Este protocolo describe cómo silenciar temporal y remotamente la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras las ratas realizan tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) con un paradigma conductual (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre los diferentes componentes del aprendizaje.
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Artículo de método
Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe cómo temporalmente y de forma remota silenciar la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras que los animales están involucrados en tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Diseñador-Receptores-exclusiva-Activado por Designer-Drogas) con un paradigma de comportamiento (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre diferentes formas de aprendizaje. Específicamente, la entrega mediada por virus se utiliza para expresar un receptor de proteína G inhibitoria modificado genéticamente acoplado (el diseñador del receptor) en una región del cerebro discreta en el roedor. Tres semanas más tarde, cuando los niveles de expresión del receptor de diseñador son altos, un agente farmacológico (el diseñador de Drogas) se administra sistémicamente 30 min antes de una sesión de comportamiento específico. El fármaco tiene afinidad por el receptor diseñador y por lo tanto resulta en la inhibición de las neuronas que expresan el receptor diseñador, pero es de otra manera biológicamente inerte. La región del cerebro permanece silenciada durante 2-5 horas (Depending de la dosis y vía de administración). Al finalizar el paradigma de comportamiento, el tejido cerebral se evaluó para la colocación correcta y la expresión del receptor. Este enfoque es particularmente útil para determinar la contribución de las regiones cerebrales individuales a componentes específicos de comportamiento y puede ser utilizado a través de cualquier número de paradigmas de comportamiento.
Introducción
Un reto apasionante en el campo de la neurociencia conductual es determinar los sustratos neurales de comportamientos complejos. Un número de técnicas tales como lesiones permanentes, la inactivación cerebral temporal a través de cánulas e implantes optogenética se han empleado para identificar las contribuciones de regiones discretas del cerebro a subcomponentes de comportamientos complejos. Si bien estos enfoques informan a nuestra comprensión de la especificidad regional durante el aprendizaje, cada técnica no es sin limitaciones. Específicamente, las lesiones permanentes suelen realizarse antes de las pruebas de comportamiento, por lo tanto sus efectos están pres....
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Protocolo
El uso de animales son aprobados por el Oberlin College Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión y están de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 21.
1. Preparación para la Infusión Viral
Nota: Este protocolo utiliza BSL-1 precauciones. Cuando se emplea BSL-2 precauciones, una bata de laboratorio desechable, guantes, cubiertas para zapatos, protecciones oculares y un respirador de partículas (tipo N95) son obligatorios. Todos los individuos de manipulación BSL-2 compuestos deben ser probados para encajar un respirador de partículas por una agencia de salud ....
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Resultados
Resultados de la Conducta
Al finalizar el experimento, la eficacia de la inactivación temporal específica de la región debe evaluarse cuantitativamente y cualitativamente. El presente ejemplo consiste en un paradigma 3-fase conductual (precondicionamiento sensorial), en el que se administró CNO para atenuar la actividad neuronal en la RSC durante las sesiones de preacondicionamiento para probar la hipótesis de que la RSC es necesario para la formación de asociaciones entre estímulos neutral
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Discusión
Este protocolo se describe cómo aplicar un enfoque de farmacogenética (DREADD) para investigar cómo una región específica del cerebro contribuye a una tarea de aprendizaje compleja de múltiples fases. Con la capacidad de silenciar temporalmente y de forma remota la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro a través de las fases de aprendizaje, esta combinación de enfoques ofrece una plataforma para investigar una amplia gama de comportamientos, incluyendo las formas más matizadas o enmascarados de aprendizaje.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a los autores de Robinson et al. 12 por sus contribuciones al manuscrito del que se deriva parcialmente este protocolo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Macho, Ratas Evans largas, 55-60 días de edad | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Precaución: Este es un compuesto BSL-1 | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Precaución: Este es un compuesto BSL-1 | |
| Clozapina-N-óxido R | & D Systems | 4936-10 Tapa de | jaula para ratas de drogas de diseño |
| (policarbonato) | Diseño alternativo | FT 8XL-PC | Se utiliza para cubrir jaulas de animales 48-72 horas después de la infusión |
| Papel de filtro (reemplazo) | Diseño alternativo | FP-R-1018XAD Papel de | filtro que va con las tapas de las jaulas Tornillo |
| banco de sobremesa | JETS | 2201-265 | Para sujetar tubos de microcentrífuga que contienen AAV en la campana |
| Bolsas de basura de riesgo biológico | Grapas | 113444 | Medline Revestimientos |
| riesgo biológico Bote de basura de riesgo biológico | United Solutions Bote de basura rectangular con ruedas de 34 galones con gancho y mango de bloqueo | ||
| Isoflurano, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anestésico |
| Estereotáxico doble para animales pequeños con consola de lectura de pantalla digital | David Kopf | Modelo 942 | Equipo quirúrgico |
| Barras para los oídos que no se rompen, juego de 2 (rata) | David Kopf | Modelo 955 | Equipo quirúrgico |
| Máscara de anestesia (rata) | David Kopf | Modelo 906 | Equipo quirúrgico |
| Taladro estereotáxico de alta velocidad incluye controlador de motor de mesa, pedal, pieza de mano, soporte de pieza de mano estereotáxica | David Kopf | Modelo 1474 | Equipo quirúrgico |
| Rebabas Microdrill, 0,9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Suministro quirúrgico |
| Bomba de jeringa automatizada con controlador micro4 | David Kopf | Modelo UMP3-1 | Equipo quirúrgico |
| Cuchilla cerámica desmontable Pro-animal kit de maquinilla | Ahdis | 21420 | Suministro quirúrgico |
| Limpiador de piel Betadine | Productos Perdue L.P | 67618-149-04 | Suministro quirúrgico |
| Pomada antibiótica triple | Suministro Medline | 53329-087-01 | Suministro quirúrgico |
| Pomada veterinaria Puralube | Solo Suministro Veterinario | 17033-211-38 | Suministro quirúrgico |
| Microscopio | Dino-liteAD7013MTL | Una alternativa al endoscopio de disección tradicional | |
| Dino-lite soporte rígido de sobremesa | Microscopio | MS36B | Equipo quirúrgico |
| 28 G 10 μ l jeringa | Hamilton | 80308-701SN | Equipo quirúrgico |
| Cubículo atenuador de sonido de MDF extra alto | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' de ancho x 22" de alto x 16" de profundidad |
| Cámara de prueba modular extra alta | Med Associates, Inc | ENV-007 | Equipo de comportamiento |
| Piso de rejilla de acero inoxidable | Med Associates, Inc | ENV-005 | Equipo |
| de comportamientoLuz | Med Associates, Inc | ENV-215M | Se utiliza como luz de la casa y luz de estímulo |
| Dispensador de pellets modular | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Equipo de comportamiento |
| Receptáculo de pellets, tipo taza | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Equipo de comportamiento |
| Detector de entrada de cabeza para ratas | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Equipo de comportamiento |
| Pellets de alimentos de precisión sin polvo, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Suministro de comportamiento Altavoz |
| jaula para cámara | ratas Med Associates, Inc | ENV-224AM | Equipo de comportamiento |
| Generador de audio programable | Med Associates, Inc | ANL-926 | Equipo de comportamiento |
| Paquete inteligente ctrl de 8 entradas/16 salidas | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Equipo de comportamiento |
| Gabinete de sobremesa grande y fuente de alimentación | Med Associates, Inc | SG-6510D | Equipo de comportamiento |
| Paquete de interfaz PCI | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Equipo de comportamiento |
| MED Intel Paquete de computadora central con monitor X Pro de 19" | Med Associates, Inc | COM-103V | Equipo de comportamiento |
| Paraformaldehído (grannular), 1 kg | Microsopía electrónica Ciencias | 19210 | Peligro: carcinógeno, pesa en la capucha |
| Anticuerpo monoclonal de conejo (HA-Tag) | Tecnologías de señalización celular | 3724S | Reactivo de histología |
| XP Anticuerpo monoclonal de conejo (GFP) | Tecnologías de señalización celular | 2956S | Reactivo de histología |
| Anti-conejo IgG | Tecnologías de señalización celular | 4412S | Suministros de histología |
| Portaobjetos Superfrost plus | VWR international | 483111-703 Suministros de | histología |
Referencias
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L.
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Reimpresiones y permisos
