El uso de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de alta resolución, una observación ex vivo de la paliza de los cilios ependymal móviles ubicada dentro de los ventrículos cerebrales de ratones se demostró por imágenes en vivo. La técnica permite una grabación de la frecuencia de latido ciliar único y ángulo superando así como sus propiedades de estimulación de oscilación de calcio intracelular.
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Artículo de método
Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Células ependimarias Multiciliated alinean los ventrículos en el cerebro adulto. Función o estructura de los cilios ependymal anormal se asocia con diversos déficits neurológicos. La corriente de imágenes ex vivo en directo de la técnica de los cilios ependymal móviles permite un estudio detallado de la dinámica ciliares siguiendo varios pasos. Estos pasos incluyen: ratones eutanasia con dióxido de carbono de acuerdo con los protocolos de la Universidad de Animal Care Institucional de Toledo y el empleo Comisión (IACUC); craniectomía seguido de la eliminación del cerebro y la disección del cerebro sagital con un vibratome o cuchilla afilada para obtener secciones muy finas a través de los ventrículos laterales del cerebro, donde los cilios ependymal puede ser visualizado. La incubación de las rebanadas del cerebro en un plato con fondo de cristal personalizado que contiene medio de Eagle modificado (DMEM) / alta glucosa de Dulbecco a 37 ° C en presencia de 95% / 5% O 2 / CO mezcla 2 es esencial para mantener vivo el tejido duranteel experimento. Un video de la paliza cilios se registra a continuación, utilizando una alta resolución de microscopio de contraste de interferencia diferencial. El vídeo se analiza a continuación, cuadro por cuadro para calcular la frecuencia de latido ciliar. Esto permite distinta clasificación de las células ependimarias en tres categorías o tipos en función de su frecuencia de latido ciliar y el ángulo. Además, esta técnica permite el uso de análisis de imágenes de fluorescencia de alta velocidad para caracterizar las propiedades únicas intracelulares de oscilación de calcio de células ependimarias, así como el efecto de agentes farmacológicos en las oscilaciones de calcio y la frecuencia de latido ciliar. Además, esta técnica es adecuada para formación de imágenes de inmunofluorescencia para la estructura ciliar y ciliar proteína de localización de estudios. Esto es particularmente importante en los estudios de diagnóstico de enfermedades y fenotipo. La principal limitación de la técnica se atribuye a la disminución en el movimiento cilios móviles en vivo como el tejido cerebral comienza a morir.
Introducción
Los cilios son orgánulos basado-microtúbulos sensoriales que se extienden desde la superficie de la célula con el medio ambiente extracelular. Dependiendo de su nivel de organización de los microtúbulos, los cilios se pueden clasificar en dos tipos - "9 + 0" o "9 + 2". Funcionalmente, en base a su motilidad, éstos pueden ser clasificados como móviles o no móviles cilios 1. Cilios primaria es un término comúnmente utilizado para referirse a "9 + 0" cilios no móviles. Estos tienen nueve microtúbulos doblete paralelas (denotados por '9') y un par central de microtúbulos está ausente dentro de la vaina central (denotado por '0'). Sin embargo, a....
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Protocolo
Los procedimientos para el uso de los animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Toledo, de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de los Institutos Nacionales de Salud y la Guía para el Cuidado y Uso de animales de laboratorio.
1. Extracción del cerebro, Seccionamiento y Tejidos Preparación
- Sacrificio de tipo salvaje cepa de ratón C57BL / 6 por profundamente eutanasia con CO2 asfixia durante 5 min. Asegurar la muerte por dislocación cervical.
- Limpie el cabezal de ratón con etanol al 70%.
- R....
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Resultados
Medición de la función cilios ependymal en cerebro de ratón vivo
El método descrito en este protocolo se utiliza para controlar la función cilios ependymal y estructura en el tejido fresco diseccionado desde el cerebro del ratón, así como para vigilar y estudiar los cilios frecuencia paliza. Los pasos seguidos para llevar a cabo un experimento completo se representan en un diagrama de flujo esquemático (Figura 1). Es muy recomendable que el experimento se lleva a cabo dentro.......
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Discusión
Describe aquí es un protocolo para la preparación de tejido cerebral de ratón tanto para formación de imágenes en vivo y microscopía de fluorescencia que proporciona una rápida y sensible estrecha observación de los cilios ependymal dentro de los ventrículos cerebrales. Esta técnica no se limita a sólo el ventrículo lateral; que podría ser utilizado para observar los cilios en otros ventrículos cerebrales. Esta técnica de imagen proporciona una transmisión en vivo que se asemeja el movimiento del LCR por paliza ciliar e.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Charisse Montgomery por su servicio de edición. El trabajo de A. Alomran cumple parcialmente con los requisitos para una maestría en Farmacología. Este trabajo está financiado por el fondo de inicio intramuros de la Universidad de Toledo para W.A.A y la subvención de los NIH (DK080640) para S.M.N.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/GLUCOSA ALTA | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehído | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15710-SP | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Medio de montaje con DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anticuerpo antiacetilado a-tubulina | Sigma-Aldrich | T7451 | clon 6-11B1 |
| FITC Anticuerpo antiratón | Vector Labs | FI-2000 | |
| Placa de cultivo celular | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cubreobjetos (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratomo | Leica Biosystems | Criostato Leica VT1200S | |
| Leica Biosystems Microscopio | Leica CM1860 | ||
| Nikon | Aceite Nikon TE2000 | 60X | |
| Cubreobjetos para microscopio 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Medio de montaje con DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Cubo de filtro DAPI | Tecnología Chroma |
Referencias
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia....
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Reimpresiones y permisos
