Artículo de método

Grabación de potencial evocado visual en un modelo de rata de Experimental del Nervio Óptico Desmielinización

DOI:

10.3791/52934

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29 de julio de 2015

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1Department of Ophthalmology, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2Save Sight Institute, The University of Sydney

En este artículo

Resumen

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La desmielinización focal se induce en el nervio óptico mediante microinyección de lisolecitina. Los potenciales evocados visuales se registran a través de electrodos craneales implantados sobre la corteza visual para examinar la conducción de señales a lo largo de la vía visual in vivo. Este protocolo detalla los procedimientos quirúrgicos subyacentes a la implantación de electrodos y la microinyección del nervio óptico.

Resumen

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El registro del potencial evocado visual (PEV) se utiliza ampliamente en la práctica clínica para evaluar la gravedad de la neuritis óptica en su fase aguda y para monitorizar el curso de la enfermedad en el periodo de seguimiento. Los cambios en los parámetros de la PEV se correlacionan estrechamente con el daño patológico en el nervio óptico. Este protocolo proporciona una descripción detallada sobre el modelo de microinyección del nervio óptico en roedores, en el que se produce una lesión parcial de desmielinización en el nervio óptico. También se discuten las técnicas de grabación VEP. Mediante el uso de electrodos implantados en el cráneo, podemos adquirir trazas de VEP reproducibles durante y entre sesiones. Las PEV se pueden registrar en animales individuales durante un período de tiempo para evaluar longitudinalmente los cambios funcionales en el nervio óptico. El modelo de desmielinización del nervio óptico, junto con el protocolo de registro VEP, proporciona una herramienta para investigar los procesos de la enfermedad asociados con la desmielinización y la remielinización, y potencialmente puede emplearse para evaluar los efectos de nuevos fármacos remielinizantes o terapias neuroprotectoras.

Introducción

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La neuritis óptica es una de las formas más comunes de neuropatía óptica, que causa la pérdida total o parcial de la visión1. Histológicamente, se caracteriza por desmielinización inflamatoria, pérdida axonal de células ganglionares de la retina y diversos grados de remielinización en el nervio óptico2. La neuritis óptica suele ser el inicio manifiesto de la esclerosis múltiple. El potencial evocado visual (PEV) es una herramienta no invasiva para investigar la función del sistema visual. Refleja la función post-retiniana desde la retina hasta la corteza visual primaria y se ve afectada en muchas enfermedades del nervio óptico3. La PEV se ha utilizado predominantemente en pacientes con neuritis óptica para evaluar la integridad de la vía visual4.

La latencia de VEP, que refleja la velocidad de conducción de la señal a lo largo de la vía visual, se considera una medida precisa del nivel de cambios asociados a la mielina en el nervio óptico5; mientras que se cree que la amplitud de VEP está estrechamente correlacionada con el daño axonal de las células ganglionares de la retina (RGC)6. Esta hipótesis ha sido bastante bien establecida utilizando el modelo de rata de desmielinización del nervio óptico inducida por lisolecitina5.

Aquí, explicamos un protocolo completo de la técnica de microinyección del nervio óptico en roedores, que puede minimizar el daño relacionado con la manipulación quirúrgica al nervio per se, así como a los tejidos adyacentes, como los músculos extraoculares y los vasos sanguíneos. Además, se ha descrito la cirugía de implantación de electrodos craneales para el registro de VEP en animales7. Los registros de VEP se pueden llevar a cabo repetidamente en animales durante un período de tiempo para evaluar los cambios relacionados con la desmielinización/remielinización, así como el impacto en la integridad axonal del nervio óptico.

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Protocolo

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Declaración de Ética: Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos y las directrices de la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Macquarie.

1. VEP Electrodo Implantación

  1. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg / kg) y medetomidina (0,5 mg / kg).
    Nota: Después de la inducción de la anestesia, observar los reflejos de retirada (prueba de pellizco, reflejo corneal y palpebral, etc.) y su ausencia como una indicación para comenzar la cirugía. Continuamente observar a los animales durante toda la cirugía y administrar fármaco anestésico adicional (10% de la dosis de ketamina inicial por top-up) si los reflejos están presentes. Las ratas adultas (> 12 semanas) se utilizan en los experimentos.
  2. Afeitarse la piel de la zona quirúrgica.Colocar el animal en un cojín de calentamiento (37 ° C) para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Preparar la piel mediante la aplicación tópica de povidona yodada. Aplicar drapeado quirúrgico. Aplicar pomada oftálmica tópica para evitar la sequedad de la córnea bajo anestesia general. Mantener la asepsia utilizando instrumentos estériles.
  3. Hacer una incisión en la piel en la línea media longitudinal de la piel de la cabeza. Despeja el tejido conectivo para lograr una buena exposición del cráneo.
  4. Con cuidado, perforar pequeños agujeros de trépano manualmente utilizando un taladro micro mano en 7 mm detrás del bregma y 3 mm lateral a la línea media.
  5. Electrodos tornillo de implante a través del cráneo en la corteza (zona 17), que penetran en la corteza a una profundidad de aproximadamente 0,5 mm. Implantar un electrodo tornillo de referencia en mm rostral línea media 3 al bregma. Aplicar cemento dental para encajonar y fijar los tornillos (no siempre es necesario).
  6. Suturar la piel de la cabeza, administrar pomada antibiótica sobre la piel y permitir que el animal en Recover de la anestesia en un cojín de calentamiento.
    Nota: Como alternativa, los electrodos se pueden dejar expuestos, por lo que la piel no necesita ser reabierto en cada grabación. Inmediatamente después de la cesación de la cirugía, pero antes de la recuperación de la anestesia, administrar un fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID) (si no se administra antes de la cirugía) o un analgésico opioide. Monitorear los animales constantemente hasta que la recuperación total de la anestesia y totalmente ambulatoria.
  7. Deje por lo menos 1 semana para que los animales se recuperan de la cirugía antes de la grabación VEP.

2. Inyección Nervio Óptico

  1. Anestesiar al animal, preparar la piel y aplicar drapeado que el anterior (1.1 y 1.2).
  2. Hacer una incisión de 1 a 1,5 cm en la piel por encima de la órbita de un ojo seleccionados al azar. Abra el tejido subcutáneo para alcanzar la cavidad orbital usando iris finas tijeras. Abra la conjuntiva y anterior de la cápsula de Tenon bajo el microscopio operativo.
  3. Retirar la extraoculareslos músculos y las glándulas lagrimales intraobital para exponer aproximadamente 3 mm de longitud del nervio óptico. Abra las capas de duramadre y materia aracnoide alrededor del nervio óptico longitudinal utilizando una cuchilla oftálmica.
  4. Inserte la pipeta de vidrio en el nervio óptico a una distancia de 2 mm posterior al globo. La micropipeta de vidrio está unida a una jeringa Hamilton.
  5. Inyectar 1% lisolecitina (0,4 a 1,0 l, con 0,02% de azul de Evan que no tiene efectos sobre la mielinización) lentamente en el nervio aproximadamente durante un período de 30 seg.
  6. Suturar la incisión de la piel. Aplique ungüento antibiótico para prevenir la infección. Compañeros de ojos se pueden servir como controles internos para grabaciones de electrofisiología.
  7. Coloque los animales sobre una almohadilla de calentamiento para recuperarse de la anestesia.

3. VEP grabación

  1. Anestesiar el animal y preparar la piel como 1.1 y 1.2.
    Nota: dosis más baja de los anestésicos puede ser utilizado para reco electrofisiológicording (ketamina 40 mg / kg y medetomidina 0,25 mg / kg).
  2. Coloque la rata en un cuarto oscuro y deje que se adapte a la oscuridad de 5-30 min. En algunos casos, las ratas pueden ser, respectivamente, adaptada a la oscuridad O / N para escotópica o la luz adaptado para grabaciones VEP fotópica 8.
  3. Mantener la temperatura corporal a 37 ± 0,5 ° C por el sistema manta homeotermos con una sonda de termómetro rectal.
  4. Dilatar las pupilas con gotas para los ojos 1,0% tropicamida. Abra la piel sobre el cráneo para acceder al pre-colocado en electrodos de tornillo in situ.
  5. Conectar el tornillo sobre la corteza visual del ojo contralateral estimulado y el tornillo de referencia para el amplificador. Inserte un electrodo de aguja en la cola como el suelo. Medir y mantener la impedancia del electrodo por debajo de 5 kW.
  6. Coloque un estimulador mini-Ganzfeld directamente sobre la piel alrededor de los párpados para proporcionar aislamiento ojo superiores 7. La iluminación del estimulador debe calibrarse de antemanopor un fotómetro.
  7. Entregar la estimulación fótica través de destellos de luz de 100 veces a una frecuencia de 1 Hz, con bajas y altas configuración del filtro de paso de banda de 1 Hz y 100, respectivamente. La tasa de muestreo de la señal es en 5 kHz.
    Nota: Las señales deben ser muestreados al menos a unos 250 a 300 Hz para asegurar que más de dos muestras se recogen durante cada ciclo.
  8. Suturar la piel de la espalda y mantener a los animales en un cojín de calentamiento para recuperarse de la anestesia. La grabación se puede grabar varias veces en animales individuales para monitorear los cambios funcionales en un período de tiempo.
  9. En el punto final, administrar una inyección sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg / kg, ip) para la eutanasia del animal. Confirmar la eutanasia por paro cardíaco, parada respiratoria y disminución de la temperatura corporal.

4. Preparación del tejido e Histología

  1. Quitar los nervios ópticos de los animales sacrificados bajo el microscopio y fijar el tejido en 1% de paraformaldehído O / N.
  2. Lavar el tejido a fondo con solución salina. Tratar el tejido en un procesador automático de tejidos e incrustar en parafina. Secciones fotografica (5-10 micras) con un micrótomo rotatorio.
    Nota: Para el estudio inmunohistoquímico, fijar tejidos en paraformaldehído al 1%, se lava con solución salina y se incuba con un 30% de sacarosa O / N. Incrustar tejidos en octubre medio de inclusión y hacer cryosections usando un criostato.
  3. Incubar las secciones en 0,1% solución de azul rápido como Luxol (en el 95% de etanol) O / N a 56 ° C. Diferenciar las secciones de 0,05% de carbonato de litio durante 30 segundos y luego etanol al 70% durante 30 seg. Por último, contrateñir en solución violeta de cresilo 0,1% durante 30 segundos antes de montar las secciones. Utilice la tinción con azul rápido para identificar la mielina en el nervio óptico 5.

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Resultados

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Reproducibles rastros VEP intra períodos de sesiones se muestran en la Figura 1 y un retraso significativo en la latencia N1 se pueden ver después de la inyección del nervio óptico. Las lesiones del nervio óptico parciales de desmielinización se pueden observar en las secciones histológicas utilizando Luxol tinción azul rápido 5. La figura 2 muestra una sección representativa con una pequeña lesión desmielinizada focal en el centro del nervio óptico. Tenga en cuenta que la se...

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Discusión

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El nervio óptico es muy susceptible al daño mecánico. La lesión por aplastamiento del nervio óptico durante un período de 1 s puede provocar una pérdida de aproximadamente el 75% de RGC durante un período de 2 semanas10. Por lo tanto, se requiere un cuidado extremo al realizar los procedimientos quirúrgicos. Según la experiencia de los autores, es mucho mejor adaptar un enfoque de disección roma para exponer y abrirse paso a través de los tejidos alrededor del nervio óptico a lo largo de la orientación del ner...

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Divulgaciones

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Ninguno de los autores tiene intereses contrapuestos o intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por el Instituto de Investigación Oftalmológica de Australia (ORIA). Agradecemos Prof. Algis Vingrys y el Dr. Explosión Bui, Universidad de Melbourne, por principio nos ayuda a desarrollar la técnica de grabación VEP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ketamina 100 mg/ml (Ketamil)Troy LaboratoriesAC 116
Medetomidina 1 mg/ml (Domitor)Pfizersc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)Alconsc-202371
Sistema de manta homeotérmicaHarvard Apparatus NC9203819
Medidor de impedancia CéspedF-EZM5
Electrodos de tornillo Micro sujetadoresM1.0 y veces; Ranura Csk de 3 mm M/T 304 S/S
Electrodos de aguja subdérmica CéspedF-E3M-72
Reparación Rápida DeguDent GmbH
Diodo emisor de luz Bioamplificador de NSPG300A
CWE, Inc.Sistema CED BMA-400
Cambridge Electronic Design, Ltd.Jeringa Power1401
Hamilton Hamilton87930
LysolecithinSigmaL4129
Evan' s azul SigmaE2129
Nichia

Referencias

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