Aunque los modelos de ratón son herramientas invaluables para la ingeniería de tejidos óseos, los modelos de defectos de huesos largos son escasos. Esta necesidad motivó el desarrollo del presente protocolo, que utiliza una placa de bloqueo con cuatro tornillos y una plantilla específica para realizar y estabilizar un defecto femoral, reproducible, de tamaño crítico y de baja morbilidad.
Artículo de método
Establecimiento de un defecto segmentario Modelo femoral de tamaño crítico en ratones estabilizado por osteosíntesis Plate
En este artículo
Resumen
Resumen
El uso de construcciones óseas de ingeniería tisular es una estrategia atractiva para superar los inconvenientes de los autoinjertos para el tratamiento de defectos óseos masivos. Como organismo modelo, el ratón ya ha sido ampliamente utilizado en investigaciones relacionadas con los huesos. Sin embargo, los modelos de defectos óseos diafisarios grandes en ratones son escasos y a menudo utilizan la fijación ósea que llena la cavidad de la médula ósea y no proporciona una estabilidad mecánica óptima. Los objetivos del presente estudio fueron desarrollar un defecto femoral segmentario de tamaño crítico en ratones desnudos. Se realizó una ostectomía femoral diafisaria media de 3,5 mm (aproximadamente el 25% de la longitud del fémur) utilizando una plantilla específica, y se estabilizó con una placa de bloqueo ubicada anteriormente y 4 tornillos de bloqueo. Posteriormente, el defecto óseo se dejó vacío o se rellenó con un sustituto óseo (injerto óseo singénico o andamio coralino). La cicatrización ósea se monitorizó de forma no invasiva mediante radiografía y microtomografía computarizada in vivo y posteriormente se evaluó mediante microtomografía computarizada ex vivo e histología no descalcificada después del sacrificio de los animales, 10 semanas después de la operación. La recuperación de todos los ratones fue excelente, se observó una carga de peso completa dentro de un día después del procedimiento quirúrgico. Además, se logró una fijación ósea estable y consistente de los materiales implantados en todos los animales analizados a lo largo del estudio. Cuando los defectos óseos se dejaron vacíos, se obtuvo consistentemente la no unión. Por el contrario, cuando los defectos óseos se rellenaron con injertos óseos singénicos, siempre se observó la unión ósea. Cuando los defectos óseos se rellenaron con andamios coralinos, se observó hueso recién formado en la interfaz entre los bordes de resección ósea y el andamio, así como a una corta distancia dentro del andamio.
El presente modelo describe un defecto femoral reproducible de tamaño crítico estabilizado por osteosíntesis en placa con baja morbilidad en ratones. El nuevo modelo de defecto óseo segmentario portador de carga podría ser útil para estudiar los mecanismos subyacentes en la regeneración ósea pertinentes a las aplicaciones ortopédicas.
Introducción
diafisarias defectos óseos masivos son un gran reto para el cirujano ortopédico. reemplazo óseo con injerto autólogo, actualmente considerado como el tratamiento de referencia, es limitada y se asocia con la morbilidad relacionada con la cosecha. Por estas razones, las construcciones de hueso de ingeniería tisular que combinan las células madre mesenquimales de la médula ósea con andamios osteoconductivas se han explorado como una alternativa para los autoinjertos en cirugía ortopédica.
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han realizado en modelos animales clínicamente relevantes tales como perros, cerdos y ovejas 1-3, pero la evaluación preliminar de estas construcciones en, segmentaria, defectos óseos de tamaño crítico ortotópico en modelos de animales pequeños (como ratones) podría tener varias ventajas: (i) los gastos bajos, (ii) un gran número de animales pueden ser operados; (Iii) en contraste a los modelos animales de gran tamaño, homogeneidad de las cepas de ratón limita las variaciones individuales en la resorción andamio unand formación de hueso y; (Iv) que es más importante, la disponibilidad de anticuerpos específicos y los animales de genes orientados permitir la evaluación de los procesos biológicos implicados en la curación de hueso. Por último, pero no menos importante, el uso de cepas inmunodeficientes de ratones también permite estudios ya sea utilizando los injertos de células de origen humano sin respuestas inmunes adversas en ratones.
A pesar de las ventajas antes mencionadas, los modelos defecto óseo de diáfisis masivos en los ratones son escasos. La mayoría de estos modelos de uso de fijación de huesos con un clavo intramedular que llena la cavidad de la médula ósea (limitando así el volumen de material a ensayar) y también impide reproducibilidad al no proporcionar estabilidad rotacional y axial 2,4-7.
Los objetivos del presente estudio son: (i) que imita una situación de no-unión ósea clínica, para describir un tamaño crítico-reproducible, segmentaria, modelo de defecto femoral en ratones, que se estabiliza mediante osteosynth placa de bloqueo exacta y reproducibleESIS que proporciona un entorno biomecánico altamente estable 8-10; (Ii) para ilustrar la presente modelo con dos sustitutos óseos potenciales y para describir los análisis de formación de hueso que se podría utilizar.
Protocolo
Declaración de Ética: Los ratones utilizados en el presente estudio fueron tratados de acuerdo con las directrices publicadas por el Comité Europeo de "Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (Directiva 2010/63 / UE y la Convención Europea ETS 123). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV / 2010-01-04).
1. Los animales
- Utilice los ratones atímicos (10 semanas de edad). Utilizar un número mínimo de 6 ratones con defectos dejados vacíos como grupo de control negativo.
2. Preparación andamios
- Preparación del injerto singénico
- Utilice isoinjerto hueso para rellenar el defecto de proporcionar grupo de control con un número mínimo de 6 animales.
- Isoinjertos obtener hueso por la cosecha extirparon hueso femoral de ratón perteneciente a cualquiera de los "defectos vacíos o" defectos llenos de grupos de andamios de coral "(thes evita el uso de animales extra para recoger isoinjerto hueso) 11.
- Enjuague el hueso resecado con tampón fosfato salino (PBS) y mantenerla estéril usando compresas de gasa húmeda.
- Coral Andamios Preparación
- Utilice andamio que están hechas de coral natural: Acropora sp. cubos exoesqueleto de coral, 3 x 3 x 3 mm como potencial de sustitución ósea con un mínimo de 6 animales.
- Tallar a mano cada cubo de coral a la forma del cilindro (3.5 altura; 2 mm de diámetro).
- Esterilizar cada andamio por tratamiento en autoclave (121 ° C durante 20 min), se lava con PBS estéril, y se sumergieron en medio de cultivo completo (α-MEM) durante 24 horas antes de la implantación en ratones.
3. Los procedimientos de anestesia y analgesia
- Proporcionar analgesia preventiva, 15 min antes de la anestesia, por inyección subcutánea de buprenorfina (0,1 mg / kg peso corporal del animal).
- Aplique un ungüento en el animalojos para evitar la sequedad cada 30 minutos mientras los animales están bajo anestesia.
- Coloque los ratones en una almohadilla de calentamiento para prevenir la hipotermia.
- Anestesia y analgesia durante el procedimiento quirúrgico
- Inyectar intraperitonealmente una solución que contiene xilazina (8 mg / kg) y ketamina (100 mg / kg).
- Entregar el oxígeno a través de caudal de purga (50 ml / min).
- Confirmar la profundidad adecuada de la anestesia por la presencia de una buena relajación muscular y la falta de respuesta de los animales a un estímulo nocivo (por ejemplo., Firme pizca dedo del pie).
- Inyectar por vía subcutánea una dosis única de enrofloxacina (0,05 mg / kg) como profilaxis microbianas.
- La analgesia postoperatoria
- Proporcionar analgesia postoperatoria por inyección subcutánea de buprenorfina (0,1 mg / kg) cada 12 horas durante 3 días consecutivos.
- Anestesia durante los procedimientos de diagnóstico por imágenes
- Coloque los ratones en un anesthetizing-box, y luego inducir y mantener la anestesia utilizando aproximadamente 4% y 2% de isoflurano en oxígeno, respectivamente.
- Confirmar la profundidad adecuada de la anestesia por una buena relajación muscular animal y la falta de movimiento.
- condiciones de recuperación
- Mantener a los ratones en la almohadilla de calentamiento hasta la recuperación completa
- No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal después de la cirugía.
- No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Condiciones postoperatorias
- Sede de los ratones por separado durante los 3 primeros días albergar los ratones mediante 4 en jaulas después del día 3.
- Proporcionar agua y comida ad libitum adaptada. Permitir que los ratones de peso-oso, sin restricción alguna actividad durante el periodo post-operatorio.
4. Procedimiento quirúrgico:Femoral segmentaria Defecto Modelo 11,12
- Después de la anestesia, coloque cada ratón en decúbito ventral, con la extremidad posterior izquierda en extensión.
- Frote la extremidad para la cirugía aséptica utilizando 10% de yodo de povidona por 5 min y luego colocar un campo estéril bajo la extremidad para crear una superficie estéril (una cortina transparente estéril se utiliza con el fin de ser capaz de controlar el movimiento respiratorio durante el procedimiento). Se tiene cuidado para mantener la esterilidad del campo quirúrgico durante el procedimiento.
- Hacer un 15 - incisión cutánea longitudinal de 17 mm sobre la cara anterolateral del fémur, que se extiende desde la articulación de la cadera a la articulación de la rodilla.
- Incisión en la fascia lata, divide el músculo vasto lateral y el músculo bíceps femoral para exponer toda la longitud de la diáfisis femoral. Se debe tener cuidado para preservar el nervio ciático en sentido caudal y la cápsula articular distal (Figura 1).
- Para mejorar la expo diáfisis femoralSeguro, transecto el músculo glúteo y el bíceps femoral de la 3ª trocánter.
- Realice una disección circular del fémur en la parte media de la diáfisis.
- Aplicar una placa de titanio micro-bloqueo 6 hoyos (10 mm de largo, 1,5 mm de ancho, peso: 30 mg) en el lado femoral anterior.
NOTA: Los agujeros de la placa, que son de forma cónica empotrable con una parte cilíndrica, acomodar titanio autorroscante tornillos de bloqueo (2 mm de largo, 0,47 mm de diámetro exterior, peso: 5 mg, con superficie inferior del tornillo de cabeza roscada para habilitar el bloqueo dentro de el orificio de la placa) que están conectados a un vástago, que tuerce off cuando está bloqueado. - Perforar el orificio más proximal de la placa usando una broca de 0,3 mm y, o bien la potencia del motor dedicado o la potencia del motor no dedicado que funciona a 2500 rpm a aproximadamente 500 mW 12).
- Insertar el primer tornillo con un destornillador dedicado y luego bloquearlo (Figura 2).
NOTA: Dado que la alineación de tque la placa se determina mediante la aplicación de este primer tornillo, es importante para posicionar la placa paralelo al fémur al insertar el tornillo. - Perforar el agujero más distal de la placa de una manera similar, insertar y bloquear el tornillo (Figura 3).
- Insertar, pero no hacen ningún tipo de bloqueo, los otros dos tornillos exteriores.
- Coloque el cable de la sierra de Gigli 0,22 mm estrechamente alrededor del hueso en una orientación medio-lateral y luego introducirlo en las ranuras de la plantilla (Figura 4).
- Insertar la plantilla dedicado en el tallo de las últimas dos tornillos y aplicarlo encima de la placa (Figura 5).
- Realizar una osteotomía femoral de 3,5 mm de largo mediados de la diáfisis utilizando la sierra de Gigli bajo riego (utilizando solución salina isotónica estéril) para evitar la necrosis térmica. Haga que el ayudante del cirujano tome la plantilla. Tiene el cirujano aplica una tensión constante constante. Tenga cuidado de no enredar el hilo de sierra y de utilizar las medias de dos tercios del alambre. Evitar exmovimiento proceso con el fin de obtener un corte de hueso recta (Figura 6).
- Después de la osteotomía, retire la sierra de Gigli. Para evitar daños de los tejidos blandos, cortar el cable cerca de la sierra al hueso en un lado.
- Retire la plantilla y bloquear los dos últimos tornillos (Figura 7).
- O bien dejar el defecto segmentario vacío o quirúrgicamente llenarlo por los materiales que se probarán en el interior del defecto desagradable.
- Copiosamente enjuagar el campo quirúrgico con solución salina isotónica estéril.
- Coloque el músculo vasto lateral sin apretar sobre la placa. Cerrar la fascia subcutánea y aviones usando un patrón de sutura continua simple y 5.0 glycomer 631 de sutura; cerrar la piel con un patrón de sutura interrumpida simple usando 4,0 glycomer 631 de sutura. Alternativamente, también es posible cerrar la piel utilizando pegamento de la piel.
5. Las evaluaciones in vivo de la regeneración ósea
- Con los ratones bajo anestesia, realice radiográficalas evaluaciones de manera longitudinal, utilizando tanto los rayos X convencionales (26 kV, 10 seg; 2X ampliación; resolución espacial de 20 líneas / mm) y alta resolución de la tomografía computarizada micro-(μCT).
- Para el análisis μCT, adquirir imágenes a una resolución de 36 m (50 kV y 478 mA, en 40 el tiempo de exposición mseg, usando un filtro de 0,5 mm de aluminio, etapa de rotación de 0,7 º, y la rotación tomográfica de 180 º). Analizar las imágenes utilizando el software residente.
6. Las evaluaciones ex vivo de la regeneración ósea
- Diez semanas después de la cirugía, inducir la anestesia con isoflurano en oxígeno, y luego sacrificar los ratones por inyección intraperitoneal de una sobredosis de barbitúricos (1 ml de pentobarbital).
- Escindir los huesos femorales, eliminar la superposición de tejido muscular, y fijar las muestras de hueso en paraformaldehído al 4% (pH 7,4) durante cuatro días.
- Retire la placa y tornillos de cada muestra de un hueso extirpados después fixa paraformaldehídoción.
- Ex Vivo mu Análisis CT
- Coloque cada hueso extirpado y fijado en tubos de polietileno llenas de alcohol al 75% y analizarla utilizando ex vivo μCT.
- Adquirir imágenes a 80 kV y 100 mu (tiempo de exposición de 1.000 mseg, aluminio filtro de 0,5, y 4 micras de tamaño píxeles de la cámara (2.400 x 4.000 con un tamaño de vóxel de 7 micras), un promedio de cuatro marcos para cada incremento de rotación de 0,9 º.
- Reconstruir imágenes en 3 dimensiones (tamaño promedio de vóxel de 13 micras) utilizando una retroproyección filtrada de Hamming con el software residente.
- Para el análisis cuantitativo de la formación ósea, utilizar software residente para obtener el volumen de tejido mineralizado (umbral inferior gris de 45 índices de escala de grises y el umbral de gris superior de 240 los índices de escala de grises) en una región determinada y consistente de interés correspondiente al defecto.
- Realizar análisis de la misma manera para cada ratón con el mismo region de interés.
- Utilice la prueba de análisis unidireccional (intervalo de confianza - en el 95% y el nivel significativas a p <0,05) para comparar la tasa de consolidación ósea y el volumen de tejido mineralizado en la región de interés entre los grupos.
- Análisis histológico
- Insertar cada cortó y se fija el hueso femoral en resina de metacrilato de metilo y la procesan para histología sin descalcificar.
- Cortar cada muestra de médula a lo largo en sección gruesa (200 micras) utilizando una sierra circular de diamante refrigerado por agua.
- Moler cada sección muestra de médula hasta un espesor de 100 micras, pulirlo y mancharlo utilizando Stevenel manchas azules y van Gieson picrofuchsin.
NOTA: Después de la tinción, las células aparecen en azul, hueso en rosa, marrón y coral en bajo microscopio de luz.
Resultados
Los procedimientos quirúrgicos mencionados anteriormente duraron de 45 a 60 min. Osteotomía y osteosíntesis eran fáciles de realizar con la ayuda de un ayudante de cirujano, pero sin utilizar ningún sistema de aumento. No hubo complicaciones intraoperatorias. En un estudio preliminar sobre 18 ratones 11, radiografías postoperatorias presentaron pruebas de que la longitud del defecto óseo (3,43 ± 0,12 mm) y el posicionamiento de la placa (distancia entre la babilla cavidad de la articulación y la parte distal de la base = 2,65 ± 0,56 mm) fueron reproducibles.
La tasa de mortalidad relacionada con la anestesia fue de aproximadamente 5%.
La recuperación funcional de la extremidad operada fue excelente en todos los animales y de soporte de peso completo se observó dentro de un día después de la cirugía (animación Figura 1). El peso de la osteosíntesis (placa y tornillos) usado en la pestudio reenviado era aproximadamente 0,1% del peso corporal del ratón. No se presentaron complicaciones postoperatorias (por ejemplo, infección de la herida, el fracaso del implante, injerto de hueso de migración, etc.) se produjeron. No hay autolesiones o lesiones causados por los compañeros de jaula se produjeron.
Cuando los defectos óseos inducidos quirúrgicamente se dejan en blanco, no se observó formación ósea significativa con el hueso coherente no unión. En contraste, cuando los defectos se rellenaron con ya sea un isoinjerto o un andamio coral, hueso recién formado que se extiende desde los bordes proximal y distal de hueso se observó. Además, la formación de hueso mientras que permite el restablecimiento de la continuidad ósea en la mayoría de los defectos tratados con isoinjertos (Figura 8), sólo se observó el interior del andamio de coral en defectos rellenos con este material. De hecho, no se observó hueso a una distancia superior a 1 mm de los bordes óseos. La ausencia de cartílago en todo análisis histológicos resultados proporcionaron pruebas de laestabilidad de la osteosíntesis obtenido (Figura 9, la Figura 10).
Radiografías y análisis microCT presentó pruebas de que la unión ósea no se produjo en ningún animal del grupo de defectos de izquierda vacía, 10 semanas después de la implantación. El volumen de tejido mineralizado evaluados por análisis microCT fue de 0,8 ± 0,3 mm y 3 era representativa de la hueso recién formado. En los grupos de andamio isoinjerto y coral, se obtuvo la unión ósea en 4 y 4 animales, respectivamente. El volumen de tejido mineralizado evaluada por análisis microCT era 4,4 ± 0,9 mm y 3 8,9 ± 0,7 mm 3. En estos grupos, sin embargo, ya que tanto el isoinjerto y el andamio coral contenían minerales, la formación de hueso nuevo podría no ser verdaderamente distingue del material implantado restante (isoinjerto o andamio coral). Tanto la tasa de unión Bon y el volumen de tejido mineralizado obtenido del grupo isoinjerto ydel grupo andamio coral fueron significativamente (p <0,001) mayores que los obtenidos a partir del grupo defecto de izquierda vacía.
Figura 1:. La exposición quirúrgica de la Creación de la femoral segmentaria Defecto A 15 - 17 mm incisión longitudinal en la piel, que se extiende desde la articulación de la cadera a la articulación de la rodilla, se hizo sobre la cara anterolateral del fémur. La fascia lata se realizó una incisión; el músculo vasto lateral y el músculo bíceps femoral se partieron para exponer toda la longitud de la diáfisis femoral. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: PlacaPosicionamiento y proximal Colocación del tornillo. La placa se aplica en el lado femoral anterior. El agujero más proximal de la placa fue perforado; el primer tornillo se inserta y, a continuación, bloqueado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Distal Colocación del tornillo El agujero más distal de la placa se perforó y se insertó el tornillo y bloqueado. (Reproducido con permiso del Tissue Eng Parte C, 2013, 19 (4), 271-280) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: sierra de Gigli Posicionamiento. Los otros dos tornillos exteriores se insertaron pero no con llave y el cable de los 0,22 mm sierras de Gigli estaba ligada estrechamente alrededor del hueso en una orientación mediolateral. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La plantilla de posicionamiento La plantilla se insertó en el tallo de las últimas dos tornillos y se aplica encima de la placa y luego se inserta el alambre de la sierra en las ranuras de la plantilla.. (Reproducido con permiso del Tissue Eng Parte C, 2013, 19 (4), 271-280) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. Osteotomía se realizó osteotomía y la sierra de Gigli fue retirada. (Reproducido con permiso del Tissue Eng Parte C, 2013, 19 (4), 271-280) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:. Tornillos internos de bloqueo La plantilla se retiró y los dos últimos tornillos bloqueado. Los defectos segmentarios fueron entonces o bien izquierdo vacío o lleno de los materiales ensayados. (Reproducido con permiso del Tissue Eng Parte C, 2013, 19 (4), 271-280) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 8: Representante postoperatoria radiografías y sagital μCT Reconstrucción del hueso femoral de ratones hueso femoral con el respectivo defecto ya sea izquierda vacía (AE), o lleno de injerto óseo singénico masiva (FJ), o lleno de enormes andamios de coral Acropora (KO. ); inmediatamente después de la cirugía (A, F, K), 4 semanas después de la cirugía (B, G, L), 6 semanas después de la cirugía (C, H, M), y 10 semanas después de la cirugía (D, E, I, J, N , O) (placa de longitud = 10 mm). (Reproducido con permiso del Tissue Eng Parte C, 2013, 19 (4), 271-280) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Se observó Representante Radiografía, μCT Reconstrucción e Histología de un defecto Llenos del Coral Andamios prueba en el estudio presentan una gran cantidad de hueso de nueva formación en el medio de los bordes óseos circundantes y el andamio de coral;: Figura 9. por el contrario, poco hueso estaba presente en el interior del andamio. Manchas: Stevenel azul y picrofuchsin von Gieson. En estas condiciones, el hueso, las células, y coral tiñeron de color rojo, azul, y marrón, respectivamente. Barra de escala = 500 micras. ACS = Acropora andamio de coral; BN = hueso. (Reproducido con permiso del Tissue Eng Parte C, 2013, 19 (4), 271-280) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Repre tante Histología de una izquierda Defecto vacía (A), lleno de Massive singénico de injerto óseo (B), y lleno de Coral Andamios (C). En el defecto deja vacío, el redondeo de la óseos bordes con el relleno del canal medular y abundante tejido fibroso profunda en el defecto se observaron. En el defecto lleno de injerto óseo singénico masiva, se observó la continuidad del hueso entre el injerto y los bordes óseos circundantes; médula ósea estaba presente en toda la cavidad originales. En el defecto de llenado con el andamio de coral, se observó hueso recién formado entre los bordes óseos circundantes y el andamio de coral, pero poco hueso estaba presente en el interior del andamio. Manchas: Stevenel azul y picrofuchsin von Gieson. En estas condiciones, el hueso, las células, y coral tiñeron de color rojo, azul, y marrón, respectivamente. Barra de escala = 500 mm. ACS, andamio de coral; BN, hueso; BM, la médula ósea; FT, tejido fibroso. (Reproducido con permiso del Tissue Eng Parte C, 2013, 19 (4), 271-280)OAD / 52940 / 52940fig10large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Animados / vídeo Figura 1: Representante de vídeo de la marcha de un ratón de un solo día postoperatorio. Peso se observó rodamiento. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Discusión
Implantación ectópica de materiales y dispositivos relacionados en ratones-ortopédicos se realiza con frecuencia para evaluar el hueso que forma las capacidades de los diferentes andamios 13,14. Sin embargo existen diferencias importantes entre los modelos ectópicos y ortotópico, incluyendo factores de señalización osteogénico nativos e interacciones paracrinas con células formadoras de hueso huésped.
El presente estudio establece una gran segmental murino reproducible, de tamaño crítico defecto femoral (3,5 mm, aproximadamente el 20-25% de la longitud del fémur). Teniendo en cuenta el tamaño de dicho defecto y la estabilidad proporcionada por la placa de osteosíntesis resultante, este modelo imita el hueso atrófico no unión-clínicamente encontrado.
El período de tiempo después de la operación elegida en el presente estudio, está en línea con los ratones modelos sin unión descritos anteriormente, que muestra una falta de cicatrización adecuada después de 8 a 12 semanas 4,9,15,16.
Lo más importante, reproducible y estable de osteosíntesis, así como la estabilidad de los sustitutos óseos implantados se obtuvieron sin una significativa morbilidad y mortalidad 1,2 con el uso tanto de la placa de bloqueo y una plantilla para realizar la osteotomía. Este resultado contrasta también los resultados reportados cuando se utilizaron ya sea un fijador externo o un clavo intramedular 4,5,17-24. Para los fijadores externos desventajas potenciales incluyen: la variabilidad en la rigidez, las infecciones de las vías alfileres, aflojamiento de los pasadores, los potenciales de lesiones debido a los pasadores y el peso de los materiales (de 4 a 20% del peso corporal del ratón). Para el clavo intramedular desventajas potenciales incluyen: llenado de la cavidad medular con el clavo y el daño iatrogénico de las superficies articulares.
Otros segmentarias murino, de tamaño crítico defectos femorales estabilizadas por osteosíntesis placa se han descrito con defecto óseo creado por una rebaba y que van desde 1,5 a la longitud de 2 mm 16,25. en THe modelo actual, el uso de una plantilla y un hilo de sierra permite una osteotomía precisa 3,5 mm de largo sin músculos significativas trauma.
Sin embargo, para tener éxito en la realización del procedimiento se debe tener en cuenta varios puntos clave: No use los ratones pequeños (ratones Nude, ya sea con un peso de menos de 25 go edad de 8 semanas) de lo contrario la placa debe ser demasiado largo. Cuando se acerca el hueso femoral, tener cuidado de preservar tanto el nervio ciático en sentido caudal y la cápsula articular distal. Aplicar la placa en la parte anterior del hueso femoral y desde la alineación de la placa se determina mediante la aplicación de este primer tornillo, tener cuidado de colocar la placa en paralelo al fémur al insertar este primer tornillo.
Antes de realizar la osteotomía, tener cuidado de realizar una disección circular del fémur en la parte media de la diáfisis de evitar trauma muscular. Al realizar la osteotomía, ayudante del cirujano debe mantener firmemente la guía y el surGeon debe tener cuidado de (i) no enredar el hilo de sierra, (ii) utilizar el medio de dos tercios del alambre mientras se aplica una tensión constante constante, y (iii) para evitar el exceso de movimiento para obtener un corte de hueso recta.
curación ósea es posible en el presente modelo proporcionado se utiliza un injerto de hueso. Por otra parte, este modelo permite realizar más estudios sobre los mecanismos implicados en las estrategias de sustitución ósea cuando se utilizan injertos, ya sea de origen humano o células en un segmentaria, defecto bien estandarizada, grande, hueso.
Además, de acuerdo con las tendencias actuales que requieren refinamiento y reducción de la utilización de animales en la investigación relacionada con la ortopedia, este modelo puede ser utilizado en conjunción con técnicas de imagen in vivo, tales como bioluminiscencia. Tales técnicas no invasivas permiten monitorear tanto la supervivencia celular y la cicatrización de los tejidos implantados sin requerir el sacrificio de animales 26.
Las principales limitaciones de este modelo son tanto elcondiciones de carga y el volumen del defecto óseo creado porque no imitan completamente las encontradas clínicamente en seres humanos. Otras limitaciones del modelo son (i) la radio-opacidad de la placa que puede requerir la eliminación de la placa antes de ex vivo análisis μCT y puede complicar la interpretación de los resultados longitudinales examen radiográfico y, (ii) la incapacidad para modular la rigidez placa que puede ser un parámetro mecánico clave en la formación de hueso 27-30.
Hay que tener en cuenta también, cuando se utiliza isoinjerto hueso u otros andamios que contienen un componente mineral (especialmente carbonato de calcio), que algún sesgo se introducen en el proceso de segmentación del análisis de micro-CT, debido a la densidad del hueso recién formado, en parte se superponen con ya sea la densidad o densidad isoinjerto andamio. Por esta razón, el volumen de hueso obtener por el análisis de micro-CT mayoría reflejar el volumen de tejido mineralizado (hueso recién formado plussustituto óseo) 11,26,31.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Rena Bizios por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| α-MEM , Medio Esencial Mínimo Eagle | Sigma-Aldrich, Francia | M4526 | 500 ml |
| Acropora sp. cubos de exoesqueleto de coral, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, Francia | Cubos de 3 x 3 x 3 mm, esterilizado en autoclave (121 ° C durante 20 min) esterilización | |
| Buprenorfina, Buprecare® | Axience, Pantin, Francia | 0,3 mg/ml | |
| Xilacina, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, Francia | 20 mg/ml | |
| Ketamina, Ketamina 500® | Virbac, Carros, Francia | 50 mg/ml | |
| Isoflurano, Forè ne® | Abbott, Arcueil, Francia | ||
| Enrofloxacina, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, Francia | 50 mg/ml | |
| Pentobarbital, Dolethal® | Vé toquinol, Lure, Francia | 182,2 mg/ml | |
| Caja anestésica | Ugo Basile, Gemonio, Italia | 7900/10 | |
| Paño estéril de plástico transparente, BusterOpCover 30 x 45 cm | Buster, Coveto, Montagu, Francia | 613867 | |
| 10% povidona yodada, Vé té cenar® Solución | Vé toquinol, Señuelo, Francia | 100 mg/ml | |
| Placa de microbloqueo de titanio, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Suiza, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 orificios, 10 mm de largo y 1,5 mm de ancho, esterilizado en autoclave (121 ° C para 20 min) esterilización o esterilización en frío (óxido de etileno) |
| 0,3 mm broca, Broca 0,30 mm | RISystem AG, Davos, Suiza, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclave (121 ° C para 20 min) esterilización o esterilización en frío (óxido de etileno) |
| Potencia del motor | RISystem AG, Davos, Suiza, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Esterilización en frío (óxido de etileno) |
| Destornillador, Handrill | RISystem AG, Davos, Suiza, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclave (121 ° C para 20 min) esterilización o esterilización en frío (óxido de etileno) |
| Tornillos de bloqueo autorroscantes, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Suiza, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm de largo, 0,47 mm de diámetro exterior y 0,34 mm de diámetro central, esterilización en autoclave (121 ° C para 20 min) esterilización o esterilización en frío (óxido de etileno) |
| Plantilla, MouseFix XL Guía de taladro y sierra | RISystem AG, Davos, Suiza, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3,5 mm entre las ranuras, esterilización en autoclave (121 ° C para 20 min) esterilización o esterilización en frío (óxido de etileno) |
| Sierras Gigli de 0,22 mm (Sierras de 0,22 mm) | RISystem AG, Davos, Suiza | ||
| 5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vé toquinol, Señuelo, Francia | Aguja de corte | |
| 4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vé toquinol, Lure, Francia | Rayos X con aguja de corte punzante | |
| , MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
| In vivo microtomografía microcomputarizada de alta resolución, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Bélgica | ||
| Ex vivo tomografía microcomputarizada de alta resolución, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Bélgica | ||
| Software residente: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Bélgica |
Referencias
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