El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Resumen

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

Resumen

La metástasis del cáncer es la principal causa de muertes asociadas al cáncer. Estudios recientes han demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) son importantes en la metástasis del cáncer. De hecho, el número de CTC se correlaciona con el tamaño del tumor. En este artículo, se proporciona una descripción detallada de una metodología para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de un modelo murino singénico de carcinoma hepatocelular (CHC) que permite el análisis posterior de los mecanismos moleculares potencialmente importantes de la metástasis tumoral de órganos sólidos. Este método es eficiente y reproducible. Es una técnica no invasiva y, por lo tanto, tiene potencial para reemplazar la biopsia invasiva de tejidos humanos que puede estar asociada a complicaciones. Por lo tanto, el método discutido aquí permite el aislamiento y la propagación de CTC a partir de muestras de sangre completa, de modo que puedan examinarse y caracterizarse. Esto tiene potencial para futuras adaptaciones a aplicaciones clínicas como el diagnóstico y la terapia dirigida personalizada.

Introducción

La comunidad de investigación del cáncer ha sabido de la existencia de células tumorales circulantes (CTC) desde que fueron observadas por primera vez por Thomas Ashworth en 1869¹. Desde entonces, se ha demostrado que las CTC son importantes en la metástasis tumoral y la progresión de la enfermedad^2-5. Hoy en día, los tumores sólidos son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Las CTC son células raras que se originan a partir de tumores primarios y viajan a través del torrente sanguíneo a diferentes órganos, de los cuales solo una pequeña fracción finalmente se convierte en metástasis^2-5. En particular, existe una correlación positiva entre el tamaño del tumor y el CTC número^3,4.

Una comprensión de la biología de CTC puede contribuir a la búsqueda de terapia dirigida. Además, las CTC pueden tener aplicaciones diagnósticas. Para lograr estas posibles aplicaciones clínicas, es necesario superar algunos desafíos actuales para el estudio de las CTC. Un desafío está relacionado con el hecho de que las CTC pueden estar presentes como células individuales o como grupos e incluso pueden ser capaces de cambiar su fenotipo en respuesta al microambiente sanguíneo². Además, la detección puede ser muy difícil, en parte, debido al bajo recuento de CTC (de unos pocos a cientos por mililitro) entre mil millones de células hematológicas por mililitro en la sangre⁶. Sin embargo, en los últimos años se ha intensificado la investigación sobre las posibles aplicaciones clínicas de las CTC procedentes de cánceres de órganos sólidos.

A pesar de estos esfuerzos, los desafíos de estudiar y comprender el papel de los CTC persisten debido a la rareza de los CTC y a la insuficiencia de las herramientas tecnológicas disponibles actualmente. A pesar de estos desafíos, el enorme potencial de las aplicaciones clínicas sigue siendo un incentivo para continuar la investigación sobre el papel de las CTC en la metástasis del cáncer.

Recientemente hemos logrado aislar y propagar CTC en cultivo celular a partir de un modelo de ratón singénico ortotópico de metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC)⁵. El propósito del presente trabajo es describir en detalle todos los aspectos de la metodología exitosa. La importancia de esta metodología radica en el hecho de que este enfoque puede modificarse para aislar y propagar con éxito en cultivo CTC humanas, mejorando así la posibilidad de estudios in vitro de la biología de CTC.

Existen múltiples aplicaciones clínicas potenciales para el uso de CTCs. Las CTC pueden ser útiles para el pronóstico, la monitorización de la respuesta, el cribado, la monitorización dinámica de las alteraciones moleculares tumorales y la terapia personalizada⁴. Por lo tanto, una mejor comprensión de la biología de las CTC tiene un alto potencial de impacto clínico.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de Hunter College de la City University de Nueva York.

1. Procedimientos Pre-experimento

1. A su llegada a las instalaciones de animales, albergará inicialmente 3 ratones Balb / c con una jaula con una ropa de cama de arriba y astillas de madera filtrada. Asegúrese de que los ratones tienen libre acceso a la alimentación, purina comida para roedores y agua. Ropa de cama y comida deben cambiarse dos veces por semana, mientras que las jaulas deben limpiarse una vez a la semana.
2. Inducir la anestesia general en ratones usando un vaporizador de isoflurano junto con oxígeno a una velocidad de flujo constante de 1 L por minuto. El sistema es autosuficiente e incluye un vaporizador de precisión.
3. Posición animal en una caja de plástico que tiene el vaporizador precisión y gas / sistema de anestésico conectado a él. Inicialmente, ajuste el vaporizador para 2,5 hasta animal es inconsciente, en cuyo punto más bajo del vaporizador a 2.
4. En ese momento, cambie ellínea de válvulas, sellado a la caja y abrirla al cono de la nariz.
5. Mueva el animal a la zona de preparación, con el cono de la nariz colocado adecuadamente y conectado (para la anestesia de mantenimiento).
6. Preparar 5 × 10 ⁶ células HCC ratón BNL 1ME A.7R.1 para su implantación por ratón. BNL 1ME A.7R.1 debería estar creciendo en un medio (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) incubar en una placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% CO _2.
7. Con una jeringa que tiene una aguja G 20, el implante 100 l de PBS que contenía 5 x 10 ⁶ células de carcinoma hepatocelular ratón BNL 1ME A.7R.1 en un lóbulo de los hígados de los ratones BALB / c para producir los tumores primarios. Post-implantación, la casa de los ratones BALB / c en una jaula con los mismos requisitos de las casas como de pre-implantación.
8. En el punto final experimental, evidencia clínica de carcinoma hepatocelular es observable como la reducción significativa en la condición corporalanotar (usualmente detectada después de 4 semanas). En este punto, hay una probabilidad de que los tumores primarios han desarrollado en el hígado mientras que los depósitos metastásicos se han formado en los pulmones. A partir de entonces, comenzará el proceso de aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes.

2. Recolección de sangre entera para hacer circular Tumor Aislamiento celular

NOTA: correctamente desinfectado la zona de la cirugía y asegúrese de que está libre de desorden. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos o sumergirse en un desinfectante de acuerdo con las recomendaciones del fabricante

1. Sacrificar los ratones por eutanasia humanitaria al experimental de punto final (evidencia clínica de desarrollo de tumores). La eutanasia de los ratones debería involucrar _asfixia de CO 2. Observar los ratones adecuadamente para confirmar la anestesia se distribuye correctamente. El dióxido de carbono debe ser liberado lentamente en la cámara durante un período de 5 - 10 min, causando paro respiratorio. Siga por desangrado intracardiaca y CervicAl dislocación. ⁵
2. Use una aguja 25 G unida a una jeringa de 1 ml para la recogida de sangre completa. Heparanize la jeringa con 0,01 ml de heparina. Punción inmediatamente la piel con la aguja inferior al xyphisternum aproximadamente a 45 ° de ángulo. Avanzar la aguja lentamente para perforar el corazón, y luego bajar el ángulo de la aguja. Constantemente mantener la aguja y una jeringa en su lugar, y extraer 500 l - 1.000 l de sangre entera desde el corazón.
3. Retire la jeringa y la aguja y la transferencia de la sangre en un tubo libre de pirógenos pre-marcado con 1,5 ml. Centrifugar la sangre entera recogida en 1,5 ml tubo libre de pirógenos a 1.167 xg durante 5 min.
   NOTA: La centrifugación separa la muestra de sangre en tres capas: la capa inferior o el hematocrito que consiste en células rojas de la sangre, una capa delgada intermedia de la capa leucocitaria, y una capa de plasma superior.
4. Retire el plasma con cuidado con la pipeta y recoger en un tubo de 1,5 ml pirógenos separado para furthexperimentos er como la detección de ácidos nucleicos libres de células ^7.
5. Para el aislamiento de células tumorales circulantes (CTC), recoger la capa leucocitaria en un tubo libre de pirógenos 1,5 ml por separado en la preparación de glóbulos rojos (RBC) de lisis. Esto es necesario para eliminar los glóbulos rojos residuales en la capa de la capa leucocitaria.

3. Receta de glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis

1. Hacer una solución 1 L de tampón de lisis RBC.
2. Hacer una 500 ml de cloruro de amonio y 500 ml de Tris. A continuación, mezclar para crear una solución de 1 l de tampón de lisis RBC con una concentración final de 155 mM de cloruro de amonio y 10 mM de Tris.
3. Amortiguar la solución a un pH de 7,5. Almacene el tampón de lisis RBC entre +2 y +8 ° C, y llevar a RT inmediatamente antes de su uso.

4. RBC lisis de Buffy Coat

1. Añadir 1 ml de tampón de lisis RBC al tubo de 1,5 ml estéril libre de pirógenos que contiene la capa leucocitaria recogida.
2. Mezclar el contenido del tubo porinvirtiendo varias veces. Incubar los contenidos mezclados del tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente en el banquillo. Centrifugar los contenidos mezclados durante 5 min a 1167 x g.
3. Después de la centrifugación, se obtendrá un pellet blanquecino. Descartar el sobrenadante rojizo lentamente y con cuidado en 10% de lejía sin ninguna interrupción al sedimento. Si la pastilla no es blanquecina, volver a hacer los pasos 3.1 a 3.5. El aumento del tiempo de incubación en tampón de lisis RBC a 10 - 15 min también puede ser útil.
4. Deseche los residuos biológicos vez descontaminación de desechos biológicos en el 10% de lejía se completa después de 24 horas.

5. propagación en cultivo celular

NOTA: Las células tumorales son típicamente crecen rápidamente las células de glóbulos blancos que son abundantes en la mezcla original de células sembradas en el plato. Tras el cambio repetido de medio, y los pasajes posteriores de CTC, todas las células blancas de la sangre se retiran y una población relativamente pura de CTC permanece.

1. Despuésdescartando el sobrenadante en 10% de lejía, lavar el sedimento blanquecino en 1 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) al menos una vez, y resuspender en medio de cultivo completo para la propagación en cultivo celular.
2. Una vez que se ha completado lavado, añadir 1 ml de medio de cultivo A.7R.1 completa BNL 1ME (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) al sedimento y resuspender el precipitado en el medio de cultivo.
3. Sembrar la mezcla se volvieron a suspender las células en una placa de cultivo celular. Incubar la placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% de CO _2.
4. Cambiar el medio de cultivo celular cada dos o tres días. Después de cinco a siete días, los CTC se han adherido a la placa de cultivo celular y comenzó a proliferar. Estas células se mantendrán viable más allá de 25 pasajes y después de congelación y descongelación ciclos repetidos ^5.

6. Verificación de carcinoma hepatocelular circulantes línea de células tumorales

1. Realizar apolymerase reacción en cadena (PCR) método basado, para amplificar solamente un segmento de ADN específica del gen β-globina de ratón para confirmar que la novela estableció líneas celulares de CTC son células de ratón como la línea de BNL 1ME A.7R.1 HCC original implantada. Método fue originalmente descrito y validado por Steube et al. ^5,8
2. Realizar la inmunotinción para el elemento de respuesta a cAMP marcador específico de hepatocitos proteína de unión 3-like 3 (CREB3L3) mediante el uso de un anticuerpo específico. Esto confirmará que la novela CTC establecidos son de hecho los hepatocitos como el implantado línea original de células BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Resultados

La metodología descrita aquí ha demostrado que las CTC se pueden aislar. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente al experimental de punto final. El proceso implicado carbono asfixia con dióxido, desangrado intra-cardiaca, y la dislocación cervical. Un diagrama esquemático de los pasos clave del procedimiento se ilustran en la Figura 2. Muestras de sangre total extraída por desangrado intra-cardiaca se procesaron utilizando el protocolo descrito anteriormente. Después de lo cual...

Discusión

En este estudio, se describió cómo aislar y propagar CTC de la sangre total de un ratón singénico con HCC. El objetivo de este trabajo es mejorar los estudios en curso sobre los mecanismos de la metástasis del cáncer.

Un factor que contribuye al mal pronóstico de muchos cánceres es la falta de detección oportuna y la consiguiente diseminación generalizada de la neoplasia maligna³. Las CTC se originan a partir de cánceres primarios y se propagan a través del torrente sanguíneo a órg...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Heparina Sal Sódica 1 g	VWR	89508-852
BTX Tubo Micro 1,5 ml Transparente NS	VWR	89511-254	1,5 ml  sin pirógenos Tubos eppendorf
Aguja estéril Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Aguja
Slp Punta SRNG 1 ml 200 cada uno por paquete	VWR	BD309659	1 ml punta de jeringa
Jeringa 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	Jeringa de 1 ml
VWR Pinza de papel tisú 6	VWR	82027-446	Pinza
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compuesto
VWR Corredera sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Correderas
VWR Cubierta de vidrio #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cubierta de vidrio
VWR Caja deslizante True North FM Pu	VWR	89140-278	Caja
Super HT Bolígrafo PAP	VWR	89427-058	Bolígrafo PAP
Agua Libre de ARNe y ADNasa 2 L	VWR	101454-204	Tampón de agua sin nucleasa
Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Cloruro de amonio ACS Grado 2, 5 kg	VWR	97062-048	Tampón de cloruro de amonio Plato de cultivo de
tejidos Falcon 60 x 15 mm Plato	cultivo de tejidos	de poliestireno estilo VWR	353002
Lejía germicida Clorox, regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (solución salina tamponada con fosfato) sin calcio y magnesio (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  con 4,5 g/L de glucosa & L-glutamina sin piruvato de sodio	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x medios para células BNL 1ME A.7R.1
Suero fetal bovino	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicilina Estreptomicina Solución, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicilina Estreptomicina
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	Centrífuga de 13.000 rpm

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