Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Resumen

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Resumen

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y recuento de moléculas de ácido nucleico individuales. Sin embargo, los ensayos digitales son todavía no se aplican de forma rutinaria, debido al coste y equipos específicos asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí presentamos un método simplificado para la lectura de las pruebas de gota digitales utilizando un instrumento convencional PCR en tiempo real para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas.

Caracterizamos el rendimiento del ensayo de lectura mayor usando mezclas de gotitas sintético y un digital de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) de ensayo de gotas. Cuantitativa MDA en particular se beneficia de un formato digital de la reacción, pero nuestro nuevo método se aplica a cualquier ensayo digital. Para protocolos de ensayo digitales establecidos, tales como PCR digital, este método sirve para acelerar y simplificar la lectura del ensayo.

Nuestra metodología de lectura mayor aporta las ventajas de partitioned ensayos sin la necesidad de la instrumentación de lectura especializada. Las principales limitaciones de la metodología de lectura mayor se reducen rango dinámico en comparación con las plataformas de gotita de conteo y la necesidad de una muestra estándar, aunque los requisitos de esta norma son menos exigentes que para un experimento en tiempo real convencional. La amplificación del genoma completo cuantitativa (WGA) se utiliza para probar los contaminantes presentes en las reacciones de Ventajas de Windows Original y es la forma más sensible para detectar la presencia de fragmentos de ADN con secuencias desconocidas, dando el método de gran promesa en diversas áreas de aplicación incluyendo control de calidad farmacéutica y la astrobiología.

Introducción

Ensayos digitales para la cuantificación de ácidos nucleicos (PCR digital) ^1.4 y la base de la orden (secuencia) están impactando fuertemente las ciencias de la vida y la medicina. Digitales proporcionan ensayos de cuantificación de los recuentos moleculares en una escala absoluta (no respecto a un control), proporcionando una alta sensibilidad, lo que permite comparaciones fáciles a través de experimentos, y crucial, lo que permite la construcción de grandes bases de datos que contienen datos comparables ⁵ (Tabla 1).

En los últimos 15 años, la amplificación del genoma (WGA) surgió junto PCR como una....

Protocolo

Nota: fabricar el dispositivo de microfluidos no es necesario para este ensayo, en forma de gotas para este protocolo se pueden formar con los responsables de gotitas comerciales existentes ^23,29.

1. Hacer que el dispositivo de microfluidos Gotita de formación

1. Preparar molde maestro para los canales con el protocolo Fabrication Maestro SU-8 esbozó previamente ^31, pero con un patrón de máscara generador de gotas ^32.
2. Fabricar dispositivos en PDMS utilizando las técnicas de litografía blanda ^32,33.

2. Prepare la mezcla de reacción para gr....

Resultados

Mientras que las lecturas de mayor convencional / en tiempo real se pueden utilizar tanto para PCR cuantitativo y ensayos cuantitativos WGA (Figura 1), ensayos cuantitativos digitales proporcionan ventajas (Tabla 1). En el método descrito, leemos a cabo ensayos digitales en formato micro-gotita con una medición de punto final a granel sencilla (Figura 2). Si bien este método es ampliamente aplicable, nos centramos en WGA cuantitativa (MDA) ya que este método presenta de.......

Discusión

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y contando de individual de moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, los ensayos digitales aún no se aplican de forma rutinaria en los laboratorios de análisis, debido en parte al coste de equipo especializado asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí se describe un ensayo digital de punto final para la cuantificación de ácidos nucleicos con una lectura analógica simplificada usando una cuantitativa en tiempo real máquin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Evagreen Dye	Biotium	31000
Albúmina sérica bovina	New England Biotechnologies	B9000S
Phi29 Tampón de reacción de ADN polimerasa	New England Biotechnologies	B0269S	Vórtice periódicamente hasta que el agregado se disuelve
ADN lambda	New England Biotechnologies	N3011S	Calentado a 50 oC y enfriado hielo antes de la dilución
Oligótidos aleatorios de MDA	Tecnologías de ADN integradas 5		'-NNNNN*N-3'Imprimaciones
de PCR		ADN integradas	5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' y 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'
Agua ultrapura sin nucleasas	Life Technologies	10977-015	Tratada con rayos UV durante 30 minutos en Stratalinker 2400 antes de su uso (opcional)
Colorante de referencia ROX	Life Technologies	12223-012
Tapones de tiras ópticas para PCR	Life Technologies	4323032
Tubos de PCR	Agilent Technologies	401428
dNTP (25 micromolares cada uno)	Agilent Tecnologías	200415
Termociclador - Sistema qPCR Mx3000P	Agilent Technologies	401403
Puntas de pipeta de barrera	VWR	89003-046
Aceite Bio-rad para evagreen	Bio-rad	186-4005
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893-100RXN

Tecnologías de