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Artículo de método

Producción de Nurr-1 específico anticuerpos policlonales Libre de reactividad cruzada contra su estrecha homólogos, NOR1 y Nur77

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DOI:

10.3791/52963

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17 de agosto de 2015

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1Molecular Neurobiology Laboratory, Psychiatry, McLean Hospital, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Konyang University

En este artículo

Resumen

Aquí, dirigimos selectivamente anticuerpos contra un miembro específico de una familia de proteínas altamente conservadas mediante la inmunización de animales con sus regiones más divergentes y luego la eliminación de anticuerpos reactivos cruzados por preadsorción.

Resumen

La subfamilia de receptores nucleares 4 (NR4A) está compuesta por 3 proteínas relacionadas que comparten un dominio de unión al ADN (DBD) y un dominio de unión al ligando (LBD). La proteína 1 relacionada con el receptor nuclear (Nurr1 o NR4A2) desempeña un papel clave en el mantenimiento del sistema dopaminérgico. Las disfunciones de dopamina asociadas con el gen Nurr1 incluyen la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y la depresión maníaca, entre otras. Además, la evidencia reciente indica que Nurr1 también se expresa en otras áreas del cerebro, como el hipocampo, y desempeña un papel fundamental para el aprendizaje y la memoria. Los otros miembros de la familia son el factor de crecimiento nervioso IB (Nur77 o NR4A1) y el receptor huérfano derivado de neuronas 1 (NOR1 o NR4A3). Para ayudar a investigar las funciones precisas de Nurr1 en las disfunciones neuronales dopaminérgicas y otras disfunciones neuronales relacionadas con la región cerebral, se necesitaban anticuerpos desprovistos de reactividades cruzadas contra Nur77 y NOR1. Dado que las proteínas son más divergentes en sus LBD que en sus dominios de unión al ADN, la inmunización con LBD purificadas debería producir anticuerpos específicos para Nurr1 con reactividades mínimas contra Nur77 y/o NOR1. Aunque los anticuerpos anti-Nurr1 se generaron con éxito, estos mostraron una inmunorreactividad significativa contra los demás miembros de la familia. La cromatografía de afinidad sobre la proteína A inmovilizada, seguida de preadsorción contra las LBD Nur77 y NOR1 inmovilizadas, produjo anticuerpos específicos de Nurr1 libres de reactividad cruzada. Aquí, dirigimos selectivamente los anticuerpos contra un miembro específico de una familia de proteínas altamente conservadas mediante la inmunización de animales con sus regiones más divergentes y luego la eliminación de anticuerpos reactivos cruzados mediante preadsorción. El objetivo del protocolo es aumentar la especificidad de los anticuerpos policlonales a través de la preadsorción frente a antígenos de reacción cruzada.

Introducción

El factor de transcripción Nurr1 y sus homólogos (Nur77 y NOR1) pertenecen a la subfamilia de receptores nucleares 4A (NR4A) 1. También son receptores huérfanos porque sus ligandos endógenos no son identificados todavía. Nurr1 se clonó por primera vez en 1992 y aunque sabe que se expresa en el cerebro 2, su papel esencial para el desarrollo y mantenimiento de las neuronas de dopamina del cerebro medio fue revelado por estudios de ratones knockout 3. Además, su importante papel para el mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo se demostró recientemente por un estudio knockout condicional 4. Debido a estos estudios elegantes que muestran papeles críticos de Nurr1 para las neuronas de dopamina del cerebro medio, muchos estudios posteriores se han centrado en gran medida en el cerebro medio neuronas de dopamina y trastorno neurodegenerativo relacionada con la dopamina, enfermedad de Parkinson (PD) 5.

Notablemente, Nurr1 se expresa no sólo en las neuronas de dopamina del cerebro medio (MDA), sino también en diáreas cerebrales versículo 2, lo que sugiere que puede tener un papel funcional en muchas áreas no-DA, que está fuertemente apoyadas por estudios más recientes muestran que Nurr1 juega un papel importante en varias funciones cerebrales. Para ejemplos, se demostró que las actividades de inducción de memoria tales como el aprendizaje, u otras tareas dependiente del hipocampo da lugar a la regulación de la expresión de Nurr1 en el hipocampo 6,7. Además, derribar de expresión Nurr1 en el hipocampo fue suficiente para afectar la memoria a largo plazo y / o la plasticidad sináptica 8-11, lo que sugiere fuertemente que Nurr1 juega diversos papeles en muchas áreas del cerebro. Por lo tanto, para entender mejor la expresión de tipo celular específico y subcelular de Nurr1, es deseable usar anticuerpos-Nurr1 específico, que no presentan ninguna reactividad cruzada con sus homólogos Nur77 o NOR1. En este trabajo se describe un protocolo pre-adsorción para generar anticuerpos Nurr1 específica y presentar datos adicionales que muestran su especificidad.

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Protocolo

Nota: La composición de todas las soluciones citadas a continuación se puede encontrar en la Tabla de Materiales / Equipo.

1. columna de proteína A Purificación de anticuerpos

  1. Equilibrar una proteína de una columna de centrifugación y todos los tampones necesarios a temperatura ambiente durante 15 min antes de iniciar el procedimiento.
  2. Diluir el suero inmune 1: 1 con Proteína A IgG Binding Buffer. (Se recomienda 5 ml de suero).
  3. Golpee suavemente una columna de proteína vuelta en la mesa de trabajo para desalojar cualquier resina que puede ser alojada en la tapa. Retire la tapa superior y coloque suavemente el cierre inferior. Colocar la columna en un tubo de recogida de 15 ml y permita que la solución de almacenamiento para drenar.
  4. Añadir 5 ml de Proteína A IgG Binding Buffer y permita que la solución drene.
  5. Aplicar el suero inmune diluido a la columna y recoger el flujo a través. Para obtener los mejores resultados, añadir un volumen de muestra que contiene una concentración de anticuerpos de menos de 80% de la unión del anticuerpo-capacit de la columnay.
  6. Lavar la columna con 15 ml de Proteína A IgG Binding Buffer o hasta que la absorbancia a 280 nm es inferior a 0,1.
  7. Añadir 100 l de tampón de neutralización a cinco tubos de recogida etiquetados.
  8. Añadir 5 ml de tampón de elución de IgG a la columna de Proteína A y recoger fracciones de 1 ml en cada uno de los tubos que contienen los 100 l de tampón de neutralización.
  9. Medir la absorbancia de cada fracción a 280 nm y las fracciones de la piscina con una absorbancia mayor que 0.5. Mantenga las fracciones agrupadas en hielo hasta que esté listo para la diálisis.
  10. Regenerar la columna mediante la adición de 8 ml de IgG tampón de elución y permita que la solución fluya a través de la columna.
  11. Lavar la columna con una solución de proteína de unión Una IgG hasta que el pH eluyente vuelve a 7.4.
  12. Almacenar la columna mediante la adición de 5 ml de solución de almacenamiento (azida de sodio 0,02% en PBS). Cuando aproximadamente 3 ml permanecen en la columna, la tapa inferior y asegurar la tapa superior. Guarde la columna a 4 ° C.
  13. Determinar la longitud otubos de diálisis f necesario de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de tubos de 16 mm de diámetro plana usar 5,47 cm de longitud del tubo por ml de solución que se dializa. Corte el tubo y enjuagar con PBS pH 7,4 durante 15 a 30 min.
  14. Doblar y el clip un extremo del tubo de diálisis, transferir la IgG reunidas que contienen fracciones a tubos de diálisis equilibrada en PBS pH 7,4 y cerrar el otro extremo.
  15. Se dializa a temperatura ambiente contra 200 volúmenes de PBS pH 7,4 durante 2 h.
  16. Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante otras 2 horas a temperatura ambiente.
  17. Cambiar el tampón de diálisis (fresco PBS pH 7,4) y se dializa durante la noche a 4 ° C.
  18. Mantener la solución de anticuerpo dializada a 4 ° C hasta que esté listo para proceder con etapas de purificación adicionales.
  19. Evaluar la concentración de anticuerpo utilizando su absorbancia a 280 nm y el coeficiente de absorción molar de anticuerpos a 280 nm de 210.000 M -1 cm -1 12.

2. Acoplamiento de LBD proteínas para Aminolink Acoplamiento Resina

  1. Prepare dos columnas, una para NOR1 y el otro para Nur77. Siga el mismo protocolo para ambas proteínas.
  2. Descongelar la proteína que se acopla a la resina en hielo. Determinar la concentración de proteína usando su coeficiente de extinción molar y su absorbancia a 280 nm 12.
    1. Alternativamente, utilizar un ensayo de determinación de proteínas tales como el ensayo de 13 ácido bicinconínico. Si la proteína se disuelve en un intercambio de Diálisis tampón que contiene amina o tampón contra el enganche de tope. Si la proteína es en un tampón adecuado (no hay aminas libres) diluirlo 4 veces en tampón de acoplamiento.
  3. Utilice 2 ml de resina para 2 mg de proteína. Todos los pasos que siguen son para la resina de 2 ml en una columna de 10 ml. Hasta 10 mg de proteína puede ser vinculado por 1 ml de resina (2 ml de 1: 1 de suspensión).
  4. Preparar una columna de 10 ml empujando una frita a la parte inferior y funcionando PBS pH 7,4 a través de él. Cap tél parte inferior de la columna y añadir 2 ml de Coupling Buffer.
  5. Añadir el volumen deseado de suspensión (4 ml para obtener 2 ml de resina) a la columna, retire la tapa inferior y dejar que el drenaje de la columna. Lavar la columna con un total de 6 ml (volumen 3 de resina de lecho) de acoplamiento de búfer y permitir que la columna se drene. Después de que el tampón de acoplamiento ha drenado, coloque la tapa inferior.
  6. Añadir 2-4 ml de proteína en suspensión en tampón de acoplamiento a la columna (mantener una alícuota de la solución de proteína para evaluar la eficiencia de acoplamiento mediante la comparación de la concentración de proteína del eluato en el paso 2.11 utilizando la absorbancia a 280 nm o el ensayo bicinconínico) . Tapar y mezclar de punta a punta para tener una solución homogénea.
  7. Pesar un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml vacío y pasar a la campana de humos. Transferir cuidadosamente NaCNBH3 (aproximadamente 0,05 g) en el tubo pesado previamente. Cerrar el tubo y pesar el tubo que contiene NaCNBH3. No abra el tubo fuera del capó.
  8. Basado en el peso deNaCNBH3 transferido en el tubo, hacer una solución 5 M mediante la adición de 1 M NaOH. El peso molecular de NaCNBH3 es 62,84 g, por lo tanto 0.05 g es igual a (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 moles) 7,96 x 10 -4 moles. Para hacer una solución add 5 M (7,96 x 10 -4/5) 159 l de 1 M NaOH.
  9. Medir el volumen total de la reacción que tiene el volumen de resina en consideración. Añadir 10 l de 5 M NaCNBH3 por ml de reacción.
    1. Por ejemplo: para un volumen de reacción 4 ml añadir 40 l de 5 M NaCNBH3. Para 1 ml de resina y 3 ml de proteína añadida, el volumen total es de 4 ml.
  10. Tape la columna y la mezcla de punta a punta. Asegure la columna en un rotador tubo y dejar que la reacción continúe durante la noche a 4 ° C.
  11. Por la mañana, llevar la columna a la campana química y cuidadosamente quite la tapa como un poco de gas puede haberse formado. Escurrir la columna en un tubo limpio y guardar el eluido para medir la concentración de proteínacentración mediante la absorbancia a 280 nm Método 12 o el ensayo de ácido bicinconínico y compararla con la concentración de proteína de partida en el paso 2.6.
  12. Lavar la resina con 4 ml de acoplamiento Buffer y dejar que la fuga de la columna.

3. Sitios Bloqueo restante

  1. Lavar la resina con 4 ml de tampón de enfriamiento. Escurra y coloque la tapa inferior. Añadir 2 ml de tampón de extinción y suspensión de la resina.
  2. Evaluar el volumen total de reacción midiendo el volumen de resina y el volumen de tampón de temple a continuación, añadir 10 l de 5 M NaCNBH3 por ml de volumen de reacción.
  3. Mezclar suavemente a temperatura ambiente durante 30 min de extremo a extremo. Después de 30 min, traer la columna en la campana de humos. Retire con cuidado la tapa y retire la tapa inferior y dejar que la fuga de la columna en un tubo de residuos.
  4. Lavar la columna con 5 volúmenes de resina de solución de lavado. Monitorear los lavados para la presencia de proteínas residuales mediante la medición de abso del eluatorbance a 280 nm. Proteínas desacopladas se lavan a cabo por la alta concentración de sal.
  5. Lavar la resina con 6 ml de desgasificado PBS pH 7,4 que contiene azida de sodio al 0,02%. Mantenga la columna a 4 ° C hasta que se necesite.

4. Purificación de Nurr1 anticuerpos específicos

  1. Enjuague la columna junto Nur77 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el Nur77 LBD columna junto drenado en un nuevo tubo de recogida de 15 ml.
  2. Añadir 5 ml de proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados, limitar la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través. Ponga a un lado en el hielo hasta que esté listo para agregar a la columna junto NOR1 LBD.
  3. Enjuague la columna junto NOR1 LBD con 10 ml de PBS pH 7,4 y dejar que la fuga de la columna. Tapar el fondo de la columna y colocar el NOR1 LBD columna acoplada en un tubo de recogida de 15 ml.
  4. Añadir el flujo a través del golpe Nur77 LBDcolumna encabezada, la tapa de la columna y colocar en un rotador a 4 ° C durante 1 hora. Retire las tapas superior e inferior y recoger el flujo a través.
  5. Medir la concentración de anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm.

Análisis basado en ELISA 5. purificada de Anti-Nurr1 Anticuerpo

  1. Añadir 100 l de proteína (2,5 g / ml) a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Si las pruebas 3 proteínas diferentes, añadir 100 l de proteína 1 de pozos A1 a H4, 100 l de la proteína 2, a pozos A5 a H8 y 100 l de proteína 3 a pozos A9 a H12. Cubrir la placa e incubar durante la noche a 4 ° C.
  2. Lavar los pocillos recubiertos dos veces con 300 l por pocillo de PBS pH 7,4 y añadir 300 l de tampón de bloqueo ELISA a la totalidad de los pocillos recubiertos de antígeno y se incuba 2 horas a temperatura ambiente.
  3. Mientras que la placa está bloqueando preparar una dilución de partida deseado de anticuerpo anti-Nurr1 purificado (que van de 10 a 100 g / ml) en tampón de bloqueo ELISA.
  4. Después de 2 horas de bloqueo, reemplazar el tampón de bloqueo ELISA con 100 l de tampón bloque fresca ELISA a todos los pocillos.
  5. Añadir 100 l de anticuerpo anti-Nurr1 purificada diluida a todos los pocillos de la fila A. En serie diluir los anticuerpos mediante la transferencia de 100 l de solución de la fila A de los pozos en la fila B seguido de la transferencia de 100 l de solución de la fila B a la fila C continuando hasta la fila G. Después de mezclar las soluciones en los pocillos de la fila G descartar los extra de 100 l. Wells en la fila H sólo reciben los iniciales 100 l de tampón de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr.
  6. Lavar la placa tres (3) veces con 300 l por pocillo de 0,05% de Tween 20 en PBS pH 7,4 y seque la placa para eliminar el exceso de tampón de lavado.
  7. Añadir 100 l de peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado de cabra anti-IgG de conejo diluido en tampón de bloqueo ELISA (1: 8000 dilución; la gama típica es de 1: 5.000 a 1: 25.000). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr.
  8. Lavar las placas ªree (3) veces como se describe en 5.6. Enjuague todos los pocillos llenándolos con 300 l de agua desionizada. Seque el exceso de agua invirtiendo la placa sobre papel absorbente.
  9. Añadir 100 l de 3, 3 ', 5, 5' tetrametilbencidina (calentó a temperatura ambiente) a todos los pocillos e incubar 15 a 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
  10. Detener la reacción mediante la adición de 50 l de 2 NH 2 SO 4.
  11. Leer la absorbancia a 450 nm restando fondo a 650 nm.

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Resultados

Una comparación de columna de proteína A purificada anticuerpos Nurr1 específica con la proteína A anticuerpos anti-Nurr1 purificados seguido por paso a través Nur77 LBD y NOR1 LBD columnas se muestra en la Figura 1. Como puede verse, la proteína A-anticuerpo purificado Nurr1 exhibió una fuerte unión a Nurr1 LBD. Sin embargo, también mostró unión significativa a Nur77 LBD y para NOR1 LBD. Cuando Proteína A-Nurr1 anticuerpos purificados se purificaron adicionalmente contra Nur77 LBD y NOR1 LBD, la afinid...

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Discusión

El éxito de este protocolo se basa en la disponibilidad de proteínas puras para la caracterización de los anticuerpos generados contra un miembro específico de la familia de proteínas de interés. No hay necesidad de purificar los anticuerpos usando proteína A / G hasta que se establezca claramente que no son significativas reactividades cruzadas por ELISA y Western Blot.

Como se indica en el texto, es importante para evitar la suspensión de la proteína (s) a ser reticulado a la columna en un...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (NS070577 y NS084869).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dominio de unión de ligando purificado de la columna Nurr1, Nor 1 y Nur77Solución de almacenamiento
Resina y kit de acoplamiento AminoLink ThermoScientific44890
Columna de centrifugación de proteína AThermo Scientific89978
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoCorning21-031-CV
96 pocillos. Placas de fondo de flauta, brida alta, 330 y mu; lThermo Scientific3455
10% Suero de cabra normalKPL50-675-69
Diluyente de leche / Concentrado bloqueante  KPL50-82-01
Tampón de elución IgGThermo Scientific21004
Micro BCA Kit de ensayo de proteínasThermo Scientific23235
Rábano picante Peroxidasa conjugada de cabra anti-conejo IgG (H+L)Thermo Scientific31460
Resina Ni-NTAThermo Scientific88221
3, 3', 5, 5' TetrametilbencilidinaThermo Scientific34028
2N H2SO4Macron Fine ChemicalsH381 05
Proteína A Tampón de unión a IgGThermo Scientific21001
Tampón de elución de IgGThermo Scientific21004
SoluciónFosfato tamponado Solución salina que contiene azida sódica al 0,02 %
Spectra/Por 7 Tubo de diálisis pretratadoSpectrum Labs132128
10 ml Columnas desechablesThermo Scientific29924
AminoLink Tampón0,1M Fosfato de sodio, 0,05% NaN3, pH 7,0
Tampón1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH
7,4
Solución de1M NaCl, 0,05% NaN3
de bloqueo ELISA1% Suero normal de caballo (NHS), 1% Suero normal de cabra (NGS) en 1X KPL diluyente de leche
Soluciónde almacenamiento PBS pH 7,4 que contiene 0,02% azida sódica
Micropipetas: 10 μ l; 20 μ l; 200 μ l; 1000 μ l
de almacenamiento en columna de acoplamiento de enfriamiento lavado Tampón

Referencias

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