Un modelo de tenotomía de Aquiles y lesión por quemaduras de osificación heterotópica permite el estudio fiable de la formación ósea ectópica inducida por el trauma sin la aplicación de factores exógenos.
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Artículo de método
Ratón directa Trauma / Burn modelo de osificación heterotópica
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Resumen
Resumen
La osificación heterotópica (HO) es la formación de hueso fuera del esqueleto que se forma después de un traumatismo importante, lesiones por quemaduras y procedimientos quirúrgicos ortopédicos. La mayoría de los modelos animales utilizados para estudiar la HO se basan en la aplicación de sustancias exógenas, como la proteína morfogenética ósea (BMP), construcciones celulares exógenas o mutaciones genéticas en la señalización de BMP. Si bien estos modelos son útiles, no reproducen con precisión los estados inflamatorios que causan la mayoría de los casos de HO. Aquí describimos un modelo de quemadura/tenotomía en ratones que produce de forma fiable un HO focalizado. Este protocolo implica la creación de una quemadura de contacto del 30% de la superficie corporal total, el grosor parcial en la piel dorsal, así como la división del tendón de Aquiles en su punto medio. Confiar únicamente en la lesión traumática para inducir HO en un lugar predecible permite el estudio del curso del tiempo de la formación ósea heterotópica endocondral a partir de procesos fisiológicos intrínsecos y el entorno únicamente. Este método podría resultar fundamental para comprender las vías inflamatorias y osteogénicas implicadas en la HO inducida por traumatismos. Además, debido a que la HO se desarrolla en una ubicación y curso de tiempo predecibles en este modelo, permite la investigación para mejorar las estrategias de imagen temprana y las modalidades de tratamiento para prevenir la formación de HO.
Introducción
La osificación heterotópica (HO) es la formación de hueso ectópico en el que se induce de forma aberrante a células osteopotentes a formar hueso endocondral fuera del esqueleto. Si bien los detalles de la vía de formación de HO aún se desconocen en gran medida, un paradigma aceptado incluye tres factores clave: un incidente incitador inflamatorio, un nicho permisivo y células madre mesenquimales capaces de formar hueso. 1-3 HO es una comorbilidad común que complica más del 60% de las lesiones por quemaduras graves, el 65% de las lesiones relacionadas con el combate y el 10% de los casos de cirugía ortopédica invasiva. 4,5 Sin embargo, a menudo es difícil predecir dónde se formará el HO porque puede ocurrir en sitios de lesión local o en lugares distantes que de otro modo podrían no estar lesionados. Esta variabilidad en la localización dificulta la intervención profiláctica para prevenir la formación de hueso reactivo de forma localmente dirigida. También existen formas congénitas de HO, como la fibrodisplasia osificante progresiva (FOP), en las que los pacientes son propensos al desarrollo de HO robusta en respuesta a un traumatismo menor o a una lesión inflamatoria. Potentes modelos animales utilizando ratones transgénicos han reproducido este fenotipo y han proporcionado información sobre las vías moleculares que también pueden ser importantes en la HO inducida por traumas.6-9 La investigación traslacional sobre la patogénesis de la HO no congénita ha utilizado una amplia variedad de constructos que van desde la lesión sola hasta la implantación de materiales y/o células osteoinductivas exógenas. De 10 a 13
añosEn nuestro trabajo anterior hemos validado un modelo simple y fiable de la formación de HO en ratones que no requiere la administración de ningún material exógeno. 14-17 Este modelo creó dos condiciones clave para iniciar la HO: el trauma local y la inflamación global. Esto se logró mediante el uso de una tenotomía de Aquiles (traumatismo local) combinada con una lesión por quemadura a distancia (inflamación global). Los ratones recibieron ambos tratamientos simultáneamente y se descubrió que desarrollaban una cantidad robusta de HO que podía analizarse por medios histológicos, radiológicos y moleculares. Curiosamente, las lesiones por quemaduras concurrentes aumentaron significativamente la cantidad de HO que se formaba y aceleraron su curso temporal de desarrollo. 14-16 HO se desarrollaron en sitios predecibles alrededor del calcáneo, la articulación del tobillo y la tibia/peroné de la extremidad que recibió la tenotomía. La fiabilidad del desarrollo de HO en un lugar conocido permitió un examen centrado en las características moleculares e histológicas en las primeras etapas de la osificación ectópica. 14,17 Hasta la fecha, el 100% de los ratones (más de 50 animales) con una tenotomía y una lesión por quemadura concurrente han desarrollado HO. Además, se realizaron imágenes longitudinales en 2D y 3D y análisis espectroscópicos para examinar el patrón de crecimiento y la composición bioquímica del HO.15,16
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Protocolo
Declaración de Ética: Todos los animales procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales como se define en las directrices establecidas en la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio: Octava edición del Instituto de Investigación de Animales de Laboratorio (ILAR, 2011) y fueron aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Michigan (PRO0001553).
1. Ratón Procedimientos Quirúrgicos
NOTA: El uso de 8-10 semanas de edad C57BL / 6 ratones. Otros edades, orígenes y cepas de ratones también se pueden utilizar para probar diferentes condiciones o genética. Para la parte tenotomía del procedimiento, mantener condiciones estériles usando mascarilla, capo de cabello y bata estéril, guantes, y los instrumentos. Sitios quirúrgicos se deben preparar de forma estéril con povidona yodada y drapeado estéril. Evite la hipotermia utilizando una almohadilla térmica veterinaria y el calentamiento de soluciones de reanimación a 37 ° C antes de ADMINISTRAción.
- Anestesiar al ratón usando 2,5% de isoflurano inhalado. Use un cono de la nariz para dejar el dorso y extremidades traseras de fácil acceso. Ajustar la velocidad de administración de isoflurano para mantener la tasa respiratoria apropiada y la coloración de las membranas mucosas y para asegurar la anestesia mediante la comprobación del tono muscular, pizca dedo del pie, y el reflejo corneal. Aplicar pomada oftálmica sosa para los ojos del ratón para evitar lesiones en los ojos secos durante el procedimiento. Mantener la temperatura corporal adecuada utilizando una almohadilla térmica veterinaria o caliente de recirculación de agua debajo del campo quirúrgico.
- Administrar buprenorfina, 0.1 mg / kg, por vía subcutánea inmediatamente antes de la cirugía para la analgesia.
- Estrechamente afeitar el sitio quirúrgico en la pata trasera izquierda usando máquinas de cortar desde el talón hasta la rodilla.
- Estrechamente afeitar el dorso del ratón, comenzando sobre la columna vertebral y que se extiende el área afeitada a la izquierda de la línea media dorsal, la limpieza de un área de al menos 2 cm x 3 cm para acomodar la lesión por quemadura.
- Preparar el lugar de la cirugía, incluyendo la pata trasera de la rodilla utilizando 3 alternas friega-povidona yodada.
- Realice una incisión longitudinal a lo largo de la cara medial del tendón de Aquiles izquierdo. Extienda la incisión por lo que el tendón de Aquiles se puede visualizar fácilmente; aproximadamente 0,5 cm.
- Realizar una tenotomía de Aquiles con disección aguda del tendón en el punto medio con unas tijeras afiladas tejido. Inserte una hoja de la tijera de tejido en el plano de tejido debajo de la tendón y diseccionar lo largo del plano hasta que la hoja es en el punto medio del tendón. Cierre las hojas de las tijeras para cortar el tendón bruscamente.
NOTA: Asegúrese de que la inclusión de todos los tendones posteriores incluyendo gastrocnemio, sóleo y tendones Plantaris. - Lograr la hemostasia mediante la aplicación de presión con una gasa estéril (debe haber sangrado mínimo) y cerrar la incisión de la piel con una puntada 5-0 vicryl.
- Realice el dorsal quemadura de espesor parcial con un bloque de aluminio con un peso de 35 g con MEDICIÓN aproximadasts 2 cm x 2 cm x 3 cm se calentó a 60 ° C en un baño de agua aplicada a la dorso afeitada del ratón para 17 seg.
NOTA: Lograr la profundidad de la quemadura apropiado por el bloque descansando en la parte superior del ratón anestesiado, asegurando que toda el área de superficie del bloque se encuentra en contacto con el ratón, sin embargo evitar la aplicación de cualquier presión adicional para el bloque, es decir, permitir que la gravedad para ser la única fuerza que sostiene el bloque en su lugar. Un mango de plástico delgado unido a un lado del bloque es conveniente para la manipulación, la estabilización y recuperación del baño de agua caliente. Esto creará un área de superficie corporal total, aproximadamente el 30% se quema en un 8-10 semanas de edad C57BL / 6 mouse. Esta quemadura contacto fue elegido sobre otros métodos (llama quemadura o escaldadura) debido a la uniformidad de la profundidad de la quemadura sobre la herida y la reproducibilidad entre los animales. - Seque el lugar de la quemadura con una gasa y aplicar un apósito Tegaderm.
- Administrar fluidos de resucitación calentado: Ringer lactato solución de 1 mlinyección intraperitoneal y 0,5 ml de la inyección subcutánea. Esta administración de una sola vez de la reanimación es adecuado para la recuperación de la lesión por quemadura y tenotomía.
NOTA: No devuelva ratones anestesiados a las jaulas de vivienda con otros ratones, casa individualmente en jaulas limpias bajo vigilancia hasta que los ratones están totalmente recuperados. Recuperación típica se produce dentro de 1-6 horas. Sitios de quemaduras generalmente sanan dentro de 2-4 semanas y rara vez se complican por infección de la herida si se mantiene en entornos de vivienda limpias. - Administrar buprenorfina 0,1 mg inyección subcutánea / kg cada 12 horas durante 3 días después del procedimiento. Monitorear el crecimiento HO con exploraciones μCT serie a intervalos apropiados. El crecimiento del hueso ectópico es evidente por primera vez alrededor de 3 semanas después de la operación por μCT.
NOTA: La mayoría de desarrollo HO es completa por 9 semanas después de la operación. No hemos observado una diferencia en el volumen de HO o ubicación con repetidas μCT escanea dos veces por semana durante 15 semanas en comparación a un solo punto final μCT escanear a las 15 semanas.Al final de los experimentos, la eutanasia de todos los ratones con inhalación de CO2 de acuerdo con las directrices institucionales y comprobar la muerte con dislocación cervical después de 10 min.
2. μCT Adquisición y Análisis
- Asegure el ratón anestesiado en el escáner en la posición prona. Pegue las patas traseras firmemente a la cama para evitar respirar artefacto de movimiento. Incluya el aire, el agua y la hidroxiapatita contiene fantasma bajo el ratón para la calibración de imagen.
- Abra el software de análisis de hueso y definir una región de interés (ROI) que abarca ambas extremidades traseras de la articulación de la cadera proximalmente a la punta de la pata trasera distalmente. Obtener una imagen utilizando los siguientes parámetros:. 80 kV, 500 mu y 1.300 milisegundos de exposición, 48 micras de tamaño voxel 14,15
- Calibre la imagen para unidades Hounsfield (UH) dibujando un retorno de la inversión en cada una de las tres cámaras de fantasmas y la introducción de la densidad media en los campos apropiados enEl software.
- Con la herramienta "capturador" en el software, vuelva a orientar la imagen para la tibia de la extremidad posterior izquierda es paralelo a lo largo del eje Z para permitir la vista anatómico más clara para la delimitación de las estructuras óseas corticales ortotópico y HO.
- Comenzando en la rodilla, desplácese distalmente a través de los cortes de imagen hasta que se encuentre HO. Con la herramienta spline manual, hacer un retorno de la inversión alrededor del hueso ectópico en cada 5º rebanada continua distalmente a través de la pata o hasta HO ha sido superado. Utilice la herramienta de extrapolar para ampliar y unir las regiones de interés juntos en un retorno de la inversión que contiene toda la HO.
- Hacer un ROI 3D y elegir el menú de análisis. Calcule el volumen de hueso mediante el establecimiento de los valores inferior y superior de umbral que mejor muestran la ventana de hueso. Utilice los mismos valores de umbral fijados para todos los análisis.
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Resultados
En el presente estudio, el protocolo se describe para el modelo previamente publicado ratón del trauma / quemadura inducida. HO 14-17 Esto implica la creación de lesiones musculoesqueléticas localizada concurrente con una tenotomía de Aquiles y el insulto inflamatorio global con un espesor parcial quemaduras. Esto da lugar a la formación fiable de hueso reactivo en el sitio de tenotomía que puede ser seguido con imágenes en serie. Hasta la fecha, todos los ratones (más de 50) que han sostenido tanto de Aquile...
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Discusión
La osificación heterotópica representa un importante deterioro funcional que enfrentan los pacientes que sufren traumatismos, quemaduras y procedimientos musculoesqueléticos invasivos. La población de mayor riesgo son los soldados en conflictos modernos con lesiones graves por explosiones causadas por mecanismos como artefactos explosivos improvisados (IED). 18 La mejora de los chalecos antibalas y las unidades médicas posicionadas en la parte delantera permiten mejorar la supervivencia de las lesiones grave...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Agradecemos a Amanda Fair, la CMI, y Kathy Sweet y la ORL de UM por su ayuda con las imágenes y análisis de μCT. Financiación: BL financiado por 1K08GM109105-01 y el Premio Nacional de la Fundación de Cirugía Plástica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 ratones | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 semanas de edad |
| Isoflurano – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorfina – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare NDC | 12496-0757-1 | 0,3 mg/ml solución |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Suturas de vicryl | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cortado por la mitad para cubrir adecuadamente el sitio de la quemadura |
| µ CT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londres, ON, Canadá | ||
| Microview 2.2 Aplicación de análisis óseo avanzado | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londres, ON, Canadá |
Referencias
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