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Artículo de método

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

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DOI:

10.3791/52976

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13 de enero de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para medir la captura bacteriana por las células T CD4 + que se produce durante la presentación de antígenos a través de transinfection de células dendríticas infectadas previamente (DC). Mostramos cómo realizar los pasos necesarios: el aislamiento de pilas, la infección de la formación de conjugado de células DC, DC / T, y la medición de bacterias transfección de células T.

Resumen

Recientemente, hemos demostrado, contrariamente a lo descrito, que las células T CD4+, el paradigma de las células inmunitarias adaptativas, capturan bacterias de las células dendríticas infectadas (CD) mediante un proceso llamado transinfección. Aquí, describimos el análisis del proceso de transinfección, que ocurre durante el curso de la presentación del antígeno. Este proceso se dio a conocer mediante el uso de células T CD4+ de ratones transgénicos OTII, que portan un receptor de células T (TCR) específico para un péptido de ovoalbúmina (OVAp), que por lo tanto puede formar inmunocomplejos estables con células dendríticas infectadas cargadas con esta OVAp específica. La dinámica de las bacterias que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) durante la transmisión de células DC-T se puede monitorear mediante imágenes de células vivas y la cuantificación de la transinfección bacteriana se puede realizar mediante citometría de flujo. Además, la transinfección se puede cuantificar mediante un método más sensible basado en el uso de gentamicina, un antibiótico aminoglucósido no permeable que mata las bacterias extracelulares, pero no las intracelulares. Este método clásico se ha utilizado anteriormente en microbiología para estudiar la eficacia de las infecciones bacterianas. A continuación explicamos el protocolo del proceso completo, desde el aislamiento de las células primarias hasta la cuantificación de la transinfección.

Introducción

Cuando un patógeno infecta a su huésped, por lo general hay una activación de la respuesta inmune innata y adaptativa, necesarios para la eliminación de bacterias. La inmunidad innata es la primera línea de defensa que impide que la mayoría de las infecciones. La inmunidad innata distinguir en unos elementos precisos manera que se conservan entre grandes grupos de microorganismos (patrones moleculares asociados a patógenos, PAMP) 1. Los mecanismos de la inmunidad innata incluyen barreras físicas tales como la piel, las barreras químicos (péptidos antimicrobianos, la lisozima) y los leucocitos innatos, que incluyen los fagocitos (macrófagos, neutrófilos y células dendríticas), mastocitos, eosinófilos, basófilos y células asesinas naturales 2. Estas células identificar y eliminar los agentes patógenos, ya sea atacando a través de contacto o mediante fagocitosis, que incluye patógenos que envuelve y matando. Este sistema no permite la defensa de toda la vida, en contraste con la inmunidad adaptativa, que confieren memoria inmunológica contra pathogens. El sistema inmune adaptativo es la segunda línea de defensa y es capaz de reconocer y reaccionar a los antígenos específicos de microbios múltiple y sustancias no microbianas 3. Los principales componentes del sistema inmune adaptativo son los linfocitos, que incluyen células B y T. Las células B están involucrados en la respuesta humoral, secretoras de anticuerpos contra agentes patógenos o proteínas exógenas. Sin embargo, las células T representan la inmunidad mediada por células, la modulación de la respuesta inmune con la secreción de citoquinas o matar las células infectadas por patógenos 4.

Células presentadoras de antígenos (APC), incluyendo células dendríticas o macrófagos, componentes del sistema inmune innato, pueden reconocer patógenos fagocitan y componentes bacterianos proceso en antígenos, que se presentan en la superficie celular por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) 5.7. Después de APC han fagocitado patógenos, por lo general migran a los ganglios linfáticos de drenaje, donde interactúan con Tlas células. Linfocitos T pueden reconocer los complejos de péptido-MHC específicos por sus receptores de células T. La sinapsis inmune (IS) se produce en la interfaz entre una APC cargadas con antígeno y un linfocito durante la presentación de antígenos 8,9. Algunas bacterias pueden sobrevivir fagocitosis y difundir sistemáticamente dentro APC. En este punto de vista, las CPA infectadas sirven como reservorios de bacterias o "caballos de Troya" que facilitan la propagación de bacterias 10. El contacto íntimo entre APC y los linfocitos que tienen lugar durante el curso de la formación es también funcionan como una plataforma para el intercambio de parte de las membranas, material genético y los exosomas y puede ser secuestrado por algunos virus para infectar las células T; este proceso se llama transinfection 11-13.

Algunas bacterias patógenas (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica y Shigella flexneri) son capaces de invadir los linfocitos T in vivo y modificar su comportamiento 14-16 de. Tenemosdescriben recientemente que los linfocitos T también son capaces de capturar las bacterias por transinfection a partir de células dendríticas infectadas previamente (DCs) durante el curso de la presentación del antígeno 16. Células T de captura bacteriana por transinfection excesivamente más eficaz (1,000-4,000x) que las infecciones directos. T patógeno captura de las células y las bacterias no patógenas que indica que transinfection es un proceso impulsado por las células T. Sorprendentemente, transinfected T (TIT) células murieron rápidamente las bacterias capturadas y lo hicieron más eficiente que los fagocitos profesionales 16. Estos resultados, que se rompen un dogma de la inmunología, muestran que las células de la inmunidad adaptativa pueden realizar funciones que eran supuestamente exclusiva de la inmunidad innata. Además, se demostró que las células Tit secretan grandes cantidades de citoquinas pro-inflamatorias y protegen de las infecciones bacterianas en vivo.

Aquí se presentan los diferentes protocolos utilizados para estudiar el proceso transinfection bacteriana enun modelo de ratón. Este modelo se basa en el uso de células T CD4 + procedentes de ratones transgénicos otii, que llevan un TCR específico para el péptido 323 a 339 de OVA (OVAp) en el contexto de la I-Ab 17 que interactúan específicamente con el hueso bacteriana infectada marrow- DCs derivadas (18,19) BMDCs cargados con OVAp, formando sinapsis inmunes estables.

Transinfection células T puede ser visualizado y rastreado mediante microscopía de fluorescencia. Además, la citometría de flujo se puede utilizar para la detección de células infectadas mediante el aprovechamiento de la fluorescencia emitida por las bacterias que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) 16,20. Por otra parte, transinfection de células T se puede cuantificar mediante un enfoque más sensible, el ensayo de supervivencia de gentamicina que permite la medición de un gran número de eventos. La gentamicina es un antibiótico que no puede penetrar las células eucariotas. Por lo tanto, el uso de este antibiótico permite la diferenciación de bacterias intracelulares que sobrevivió a la fr Además antibióticolos extracelulares om que fueron asesinados 21.

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Protocolo

Nota: Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad Autónoma de Madrid y llevaron a cabo bajo la supervisión de la Universidad Autónoma de Madrid, Jefe de Protección de los Animales y la Salud, de acuerdo con las directrices españolas y europeas. Los ratones fueron criados en el libre (SPF) vivienda patógeno específico y fueron sacrificados por personal entrenado y calificado utilizando dióxido de carbono (CO 2) método de inhalación.

1. Ratón médula ósea derivada de los DC La diferenciación y la infección

Nota: La Figura 1 resume este primer paso. Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en la capilla de ahora en adelante, utilizando sólo estériles medios, instrumentos, puntas de pipetas y placas de cultivo.

  1. Derivadas de la médula ósea de ratón DC Diferenciación
    1. Diseccionar tibias y fémures de un C57 / BL6 ratón 22 y transferir en un plato de plástico con 10 ml de medio RPMI.
    2. Cortar cada epífisis fuera, con tijeras estériles y exponer la médula ósea, que tiene un color rojo brillante característico.
    3. Infundir el interior del hueso con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tampón / BSA / EDTA PBS) usando una jeringa estéril en un Petri estéril plato.
    4. Recoger la suspensión de células y se centrifuga en un tubo a 600 xg en una centrífuga refrigerada (4 ° C).
    5. Resuspender las células en 1 ml de cloruro de amonio--potasio (ACK) de tampón de lisis (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO3 y EDTA 0,1 mM) y se incuba durante 30 segundos a RT con el fin de eliminar las células rojas de la sangre.
    6. Añadir 10 ml de medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y filtrar a través de un filtro de células (70 micras) para eliminar los fragmentos de hueso y grupos de células antes de centrifugar a la misma velocidad (600 xg) porque grumos se eliminaron por filtración.
    7. Contar las células de und ajustar a 5 x 10 5 células / ml con RPMI 10% FBS (que contiene 50 mM B-mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM) y se añade 20 ng / ml de factor recombinante murino de granulocitos y macrófagos estimulante de colonias (rm-GM-CSF) como una concentración final.
    8. Añadir esta suspensión a una, la calidad microbiológica estéril, 15 cm placa de Petri, y la cultura en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2).
    9. Cada tres días, giran hacia abajo tanto las células no adherentes y células independientes con EDTA 5 mM en PBS y resuspender en 5 x 10 5 células / ml de densidad celular, con un nuevo medio que contiene 20 ng / ml rm-GM-CSF.
  2. La maduración de las DC y Antigen Cargando
    1. Al día 9, resuspender las células en 5 x 10 5 células / ml de densidad en medio que contiene 20 ng / ml rm-GM-CSF. A continuación, añadir 20 ng / ml de lipopolisacárido (LPS) para permitir una alta expresión de MHC-II en las células y se incuba en un no-tejido de cultivo estéril tratada con plato de 15 cm Petri durante 24 horas.
    2. Después de unadía de LPS-estimulación, manchar algunas células DC con anticuerpos contra CD11c ratón, MHCII y Gr-1 para comprobar los DC diferenciación mediante citometría de flujo. Un ejemplo de análisis de citometría de flujo de DCs se muestra en la Figura 3A y 3B.
      1. Incubar las DC (5 x 10 5 células / muestra) con un anticuerpo monoclonal anti-ratón-CD16 / CD32 a 2,5 g / ml de concentración final en 50 l de PBS / BSA / tampón EDTA por muestra. Después, se añaden 50 l de los anticuerpos contra MHCII (IA / IE), CD11c y Gr-1 conjugado con diferentes fluorocromos a 1: 100, 1: 200 y 1: 500 en tampón de EDTA BSA PBS / /, respectivamente.
      2. Finalmente, lavar con DCs BSA tampón de EDTA PBS / / y analizar por citometría de flujo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
        Nota: Si las células están bien diferenciadas, las células están listas para el antígeno de carga.
    3. Wash DC con RPMI 10% FBS (sin antibióticos) y se incuba con 10 mg / ml otii OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) en un tubo de plástico en 1 ml de RPMI 10% FBS medio por cada 5 x 10 6 países en desarrollo para un mínimo de 1 hora a 37 ºC. Como control negativo, deje las DC sin incubación con OVAp.
  3. La infección de las DC
    1. Infectar a los países en desarrollo a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 bacterias (10 bacterias por DC) durante 1 hora en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2).
    2. Lavar las células DC 3 veces en PBS 1x y en RMPI 10% de FBS y se centrifuga a 450 xg para lavar la mayoría de las bacterias extracelulares. Finalmente, Resuspender las células en RPMI 10% FBS medio (sin antibióticos) en 20 x 10 6 células / ml.

2. Aislamiento de las células CD4 + linfocitos T de ratones transgénicos otii

Nota: La figura 1 resume este segundo paso. Los ganglios linfáticos se deben utilizar en lugar de bazo para aislar células T CD4 +, porque la proporción de CD4 + linfocitos en los ganglios linfáticoss (~ 50%) es mayor que en el bazo (~ 25%) y por lo tanto la purificación sería más eficaz.

  1. Hacer suspensión de células única de los ganglios linfáticos
    1. Eliminar inguinal, axilar, braquial, cervical y nódulos linfáticos mesentéricos de ratones transgénicos 23 otii y transferir en un plato de plástico con 10 ml de RPMI 10% FBS medio.
    2. Ganglios linfáticos Grind bajo una campana estéril utilizando dos portaobjetos esmerilado. Coloca los ganglios linfáticos en un lado esmerilado de una diapositiva de microscopio, y frote con el lado mate de la segunda diapositiva hasta órganos han sido terreno.
    3. Lavar suspensión de células individuales en tampón PBS / BSA / EDTA.
    4. Filtre las células a través de un filtro de células (70 micras) para eliminar el tejido conectivo y lavar con BSA EDTA buffer PBS / /.
    5. Resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis ACK y se incuba durante 1 min a TA con el fin de eliminar las células rojas de la sangre.
  2. Aislamiento de células T CD4 +
    1. Lave de nuevo como en el paso 2.1.3 y el recuentocélulas para resuspender en 100 x 10 6 células / ml en tampón de EDTA BSA PBS / /. Añadir anticuerpos biotinilados contra CD8, IgM, B220, CD19, MHC de clase II (I-Ab), CD11b, CD11c y DX5 a 1: 250 durante 30 min en hielo durante posterior selección negativa de las células T CD4 +.
    2. Lavar las células en tampón de EDTA BSA PBS / / e incubar las células (100 x 10 6 células / ml) con microperlas de estreptavidina a la concentración recomendada en el protocolo del fabricante durante 15 min en hielo.
    3. Lavar las células en tampón de EDTA BSA PBS / / y filtrarlas a través de un filtro de células (30 micras) antes del aislamiento de células T CD4 +.
    4. Aislar células T CD4 + por selección negativa usando una máquina de separación celular magnética de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    5. Contar las células y ajustar a 4 x 10 6 células / ml con RPMI 10% FBS medio (sin antibióticos).
    6. Fijar y mantener en hielo aislado células T CD4 + (3 x 10 5 células) para comprobar la pureza de flujocitómetro de 24 como se describe. Un ejemplo de T CD4 + de purificación de las células se muestra en la Figura 3C.

3. Células T transinfection Medición por ensayo de protección Gentamicina

Nota: La Figura 2 resume esta tercera etapa del protocolo.

  1. Transinfection células T
    1. Se incuban las células T CD4 + aisladas con células infectadas DC (1: 1) (bacterias libres los países en desarrollo fueron infectadas durante 1 hora y se lavan para eliminar) durante 30 minutos para permitir la formación de sinapsis inmunológica en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% CO 2).
    2. Añadir 0,5 ml de las células T CD4 + aisladas (2 x 10 6 células) y 0,1 ml de DCs infectadas (2 x 10 6 células) en una placa de cultivo de 24 pocillos. Como control negativo, infectar directamente 0,5 ml de las células T CD4 + a una MOI de 10 bacterias por 30 min.
    3. Incluir controles adicionales que separan las DC infectadas de las células T utilizandouna barrera transwell policarbonato (con 3 micras de tamaño de poro), impidiendo DC-T contacto físico. Añadir 0,1 ml de DCs dentro de la transwell y 0,5 ml de las células T CD4 + en el compartimiento inferior del pozo (placa de 24 pocillos).
    4. Por último, completa con medio RMPI hasta que es de 0,6 ml en cada pocillo para hacer volúmenes iguales en todas las muestras.
    5. Después de 30 minutos de la formación de sinapsis inmunológica, añadir 100 mg / ml de gentamicina y se incuba durante 1 hora antes de recoger las células en un incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2).
  2. Re-aislamiento de células T CD4 +
    1. Recoger las células no adherentes y volver a suspender en tampón PBS / BSA / EDTA. La mayor parte de los países en desarrollo de permanecer unidos a la placa de cultivo de plástico. Tubos Vortex suavemente para asegurar la desagregación celular. Mantenga 500 l de sobrenadante celular como control para demostrar que la gentamicina ha funcionado bien.
    2. Re-aislar células T CD4 + a partir de muestras que contienen DCs y las células T juntos como en el paso 2.2, Aunque la mayoría de los PED deberían haber fijado en el plato. Mantenga las muestras de control en el hielo. Tome en cuenta sólo los experimentos con la contaminación de menos de 2%. Un ejemplo de T CD4 + de purificación de células después de transinfection se muestra en la figura 3D.
  3. Lyse células T y de Semillas ellos en bacterias placas de medio de agar.
    1. Lavar las células T CD4 + dos veces con PBS.
    2. Contar las células y resuspender ellos en 2 x 10 6 células / ml en PBS.
    3. Añadir 500 l de 0,1% de Triton X-100 en 500 l de las células T para lisar ellos en 1 x 10 6 células / ml, la liberación de las bacterias intracelulares fuera de las células T.
    4. Haga 3 diluciones decimales seriadas de células lisadas y sembrar 50 l de cada dilución en bacterias placas de agar medianas. Divida placas en 4 porciones y sembrar las diferentes diluciones de células lisadas en cada parte. Los resultados representativos se muestran en la Figura 4.
      1. Como control, también la placasobrenadante de células almacenada de los conjugados en agar, para asegurar que la gentamicina ha funcionado bien. También la placa DCs infectadas como un control adicional. En caso de baja contaminación DC se produce (<2%), restar las unidades formadoras de colonias (UFC) correspondientes a la contaminación de bajo DC.

4. Cuantificación de T transinfection celular por citometría de flujo

Nota: La figura 2 resume este paso.

  1. T transinfection celular
    1. Infectar BMDCs como en el paso 1.3, pero el uso de bacterias que expresan GFP en este caso.
    2. Células T CD4 + (las manchas aisladas de los ganglios linfáticos en el paso 2.2) con un aminocumarina clorometil rastreador celular (CMAC) durante 30 min a 37 ºC de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    3. Lavar las células T CD4 + marcadas dos veces con RMPI 10% de FBS (sin antibióticos).
    4. Incubar DCs infectadas (después de 1 h de incubación con bacterias) con la etiqueta CD4 +Células T durante 30 min para permitir la formación de sinapsis inmunitaria a 37 ºC incluyendo todos los controles que explican en el paso 3.1.1.
  2. La tinción de las células infectadas T CD4 +
    1. Después de 30 minutos de DC-T la formación de sinapsis inmunológica, recoger las células y lávelas en PBS / BSA / EDTA.
    2. Después de dos lavados con tampón PBS / BSA / EDTA, las células agregados separados mediante agitación con vórtex suavemente los tubos.
    3. Fijar las muestras en 0,2 ml / tubo de PBS que contenía 3% PFA durante 15 min a RT. A continuación, lavar en PBS.
    4. Incubar con el anticuerpo monoclonal anti-ratón-CD16 / CD32 (2,5 g / ml) en 50 l / muestra de PBS / BSA / EDTA durante 15 min en hielo para bloquear los receptores Fc de las células dendríticas.
    5. Añadir un conejo anti-bacterias anticuerpo (10 mg / ml como concentración final) en 50 l / muestra de PBS / BSA / EDTA durante 30 min en hielo para teñir las bacterias extracelulares.
    6. Lavar las células con PBS / BSA / EDTA y se incuba con un anticuerpo contra CD11c ratón conjugado con ficoeritrina (PE) y un secundaria anticuerpo contra conejo conjugado con otro fluorocromo como Alexa Fluor-647 a 1: 200 en 100 l / muestra de PBS / BSA / EDTA durante 30 min en hielo.
    7. Lavar las células y analizar muestras por citometría de flujo. No te olvides de incluir una muestra de las células T transinfected utilizando bacterias no fluorescentes como control negativo y muestras etiquetadas con sólo uno de cada fluorocromo utilizado en el experimento para compensar las muestras y ajustar la configuración de citometría de flujo 25. Análisis representativo se muestra en la Figura 5.
      Nota: Si las bacterias no expresan GFP, para distinguir intracelular y bacterias extracelulares, las bacterias extracelulares de la etiqueta, fijar y permeabilizar las muestras con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 5 min. Después manchar bacterias totales (intracelulares + extracelular) con un fluorocromo diferente.

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Resultados

Aquí describimos cómo realizar transinfection bacteriana de células T murino desde la médula ósea infectada derivado de DCs y cómo medir transinfection bacteriana a través de dos enfoques diferentes: citometría de flujo y gentamicina supervivencia ensayo de la Figura 1 resume el procedimiento para obtener las células.. DC se generan mediante la incubación de células de médula ósea con GM-CSF durante 9 días. Entonces, los países en desarrollo son madurados con LPS para au...

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Discusión

Células T o linfocitos T son un tipo de leucocitos que juegan un papel central en la inmunidad mediada por células y que pertenecen a la respuesta inmune adaptativa 26. Las células T son refractarios a ser infectados in vitro pero algunos informes indican que pueden ser infectados in vivo 14,15. Los contactos íntimos de células APC y T durante la sinapsis inmune sirven como plataformas para el intercambio de material biológico 13, incluyendo algunos virus como el VIH

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por las subvenciones BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC del Ministerio de Ciencia e Innovación de España y PIES201020I046 del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMIFisher ScientificSH3025501
r-GMCSFPeprotech315-03
LPSSIGMAL2630-10mg
Na PyruvateThermo ScientificSH3023901
2-MEGibco31350-010
OVAp OTII (323– 339)GenScript
70uMBD352350
  Jeringa de 30 uM Filcons EstérilBD340598
AutoMacs ClassicMiltenyi Biotec130-088-887
GentamicinaNormon624601.6
TranswellCostar3415
LBPronadisa1231
AgarPronadisa1800
Paraformaldehído 16%Ciencias de la Microscopía Electrónica15710
Triton X-100
CD8 biotBD Biosciences553029
IgM BiotImmunoStepClon RMM-1
B220 BiotBD Biosciences553086
CD19 biotBD Biosciences553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)BD Biosciences553622
CD11b biotImmunostep11BB-01mg
CD11c biotImmunostep11CB3-01mg
DX5 biotBD Biosciences553856
CD16/CD32ImmunoStepM16PU-05MG
anti SalmonellaABD Serotec8209-4006
CD11cPEBD Biosciences553802
CD4-APCTonbo Biosciences20-0041-U100
Gr-1 APCBD Biosciences553129
MHC-II (I-A/I-E) FITCBD Biosciences553623
Alexa-Fluor 647 Anticuerpo IgG (H+L) Anti-Conejo de CabraInvitrogenaltamente adsorbidoA-21245
CMAC (7-amino-4-clorometilcumarina)Life technologiesC2110
BSASIGMAA7030-100G
Estreptavidina MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-101
BD FACSCanto IIBD Biosciences
Filtro de células Gr-1 biot BD Biosciences 553125 ,

Referencias

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