-5610		09.140.08
Tijeras de microdisección, rectas, afiladas, largas		11.602.11
Portaagujas			11.549.15
	antimosquitos recta	91308-12
Tijeras de microdisección, rectas, romas	RS-5962	14078-10
Tijeras de microdisección, curvas, romas	RS-5981	14079-10
Micro retractor	RS-6540
Bandeja de instrumentos, 10" x 6 y frac12; ” x y frac34; "	RT-1350S
seda, 5/0, bobina		18020-50
Sutura
10/0 nylon			T4A10Q07
5/0 seda			E19A05N
Guantes		Cortinas
Biogel de Medex Supply Precept		, #64-9012-9
Jeringas		Aplicadores
de algodón B-D 1cc insulina, #329424		marca Fisher, #23-400-100
			povidona
yodada PDI, #B40600
4/0 Bridas
Algodón doméstico esterilizado en autoclave con instrumentos